端羥基聚乙二醇化的人胰島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于胰島素技術(shù)(C07K14/62)領(lǐng)域，涉及用端羥基聚乙二醇修飾人胰島素或其類(lèi)似物而形成的偶聯(lián)物，其顯著降低了免疫原性，具有更高的用藥安全性。另外，本發(fā)明還涉及該偶聯(lián)物的制備方法和涉及預(yù)防或治療的應(yīng)用等。
【專(zhuān)利說(shuō)明】端超基聚乙二醇化的人膜島轟及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于膜島素技術(shù)（C07K14/62)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及用端輕基聚己 二醇修飾人膜島素或其類(lèi)似物而形成的偶聯(lián)物，其具有更高的用藥安全性。另外，本發(fā)明還 涉及該偶聯(lián)物的制備方法和應(yīng)用等。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病值i油etes Melli化S，DM)是一種膜腺功能病變的代謝疾病，由遺傳因素、 免疫功能奈亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等各種致病因子作用于機(jī)體， 導(dǎo)致膜島功能減退、膜島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝奈 吉L臨床上W高血糖為主要特點(diǎn)。其中，1型糖尿病屬于膜島素依賴型糖尿病，其病人必須 依賴外源性膜島素進(jìn)行替代治療；2型糖尿病屬非膜島素依賴型糖尿病，病人由于產(chǎn)生膜 島素抵抗或體內(nèi)膜島目細(xì)胞受損，引起膜島素量的相對(duì)不足，隨著病情的發(fā)展，通常最終 也需用膜島素治療。
[0003] 人膜島素（Human insulin, Ins),其由A、B兩條膚鏈組成，其中，A鏈含21個(gè)氨基 酸，其氨基酸序列為；Gly lie Val Glu Gin 切S 切S T虹 Ser lie 切S Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr切s Asn;B鏈含30個(gè)氨基酸，其氨基酸序列為；Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr化r Pro Lys化r。人膜島素中共有H對(duì)二硫鍵，其中A鏈第6位半脫氨酸（A6(切s)) 與A鏈第11位半脫氨酸（A11 (切S))形成一對(duì)二硫鍵;A鏈第7位半脫氨酸（A7 (切S))與 B鏈第7位半脫氨酸炬7 (切S))形成一對(duì)二硫鍵；A鏈第20位半脫氨酸（A20 (切S))與B鏈 第19位半脫氨酸炬19 (切S))形成一對(duì)二硫鍵，后二者使A、B兩鏈連接起來(lái)。
[0004] 目前已開(kāi)發(fā)出了許多人膜島素類(lèi)似物，其中已批準(zhǔn)臨床使用或臨床研究的主要包 括DesB30 (其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上缺失了人膜島素B鏈第30 位蘇氨酸訂虹)）、甘精膜島素（Lantus，其氨基酸序列是在人膜島素氨基序列的基礎(chǔ)上將A 鏈第21位天冬醜胺（Asn)突變成甘氨酸佑ly)，同時(shí)在人膜島素的B鏈氨基酸序列后添加 了兩個(gè)精氨酸（Arg))、口冬膜島素（Aspart，其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基 礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第28位脯氨酸突變成天冬氨酸（Asp))、谷賴膜島素佑lulisine， 其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第3位谷氨酸佑lu) 突變成賴氨酸（Lys)，同時(shí)把B鏈的第29位賴氨酸（Lys)突變谷氨酸佑lu))、賴脯膜島素 (Lispro,其氨基酸序列是在人膜島素氨基酸序列的基礎(chǔ)之上將人膜島素B鏈的第28位脯 氨酸（Pro)突變成賴氨酸（Lys),同時(shí)把B鏈的第29位賴氨酸突變成脯氨酸）W及地特膜 島素（Levemir)、德谷膜島素值egludec)等。
[0005] 聚己二醇（陽(yáng)G)修飾可W延長(zhǎng)蛋白在體內(nèi)的半衰期，通常還被認(rèn)為可W明顯降 低免疫原性，從而提高用藥安全性。聚己二醇化的膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物也有報(bào) 道，例如中國(guó)專(zhuān)利（申請(qǐng)）第 02815261、200410089050、200610118923、200710085552、 200780036662、200810011478、200810232828、200980122164、201110063821 號(hào)等所記載的。 由于單甲氧基聚己二醇（mPEG)的端部是甲氧基該樣的非反應(yīng)性基團(tuán)，只能定向地依靠另 一端的偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)（如含醋（基）、酵（基）氨基、駿基、甚至可W含輕基，等）與要修 飾的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，提高了反應(yīng)的專(zhuān)一性，所W目前聚己二醇修飾蛋白質(zhì)（尤其是是膜島素 及其類(lèi)似物）的技術(shù)中基本上都選擇使用mPEG。
[0006] 然而，越來(lái)越多的證據(jù)表明，聚己二醇本身也會(huì)引入新的免疫原性，也能誘發(fā) 機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗PEG的抗體，該樣一方面會(huì)中和掉聚己二醇修飾的藥物，降低 其療效，更嚴(yán)重的是，還會(huì)帶來(lái)潛在的用藥安全性問(wèn)題，誘發(fā)免疫變態(tài)反應(yīng)，甚至導(dǎo)致病 人死亡。例如，大量報(bào)道表明，在病人使用化gl〇ticase(聚己二醇化的重組豬尿酸氧 化酶，商品名為拉Tstexxa?)后，有70?90%的病人體內(nèi)檢測(cè)到抗PEG的抗體，尤其是 其二H期臨床試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)生的死亡病例被認(rèn)為與其免疫變態(tài)反應(yīng)有關(guān)（Cortes, J.et al. , Control of plasma uric acid in adults at risk for tumor Lysis syndrome ： efficacy and safety of rasburicase alone and rasburicase followed by allopurinol compared with allopurinol alone-results of a multicenter phase III study. J Clin 0ncol，2010. 28(27) ;p. 4207-13 ;Sundy, J.S.et al. Reduction of plasma urate levels following treatment with multiple doses of Pegloticase(polyethylene glycol-conjugated uricase)in patients with treatment-failure gout ：results of a phase II randomized study. Arthritis Rheum,2008. 58(9) :p.2882-91 ;Krystexxa Prescribing Information ：http://www. krystexxa. com/pdfs/KRYSTEXXA Prescribing- Information)。
[0007] 本發(fā)明人研究也發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有技術(shù)選用的聚己二醇修飾人膜島素及其類(lèi)似物而獲得 的偶聯(lián)物也會(huì)產(chǎn)生抗PEG的抗體，由于膜島素需要長(zhǎng)期使用，在藥品管理部口和公眾對(duì)藥 品安全性日益關(guān)注的趨勢(shì)下，其用藥安全性問(wèn)題不容低估。經(jīng)過(guò)本發(fā)明人長(zhǎng)期而艱苦的研 究，在幾乎要放棄聚己二醇修飾體系而改用其他免疫原性可能對(duì)人更低的修飾體系（如人 IgG或HSA等）的情況下，十分令人意外地發(fā)現(xiàn)了，盡管端輕基聚己二醇由于包含具有反應(yīng) 性的輕基，干擾反應(yīng)，增加副產(chǎn)物，使得現(xiàn)有技術(shù)中幾乎都不選擇使用，但是端輕基聚己二 醇化的人膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物能夠顯著降低免疫原性，大幅增加了用藥安全性。另 夕F，該偶聯(lián)物可W基本沿用原聚己二醇修飾藥品的審批流程和規(guī)范，降低了開(kāi)發(fā)藥品的成 本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供新的聚己二醇化的人膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián) 物。另外，本發(fā)明還提供了該偶聯(lián)物的制備方法和應(yīng)用等。
[0009] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了如式I所示的膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物 或其藥學(xué)上可接受的鹽，
[0010] {:出0-(邸2邸2〇) n] p-L} t-Y (式 u
[0011] 其中，
[0012] Y為膜島素或其類(lèi)似物；
[001引 L為連接基團(tuán)；
[0014] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[00巧]p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; [001引 t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0017] -為共價(jià)鍵。
[0018] 在本文中，結(jié)構(gòu)式具有生物大分子領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的意義，該不完全相同于 嚴(yán)格的化學(xué)式。其中，小括號(hào)（即"0")具有化學(xué)式意義上的含義，指的是小括號(hào)中的結(jié)構(gòu) 線性順序共價(jià)連接，重復(fù)n次。
[0019] 中括號(hào)（即"[]")指的是中括號(hào)中的結(jié)構(gòu)平行共價(jià)連接于L(或L')上的不同位 點(diǎn)，連接于L(或L')上的該結(jié)構(gòu)共有P個(gè)。當(dāng)P > 1時(shí)，即為分支型的聚己二醇；當(dāng)P = 1 時(shí)，即為直鏈型的聚己二醇。本發(fā)明優(yōu)選后者。
[0020] 大括號(hào)（即"W")值的是大括號(hào)中的結(jié)構(gòu)平行共價(jià)連接于Y上的不同位點(diǎn)，連接 于Y上的該結(jié)構(gòu)共有t個(gè)。當(dāng)t > 1時(shí)，即為多PEG修飾的膜島素或其類(lèi)似物；當(dāng)t = 1時(shí)， 即為單PEG修飾的膜島素或其類(lèi)似物。本發(fā)明優(yōu)選后者。
[0021] 在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，P為1且t為1，即單直鏈PEG修飾，相應(yīng)地，本發(fā)明 的膜島素或其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)為冊(cè)-(邸2邸2〇)。斗-￥。另外，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，式I 中的冊(cè)-(邸2邸2〇)。-1部分的分子量為20邸或40邸。
[0022] 在本文中，"藥學(xué)上可接受的鹽"指適于與人或動(dòng)物的組織接觸而且無(wú)過(guò)多的毒 性、刺激或變態(tài)反應(yīng)等的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽是本領(lǐng)域熟知的。該種鹽可W在本發(fā)明偶 聯(lián)物的最終分離和純化的過(guò)程中制備，也可W將偶聯(lián)物與適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)或無(wú)機(jī)酸或堿反應(yīng)單 獨(dú)制備。代表性酸加成鹽包括但不限于己酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、巧樣酸鹽、天冬氨酸鹽、 苯甲酸鹽、苯賴酸鹽、硫酸氨鹽、下酸鹽、棒腦酸鹽、棒腦賴酸鹽、甘油磯酸鹽、半硫酸鹽、庚 酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氨漠酸鹽、氨楓酸鹽、2-輕基己賴酸鹽、乳酸鹽、馬來(lái)酸鹽、 甲賴酸鹽、煙酸鹽、2-蔡賴酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、玻巧酸鹽、酒石酸鹽、磯酸 鹽、谷氨酸鹽、碳酸氨鹽、對(duì)甲苯賴酸鹽和十一焼酸鹽。能用于形成藥學(xué)上可接受鹽的優(yōu)選 的酸是鹽酸、氨漠酸、硫酸、磯酸、草酸、馬來(lái)酸、玻巧酸和巧樣酸。藥學(xué)上可接受的堿加成鹽 中的陽(yáng)離子包括但不限于堿金屬或堿±金屬離子如裡、軸、鐘、巧、鎮(zhèn)和鉛等，W及非毒性季 饋陽(yáng)離子如饋、四甲基饋、四己基饋、甲基胺、二甲基胺、H甲基胺、H己基胺、二己基胺、己 基胺、二己胺、己醇胺、二己醇胺、脈巧、脈嗦等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磯酸鹽、化is和己酸 鹽。本發(fā)明的偶聯(lián)物可W單獨(dú)使用，也可W W藥學(xué)上可接受的鹽形式使用。
[0023] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，膜島素是人膜島素。 人膜島素的氨基酸序列是本領(lǐng)域熟知的，其可W提取獲得，也可W人工化學(xué)合成或者DNA 重組技術(shù)表達(dá)獲得。人膜島素在I960年代就能人工合成。
[0024] 也優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，膜島素類(lèi)似物是 DesB30、甘精膜島素（LanUis)、n冬膜島素（Aspart)、地特膜島素（Levemir)、谷賴膜島素 佑lulisine)、德谷膜島素值egludec)或賴脯膜島素（Lispro)。該些膜島素類(lèi)似物已經(jīng)被 批準(zhǔn)臨床使用或臨床研究，都具備膜島素的活性和功能，甚至優(yōu)于人膜島素本身的活性和 功能。
[00巧]在本文中，連接基團(tuán)是偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)的殘基（即，殘余部分）。（偶聯(lián) 反應(yīng)前的）偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)和（偶聯(lián)反應(yīng)后的）連接基團(tuán)均是在PEG修飾蛋白質(zhì)的領(lǐng)域所 熟知的。通常，連接基團(tuán)和/或偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)較小，分子量小于300Da，優(yōu)選小于200Da。 例如，在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)是玻巧醜亞胺基丙醋基團(tuán)，相應(yīng)地，連 接基團(tuán)是玻巧醜亞胺基丙醋基團(tuán)與氨基偶聯(lián)后的殘基。
[0026] 由于本發(fā)明的偶聯(lián)物是用帶有端輕基的PEG獲得的，因此為了防止該輕基干擾偶 聯(lián)反應(yīng)，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)不含輕基。偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)應(yīng)當(dāng)能同膜島素或類(lèi)似物上的活性基 團(tuán)（如，氨基、駿基、琉基等）偶連，優(yōu)選本發(fā)明的偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)包含縮酵基、酵基、玻巧 醜亞胺基、馬來(lái)醜亞胺基、己帰諷基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇 基、帰丙基、己帰基、己快基或畳氮基。
[0027] 由于經(jīng)過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)，本發(fā)明的連接基團(tuán)不包含縮酵基、酵基、玻巧醜亞胺基、馬來(lái) 醜亞胺基、己帰諷基、楓己醜胺基、醋基、碳酸醋基、駿基、氨基、氨氧基、硫醇基、帰丙基、己 帰基、己快基或疊氮基。
[0028] 優(yōu)選在本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽中，偶聯(lián)是定點(diǎn)偶聯(lián)，該 樣可W提高偶聯(lián)物的均一性（或純度）。例如，Y的偶聯(lián)位點(diǎn)是e氨基和/或a氨基，優(yōu) 選是B鏈的e氨基和/或a氨基。其中，e氨基是指賴氨酸側(cè)鏈上的氨基，a氨基是指 膜島素鏈N端的氨基酸的游離氨基。通過(guò)本發(fā)明第二方面的方法可W實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。
[0029] 在第二方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制 備方法，其包括用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/與Y偶聯(lián)的過(guò)程，其中，
[0030] Y為膜島素或其類(lèi)似物；
[0031] L'為偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)；
[0032] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[0033] P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0034] -為共價(jià)鍵。
[00對(duì)本發(fā)明第二方面的制備方法可W獲得t個(gè)郵-畑2細(xì)20)。]。-1/與1個(gè)Y偶聯(lián)的產(chǎn) 物，其中t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1。
[0036] 如無(wú)相反或矛盾的指示，本發(fā)明一部分提及的術(shù)語(yǔ)可W參照本發(fā)明其他部分的術(shù) 語(yǔ)定義或解釋。例如，Y，即膜島素或其類(lèi)似物，可W參照本發(fā)明第一方面的Y及其優(yōu)選的技 術(shù)特征。又如，L'，即偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)，是在PEG修飾蛋白質(zhì)的領(lǐng)域所熟知的，可W參考大量 涉及聚己二醇化的蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物的文獻(xiàn)，例如，【背景技術(shù)】部分列舉的大量涉及聚己二醇 化的膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物的文獻(xiàn)。
[0037] 優(yōu)選本發(fā)明第二方面的制備方法包括
[00測(cè) （1)在適合與￡氨基和/或a氨基偶聯(lián)的條件下，用郵-畑2邸20)。]。-1/(優(yōu)選 是冊(cè)-畑2邸2〇)片'）與Y偶聯(lián)；
[0039] (2)純化（優(yōu)選通過(guò)層析純化，如通過(guò)凝膠過(guò)濾層析和/或離子交換層析純化）獲 得如式I所示的膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽。
[0040] 優(yōu)選其中，在適合與a氨基偶聯(lián)的條件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊(cè)-畑2邸2〇)n-L')與Y偶聯(lián)是在抑5. 0?8. 0的溶液中郵-畑2邸2〇) Jp-L'(優(yōu)選是 冊(cè)-(邸2邸2〇)。-1/ )與Y W 1?4 : 1?4的摩爾比在4?37°C下混合反應(yīng)。
[0041] 也優(yōu)選其中，在適合與e氨基偶聯(lián)的條件下用出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊(cè)-畑2邸2〇)片'）與Y偶聯(lián)是在抑8. 0?11. 5的溶液中郵-畑2邸2〇) Jp-L'（優(yōu)選是 冊(cè)-(邸2邸2〇)。-1/ )與Y W 1?4 : 1?4的摩爾比在4?37°C下混合反應(yīng)。
[0042] 反應(yīng)可W通過(guò)加入酸酸化（優(yōu)選酸化至抑2. 5?3. 5)終止反應(yīng)，然后可W直接進(jìn) 行純化。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，純化是依次通過(guò)陽(yáng)離子層析和陰離子交換層析進(jìn)行 純化。
[0043] 在第H方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥 學(xué)上可接受的鹽，W及藥學(xué)上可接受的載體。
[0044] 在本文中，"藥學(xué)上可接受的載體"指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、佐 齊U、包裹材料或其他制劑輔料。根據(jù)本領(lǐng)域的公知技術(shù)，可W根據(jù)治療目的、給藥途徑的需 要將藥物組合物制成各種劑型，優(yōu)選該組合物為單位劑量形式，如片劑、膜劑、丸劑、膠囊 (包括持續(xù)釋放或延遲釋釋設(shè)形式）、粉劑、顆粒劑、町劑、糖漿劑和乳液劑、注射劑或息浮 液、氣霧劑或液體噴劑、滴劑、針劑或粉針劑、自動(dòng)注射裝置或栓劑。在本發(fā)明的具體實(shí)施方 式中，W注射劑形式注射給藥，所W本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽可W 與注射用的無(wú)毒的藥物學(xué)上可接受的惰性載體組合在一起，如等滲葡萄糖溶液、甘油、生理 鹽水或其組合。該藥物組合物中還可W添加蛋白質(zhì)保護(hù)劑等輔料，如人血清白蛋白化SA)、 低分子量膚、氨基酸和/或金屬陽(yáng)離子等。
[0045] 本發(fā)明第H方面的藥物組合物可用于治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的 疾病，優(yōu)選用于長(zhǎng)期治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的疾病，如，糖尿病，特別是1 型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0046] 在第四方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制 備低免疫原性的藥物中的應(yīng)用。
[0047] 本發(fā)明的藥物或藥物組合物可通過(guò)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的給藥方式來(lái)進(jìn)行 給藥，例如胃腸道外、口服、直腸、舌下、肺部、透皮、離子透入、陰道及鼻內(nèi)給藥，優(yōu)選胃腸道 外給藥，如皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射。給藥劑量根據(jù)制劑形式和期望的作用時(shí)間W及治療對(duì) 象的情況而有所變化，實(shí)際治療所需的量可W由醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況（如，病人的病情、體重 等）而方便地確定。由于本發(fā)明的偶聯(lián)物的優(yōu)異的藥代學(xué)和藥效學(xué)性質(zhì)，因此相對(duì)于膜島 素或其類(lèi)似物，其給藥量大幅降低，給藥頻次也大幅降低。
[0048] 在本發(fā)明第四方面的應(yīng)用中，所述藥物用于治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或 預(yù)防的疾病，優(yōu)選用于長(zhǎng)期治療和/或預(yù)防膜島素能治療和/或預(yù)防的疾病，如，糖尿病，特 別是1型糖尿病和/或2型糖尿病。
[0049] 在第五方面，本發(fā)明提供了端輕基聚己二醇或出〇-(邸2邸2〇)。]。-1/ (優(yōu)選是 冊(cè)-(C&C&O)。-!/)在制備低免疫原性的膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物中的應(yīng)用。其中，L'為 偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)；n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910 的整數(shù)；P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 為 共價(jià)鍵。優(yōu)選其中，膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物是本發(fā)明第一方面的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可 接受的鹽。
[0050] 本發(fā)明的偶聯(lián)物免疫原性低，該體現(xiàn)在兩個(gè)方面，首先是該偶聯(lián)物顯著降低了聚 己二醇本身帶來(lái)的免疫原性，甚至降低至長(zhǎng)期（40天左右）使用無(wú)法檢測(cè)出的水平；其次是 該偶聯(lián)物也進(jìn)一步降低到了膜島素或其類(lèi)似物本身的免疫原性。該樣的低免疫原性對(duì)于藥 用安全性（尤其是長(zhǎng)期藥用的安全性）是特別有益的。
[0051] 在本文中，為了清楚起見(jiàn)，低免疫原性可W被定義為相對(duì)于本發(fā)明第一方面的偶 聯(lián)物中端輕基被替換為甲氧基后形成的偶聯(lián)物的免疫原性降低，即，低免疫原性是相對(duì)于 式II所示的膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的免疫原性降低：
[0052] {[邸30-(邸2邸20) Jp-U t-Y (式 II)
[005引 其中，
[0054] Y為膜島素或其類(lèi)似物；
[005引 L為連接基團(tuán)；
[0056] n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)；
[0057] P為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ;
[0058] t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; [00則-為共價(jià)鍵。
[0060] 本發(fā)明取得的有益甚至是預(yù)料不到的效果在于，采用端輕基聚己二醇修飾人膜島 素或其類(lèi)似物而獲得端輕基聚己二醇化人膜島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物，在保持了藥代學(xué)和 藥效學(xué)的優(yōu)異性質(zhì)的基礎(chǔ)上，該偶聯(lián)物顯著降低了聚己二醇本身帶來(lái)的免疫原性，甚至降 低至長(zhǎng)期（40天左右）使用無(wú)法檢測(cè)出的水平，也進(jìn)一步降低到了膜島素或其類(lèi)似物本身 的免疫原性，提高了藥物長(zhǎng)期使用的安全性。
[0061] 為了便于理解，W下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指 出的是，該些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說(shuō)明書(shū)的論 述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見(jiàn)的。另外，本發(fā)明引用 了公開(kāi)文獻(xiàn)，該些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考， 就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過(guò)一樣。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說(shuō)明。如未特別指明之處，可參考 本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《有機(jī)合成》、《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》、《免疫檢測(cè) 技術(shù)》等書(shū)籍和SFDA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)規(guī)范和指引W及所用的試劑和設(shè)備的使用說(shuō)明。其中，女口 未特別指明，所用的試劑和設(shè)備均可通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)。
[006引實(shí)施例1定點(diǎn)偶聯(lián)在e氨基上的冊(cè)-PEG化的膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物的制備
[0064] 本實(shí)施例主要示例性地描述了用分子量為20KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊(cè)-PEG-SPA-20K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類(lèi)似物值esB30)的B鏈 賴氨酸的e氨基的制備過(guò)程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊(cè)-PEG-20K-DesB30)，其中冊(cè)-PEG定 點(diǎn)偶聯(lián)在B鏈賴氨酸的e氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的測(cè)酸緩沖液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入6g冊(cè)-PEG-SPA-20K，在300巧m的條件下室溫（25°C )反應(yīng)60min。 然后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3. 0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩 沖液巧OmM己酸軸緩沖液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個(gè) 柱體積的該平衡緩沖液流過(guò)該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫 下來(lái)的經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單陽(yáng)G修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為 60% (V/V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過(guò)至流過(guò)液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用 洗脫液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線 性洗脫，收集洗脫下來(lái)的最大的峰，即為冊(cè)-PEG-20K-DesB30。經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)，其純度大于 95%;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點(diǎn)在B鏈賴氨酸的e氨基上。
[0065] 基本參照W上制備過(guò)程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類(lèi)似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分別獲得冊(cè)-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其 類(lèi)似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物冊(cè)-PEG-20K-Ins、冊(cè)-PEG-20K-AP、冊(cè)-PEG-20K-LP和 冊(cè)-PEG-20K-GL。
[0066] 另外，用mPEG替代上述的冊(cè)-PEG進(jìn)行修飾，分別獲得mPEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素 或其類(lèi)似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物mPEG-20K-DesB30、mPEG-20K-Ins、mPEG-20K-AP、 mPEG-20K-LP 和 mPEG-20K-GL。
[0067] 實(shí)施例2定點(diǎn)偶聯(lián)在a氨基上的冊(cè)-PEG化的膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物的制備
[0068] 本實(shí)施例主要示例性地描述了用分子量為20KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊(cè)-PEG-SPA-20K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類(lèi)似物值esB30)的B鏈 N末端a氨基的制備過(guò)程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊(cè)-PEG-20K-DesB30-Bl)，其中冊(cè)-PEG定 點(diǎn)偶聯(lián)在B鏈N末端a氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的磯酸緩沖液（pH7. 5) 配制成500ml溶液，加入6g冊(cè)-PEG-SPA-20K，在300巧m的條件下室溫（25°C )60min。然 后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3. 0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩沖 液巧OmM己酸軸緩沖液，P冊(cè).5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個(gè)柱體 積的該平衡緩沖液流過(guò)該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫下來(lái)的 經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單PEG修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為60% (V/ V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，P服.0)平衡好的SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過(guò)至流過(guò)液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用洗脫液 (60% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M NaCl，抑8. 0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線性洗 脫，收集洗脫下來(lái)的最大的峰，即為冊(cè)-PEG-20K-DesB30-Bl。經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)，其純度大于 95% ;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點(diǎn)在B鏈N末端a氨基上。
[0069] 基本參照W上制備過(guò)程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類(lèi)似物；Ins、Aspart、Lispro和Glul iSine，分別獲得冊(cè)-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其類(lèi)似 物的B鏈賴氨酸 e 氨基的產(chǎn)物冊(cè)-PEG-20K-Ins-Bl、冊(cè)-PEG-20K-AP-B1、冊(cè)-PEG-20K-LP-B1 和冊(cè)-PEG-20K-化-B1。
[0070] 實(shí)施例340邸的冊(cè)-PEG化的膜島素及其類(lèi)似物的偶聯(lián)物的制備
[0071] 本實(shí)施例主要示例性地描述了用分子量為40KD的端輕基聚己二醇玻巧醜亞胺基 丙醋（冊(cè)-PEG-SPA-40K)修飾去人膜島素B鏈30位蘇氨酸人膜島素類(lèi)似物值esB30)的B鏈 賴氨酸的e氨基的制備過(guò)程，用W獲得相應(yīng)偶聯(lián)物（冊(cè)-PEG-40K-DesB30)，其中冊(cè)-PEG定 點(diǎn)偶聯(lián)在B鏈賴氨酸的e氨基上。具體而言，取Ig DesB30,用20mM的測(cè)酸緩沖液（pHlO. 5) 配制成500ml溶液，加入12g冊(cè)-PEG-SPA-40K，在300巧m的條件下室溫（25°C)反應(yīng)60min。 然后，加入2M鹽酸至達(dá)到抑3.0 W終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后，將反應(yīng)液直接上樣于用平衡緩 沖液巧OmM己酸軸緩沖液，抑3. 5)平衡好的SP Se地arose FF柱。上樣完畢后，先用6個(gè) 柱體積的該平衡緩沖液流過(guò)該柱，然后用50mM Tris-HCl緩沖液（P服.0)洗脫，收集洗脫 下來(lái)的經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量為單陽(yáng)G修飾的峰。向該洗脫峰加入己醇至己醇終濃度為 60% (V/V)，然后上樣于用平衡緩沖液（60% (V/V)己醇，20mM Tris-HCl，p服.0)平衡好的 SOURCE 15Q柱，上樣完畢后，先用該平衡緩沖液流過(guò)至流過(guò)液的紫外吸收基線穩(wěn)定，然后用 洗脫液化0% (V/V)己醇，20mM Tris-肥1，0?0. 3M化Cl，p服.0) W化C1梯度濃度進(jìn)行線 性洗脫，收集洗脫下來(lái)的最大的峰，即為冊(cè)-PEG-40K-DesB30。經(jīng)RP-HPLC檢測(cè)，其純度大于 95%;經(jīng)膚圖分析，其偶聯(lián)位點(diǎn)在B鏈賴氨酸的e氨基上。
[0072] 基本參照W上制備過(guò)程，所不同的只是DesB30分別被替換為W下人膜島素或其 類(lèi)似物；Ins、Aspart、Lispro和Glulisine，分別獲得冊(cè)-PEG偶聯(lián)在相應(yīng)人膜島素或其 類(lèi)似物的B鏈賴氨酸e氨基的產(chǎn)物冊(cè)-PEG-40K-Ins、冊(cè)-PEG-40K-AP、冊(cè)-PEG-40K-LP和 冊(cè)-PEG-40K-GL。
[0073] 實(shí)施例4膜島素及其類(lèi)似物在冊(cè)-PEG修飾前后的藥代動(dòng)力學(xué)研究
[0074] 72只健康比格炬eagle)犬，隨機(jī)分成12組，每組6只，雌雄各半，共12組。每 組比格犬頸部或背皮下按0. 5IU/kg的劑量分別單次給藥上述實(shí)施例制備或作為原料的 Aspart、H0-PEG-20K-AP、冊(cè)-PEG-40K-AP ;Lispro、冊(cè)-PEG-20K-LP、H0-PEG-40K-LP ;Ins、 冊(cè)-PEG-20K-Ins、冊(cè)-PEG-40K-Ins ;DesB30、冊(cè)-PEG-20K-DesB30 和冊(cè)-PEG-40K-DesB30。給 藥前及給藥后不同時(shí)段，分別對(duì)Beagle犬肘靜脈采血，離也，取血清檢測(cè)血液濃度。采用放 免法巧IA)測(cè)定不同時(shí)間的血液中膜島素或其類(lèi)似物的濃度，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DAS 3. 2. 4藥 動(dòng)程序擬合分析并計(jì)算藥代參數(shù)，結(jié)果如表1所示。
[00巧]表1膜島素及其類(lèi)似物在冊(cè)-PEG修飾前后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0076]

【權(quán)利要求】
1. 如式I所示的胰島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽， {[H0-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 I) 其中， Y為胰島素或其類(lèi)似物； L為連接基團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價(jià)鍵。
2. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，胰島素是人胰島素；和 /或，胰島素類(lèi)似物是DesB30、甘精胰島素（Lantus)、門(mén)冬胰島素（Aspart)、地特胰島素 (Levemir)、谷賴胰島素（Glulisine)、德谷胰島素（Degludec)或賴脯胰島素（Lispro)。
3. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，連接基團(tuán)是偶聯(lián)反應(yīng)官能 團(tuán)經(jīng)偶聯(lián)反應(yīng)的殘基，其分子量小于300Da，優(yōu)選小于200Da。
4. 權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)包含縮醛 基、醛基、琥珀酰亞胺基、馬來(lái)酰亞胺基、乙烯砜基、碘乙酰胺基、酯基、碳酸酯基、羧基、氨 基、氣氧基、硫醇基、稀丙基、乙稀基、乙塊基或置氣基。
5. 權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中，Y的偶聯(lián)位點(diǎn)是e氨基和 /或a氨基，優(yōu)選是B鏈的e氨基和/或a氨基。
6. 權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的制備方法，其包括用 [H0-(CH2CH20)n]p-L'與Y偶聯(lián)的過(guò)程，其中， Y為胰島素或其類(lèi)似物； L'為偶聯(lián)反應(yīng)官能團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價(jià)鍵。
7. 藥物組合物，其包括權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以 及藥學(xué)上可接受的載體。
8. 權(quán)利要求1?5之任一所述的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備低免疫原性的藥 物中的應(yīng)用，所述藥物用于治療和/或預(yù)防（尤其是長(zhǎng)期治療和/或預(yù)防）胰島素能治療 和/或預(yù)防的疾?。ㄈ?，糖尿病，特別是1型糖尿病和/或2型糖尿?。?。
9. [H0-(CH2CH20)n] p-L'在制備低免疫原性的胰島素或其類(lèi)似物的偶聯(lián)物中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求8或9所述的應(yīng)用，其中低免疫原性是相對(duì)于式II所示的胰島素或其類(lèi) 似物的偶聯(lián)物或其藥學(xué)上可接受的鹽的免疫原性降低： {[CH30-(CH2CH20)n]p-L} t-Y (式 11) 其中， Y為胰島素或其類(lèi)似物； L為連接基團(tuán)； n為50?1850的整數(shù)，優(yōu)選為220?1370的整數(shù)，更優(yōu)選為450?910的整數(shù)； p為1?5的整數(shù)，優(yōu)選為1?3的整數(shù)，更優(yōu)選為1?2的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; t為1?12的整數(shù)，優(yōu)選為1?5的整數(shù)，更優(yōu)選為1?3的整數(shù)，最優(yōu)選為1 ; -為共價(jià)鍵。
【文檔編號(hào)】C07K1/10GK104447981SQ201410817586
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】陳勇, 羅華, 李紅亮, 李祥, 蔣利敏 申請(qǐng)人:重慶浦諾維生物科技有限公司