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文檔序號:3521316閱讀:346來源:國知局
專利名稱:酰化的胰島素類似物的制作方法
技術領域
本發(fā)明涉及糖尿病領域。更具體地說,本發(fā)明涉及作用時間延長的?;葝u素類似物。
現(xiàn)有的胰島素替代療法已經能夠預防糖尿病急性并發(fā)癥的死亡和發(fā)病。然而,由于持續(xù)性代謝紊亂(主要是因較差的血糖控制而引起的),慢性糖尿病并發(fā)癥仍是主要的健康問題。因糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(DCCT)而帶來的結果表明,Hb Alc降低1%相應地視網膜病的發(fā)病率改善35%以上。
為了達到正常糖血,必須設計治療方法以便盡可能地使之類似于正常個體的內源胰島素分泌模式。胰島素每天的生理需求是波動的,而且可以分成兩期(a)吸收期,需要脈沖量的胰島素以處置與飲食有關的血糖升高,和(b)吸收后期,需要維持量的胰島素以調節(jié)肝葡萄糖的輸出,用于維持最佳的禁食時的血糖。
因此,有效的治療方法涉及兩種外源胰島素的組合使用飲食時間使用的速效胰島素和長效基礎胰島素。
為了獲得長效的基本時間作用(time action),目前,在有利于不溶的晶態(tài),六聚體結構形成的條件下,配制胰島素。這些長效制劑是Ultralente,Lente,和半-Lente。但是已經表明,現(xiàn)有長效制品的不溶性會引起劑量反應不一致以及在所述時間作用方面不可預測性的問題。另外,目前可得到的一種長效胰島素制品即牛Ultralente是致免疫的。因牛Ultralente的免疫原性而產生的抗體會改變速效胰島素的藥物動力學。
盡管不可溶Ultralente制劑的所述時間作用可以得到方便的一天一次的基礎胰島素,但是許多醫(yī)生實際上更喜歡使用中等時間作用的胰島素,胰島素-精蛋白制劑通常稱為胰島素-NPH。胰島素-NPH作為基礎胰島素,一天用兩次,因為用較短時間作用的藥物調整最佳劑量相對更容易。結果,中等作用胰島素占美國的70%,日本的64%,歐洲的45%,占全球胰島素市場的55%。
但是,不可溶胰島素-NPH和不可溶Ultralente胰島素均是懸浮制劑。因此,該制劑本身比可溶制劑更難預測,導致對血糖控制較不穩(wěn)定,從而更易產生危及生命的低血糖癥狀。因此仍需要可溶的長效基礎胰島素以得到成功的強胰島素替代療法。本發(fā)明提供了?;葝u素類似物,可對其進行配制以提供可溶的基礎胰島素療法。
Muranishi和Kiso(日本專利申請1-254699)公開了豬,?;蛉艘葝u素的酰化。具體公開了下列化合物B29-Nε-棕櫚酰胰島素(ε-氨基被?;?,B1-Nα-棕櫚酰胰島素(B鏈N末端的α-氨基被?;?,B1,B29-Nα,Nε-二棕櫚酰胰島素(ε-氨基和N-末端的α-氨基均被?;?。Muranishi和Kiso公開了?;葝u素具有與胰島素相似的生物學性能;但未能提供劑量,施用途徑或其它能使本領域專業(yè)人員可以評估?;葝u素活性或作用的時間的體內模型的條件。
相似地,Hashimoto等人在藥理學研究(Pharmaceutical Resarch)6171-176(1989)中公開了B1-Nα-棕櫚酰胰島素(N末端的α-氨基被?;?,和B1,B29-Nα,Nε-二棕櫚酰胰島素(ε-氨基和N-末端的α-氨基均被?;?。Hashimoto等人研究了25U/mL,一種超高劑量的B1-Nα-棕櫚酰胰島素和B1,B29-Nα,Nε-二棕櫚酰胰島素在雄性大鼠中的降血糖作用。在這些劑量時,圖5說明在靜脈內施用時,活性很低。但肌肉內施用時,圖6中表明,B1-Nα-棕櫚酰胰島素只有很短的降血糖作用,而B1,B29-Nα,Nε-二棕櫚酰胰島素有可忽略的作用。
除Muranishi和Kiso以及Hashimoto等人進行的體內報道外,Walder等人在PCT申請WO92/01476中公開了通過將蛋白質與非極性基團,特別是與脂肪酸衍生物化學相連可以延長蛋白質和肽的體內半衰期。脂肪酸在蛋白質和白蛋白之間提供橋基團。Walder等人繼續(xù)公開了非極性基團優(yōu)選被限于蛋白質的特有一個或多個位點,并以血紅蛋白Cys殘基的結合作了舉例說明。參考文獻通常公開了胰島素的脂肪酸衍生物。但是,并未具體公開或舉例胰島素的脂肪酸衍生物,而且沒有任何資料公開說明保持了胰島素脂肪酸衍生物的生物學活性。
已經發(fā)現(xiàn),單體胰島素類似物的游離氨基的選擇性?;商峁┯行У幕A胰島素活性。對本文描述的非?;葝u素類似物進行了設計以便使作用迅速開始并迅速清除。這些類似物作為單體胰島素類似物是本領域已知的。修飾所述類似物以提供基礎活性的能力是很難預料的。
本發(fā)明提供單-?;葝u素類似物,使用后,其作用時間延長??梢詫⑺鲱愃莆镏苽涑煽扇苄灾苿@種制劑因此優(yōu)于目前基礎胰島素療法。本發(fā)明類似物在劑量反應方面還具有極好的可預測性,在時間作用方面有極好的可預測性,在時間作用模式中沒有特異峰,而且非常適用于制備含胰島素類似物和酰化胰島素類似物的混合物制劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了分子式如下的單-?;葝u素類似物或其可藥用鹽SEQ ID NO1Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20與SEQ ID NO2適當交聯(lián)Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr20 25 30其中當SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO1(胰島素A鏈)位置1的Xaa是Gly;或?;疓ly;當SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO2(胰島素B-鏈)位置1的Xaa是Phe;或酰化Phe。
當SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Pro時,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,Ala;或?;疞ys;和當SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe時,SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys,Pro;或?;疞ys。
本發(fā)明還提供了通過給需要所述治療的患者施用一種藥物組合物而治療高血糖的方法,所述藥物組合物含有有效量的本發(fā)明?;葝u素類似物和一種或多種可藥用賦形劑。
還公開并要求了非經胃腸給藥的制劑,其含有本發(fā)明的?;葝u素類似物和一種或多種可藥用防腐劑,等滲劑或緩沖劑。
本說明書中所用的所有氨基酸縮寫均是美國專利和商標局所接受的列于37 C.F.R.§1.822(B)(2)中的那些。
術語“交聯(lián)”指在Cys殘基之間形成二硫鍵。適當交聯(lián)的人胰島素或胰島素類似物含有三個二硫鍵。在A鏈的位置6和11的Cys殘基之間形成第一個二硫鍵。在A鏈的第7位Cys和B鏈的第7位Cys之間形成第二個二硫鍵。在A鏈的第20位Cys和B鏈第19位的Cys之間形成第三個二硫鍵。
術語“?;疓ly”“?;疨he”和“?;疞ys”指用C6-C21脂肪酸酰化的Gly,Phe或Lys。術語“?;鶊F”指于胰島素類似物的α-氨基或ε-氨基化學鍵合的脂肪酸。在A1和B1位置的游離氨基是α-氨基。在B28或B29位置的Lys的游離氨基是ε-氨基。
術語“酰化”指引入與蛋白質的一個游離氨基共價結合的一個?;鶊F。術語“選擇性?;敝甫?氨基優(yōu)于α-氨基?;?br> 術語“脂肪酸”指飽和的或不飽和的C6-C21脂肪酸。優(yōu)選的脂肪酸是飽和的,包括肉豆蔻酸(C14),十五酸(C15),棕櫚酸(C16),十七酸(C17)和硬脂酸(C18)。更優(yōu)選的是,脂肪酸是棕櫚酸。本發(fā)明的化合物表示單-?;葝u素類似物。用C6-C21脂肪酸在α-氨基或ε-氨基上?;葝u素類似物。優(yōu)選,在賴氨酸的ε-氨基上單?;鲱愃莆?。
術語“活化的脂肪酸酯”指已經用在酶學方法(Methods ofEnzymology)25,494-499(1972)和Lapidot等人在脂研究雜志(J.of Lipid Res.)8142-145(1967)中描述的常規(guī)技術活化的脂肪酸。活化的脂肪酸酯包括常用的?;瘎┭苌铮鏗ydroxybenzotriazide(HOBT),N-羥基琥珀酰亞胺和其衍生物。優(yōu)選的活化酯是N-琥珀酰亞胺基棕櫚酸酯。
術語“可溶”指足夠量的酯存在于液相中以?;葝u素類似物。優(yōu)選,每摩爾類似物有1到2摩爾當量的?;ピ谝合嘀小?br> 本文所用的術語“單體胰島素類似物”或“胰島素類似物”是不太易于二聚或自締合的速效胰島素類似物。單體胰島素類似物是人胰島素,其中用Asp,Lys,Leu,Val或Ala取代B28位的Pro,而且B29位的Lys是Lys或Pro。Chance等人在美國專利申請07/388201(EPO申請?zhí)?83472)和Brange等人在EPO申請214826中描述了單體胰島素類似物。本領域普通技術人員應認識到對單體胰島素類似物的其它修飾也是可能的,而且為本領域所廣泛接受。這些修飾包括用天冬氨酸取代B10位的組氨酸殘基,用天冬氨酸取代B1位的苯丙氨酸殘基;用丙氨酸取代B30位的蘇氨酸殘基;用天冬氨酸取代B9位的絲氨酸殘基;僅缺失B1位的氨基酸或同時缺失B2位的氨基酸;從B30位缺失蘇氨酸。
本文所用的術語“堿性條件”指反應的堿性。為了在ε-氨基上選擇性地?;葝u素類似物,必須在基本上所有的游離氨基去質子化的條件下進行反應。在水溶劑或共溶劑中,堿性條件指在大于9.0的pH進行反應。在有機溶劑中,在堿存在下進行反應,保持其堿性相當于在水中大于或等于10.75的pKa值。
SEQ ID NO1指序列表中的第一個序列,是指序列如下的人胰島素A鏈的類似物Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20其中當SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO1(胰島素A鏈)位置1的Xaa是Gly;或?;疓ly;SEQ ID NO2指序列表中的第二個序列,是指有如下序列的人胰島素B鏈的類似物Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr20 25 30其中當SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO2(胰島素B-鏈)位置1的Xaa是Phe;或?;疨he;當SEQ ID NO1(胰島素A鏈)位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2(胰島素B鏈)位置1的Xaa是Phe,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Pro時,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,Ala;或?;疞ys;和當SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,SEQ ID NO1(胰島素A-鏈)位置1的Xaa是Gly,SEQ IDNO2(胰島素B-鏈)位置1的Xaa是Phe時,SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys,Pro;或酰化Lys。
如上所述,本發(fā)明提供分子式如下的單?;葝u素類似物與SEQ IDNO2適當交聯(lián)的SEQ ID NO1,或其可藥用鹽。在SEQ ID NO1(胰島素A鏈)位置1的優(yōu)選氨基酸殘基是Gly。苯丙氨酸是SEQ IDNO2(胰島素B鏈)1位的優(yōu)選氨基酸。當SEQ ID NO2位置29的氨基酸殘基是Pro時,SEQ ID NO2位置28的優(yōu)選氨基酸殘基是Asp;或?;疞ys。當SEQ ID NO2位置28的氨基酸殘基是?;疞ys時,SEQ ID NO2位置29的優(yōu)選氨基酸殘基是Lys;或Pro。在本領域普通技術人員已知的標準生物化學術語中,優(yōu)選的類似物是單-?;疞ysB28ProB29-人胰島素。最優(yōu)選的?;葝u素類似物是用C8-C18脂肪酸,優(yōu)選C14-C16脂肪酸單?;囊葝u素類似物。因此優(yōu)選的脂肪酸包括辛?;?C8),壬?;?C9),癸酰基(C10),十一烷酰基(C11),月桂?;?C12),十三烷酰基(C13),肉豆蔻?;?C14),十五烷?;?C15),棕櫚?;?C16)。因此本發(fā)明優(yōu)選的化合物包括B29-Nε-AspB28-棕櫚酰人胰島素(B28是Asp;B29是酰化Lys),B28-Nε-棕櫚?;?LysB28ProB29-人胰島素(B28是?;疞ys;B29是Pro),B28-Nε-辛酰基-LysB28ProB29-人胰島素,B28-Nε-癸?;?LysB28ProB29-人胰島素,B28-Nε-肉豆蔻?;?LysB28ProB29-人胰島素,和B28-Nε-十一烷?;?LysB28ProB29-人胰島素。
蛋白質(包括胰島素)的游離氨基的?;潜绢I域已知的。在酶學方法(Methods of Enzymology),25494-499(1972)中列出了常用的酰化方法,包括使用活化的酯,酰鹵化物,或酸酐。使用脂肪酸的活化酯,特別是N-羥基琥珀酰亞胺酯是用脂肪酸?;坞x氨基的特別有效的方法。Lapidot等人,脂研究雜志,8142-145(1967)。Lapidot等人描述了N-羥基琥珀酰亞胺酯的制備及其在制備N-月桂酰-甘油,N-月桂酰-L-絲氨酸和N-月桂酰-L-谷氨酸中的應用。
為了選擇性地?;?氨基,在偶聯(lián)過程中,可以用各種保護基團保護α-氨基。適宜保護基團的選擇是本領域專業(yè)人員熟知的,其包括對甲氧基苯甲酰氧羰基(pmZ)。優(yōu)選在一個合成步驟中?;?氨基而不使用氨基保護基。通過在極性溶劑中于堿性條件下,將活化脂肪酸酯與蛋白質的ε-氨基反應而完成?;?。反應的堿性必須足以使胰島素類似物的所有游離氨基去質子化。在弱堿性條件下,不能將所有游離氨基去質子化,并優(yōu)先酰化N-末端或α-氨基。在含水溶劑或共溶劑中,堿性條件指反應在大于9.0的pH下完成。由于蛋白質在pH12.0以上降解,所以反應混合物的pH優(yōu)選是10.0-11.5,且最佳為10.5。在混合有機和含水溶劑中反應混合物的反應pH是在混合前測量的含水溶劑的pH。
在非含水溶劑中,在堿存在下進行ε-氨基的選擇性酰化,保持其堿性相當于在水中大于或等于10.75的pKa值,以便足以使ε-氨基去質子化。即,堿必須至少與三乙胺一樣強。優(yōu)選堿是四甲基胍,二異丙基乙胺或四丁基氫氧化銨。使用弱堿會酰化α-氨基。
溶劑的選擇并不重要,而且很大程度上依賴于胰島素類似物和脂肪酸酯的溶解度。溶劑可以全部是有機的。普通可接受的有機溶劑包括DMSO,DMF等。水溶劑和水與有機溶劑的混合物也是可行的。極性溶劑的選擇僅限于實際的溶解度。優(yōu)選溶劑是DMSO;DMF;乙腈和水;丙酮和水;乙醇和水;異丙醇和水;異丙醇,乙醇,和水;以及乙醇,丙醇和水。優(yōu)選溶劑是乙腈和水。最佳為50%的乙腈。本領域普通技術人員應認識到其它極性溶劑也是可行的。
一般地,優(yōu)選活化的脂肪酸酯是摩爾過量的。優(yōu)選用1-4摩爾當量,最佳為1-2摩爾當量的酯進行反應。本領域普通技術人員應認識到將會大量地產生很高水平的活化酯,雙-或三-酰化產物。
反應溫度不重要。在20-40℃之間進行反應,而且通常是在15分鐘-24小時內完成。
?;螅脴藴史椒?,如反相或疏水層析純化產物。此后,用標準方法如冷凍干燥或結晶來回收產物。
可以用各種現(xiàn)有的肽合成技術,包括傳統(tǒng)(溶液)法,固相法,半合成法以及最新的重組DNA法制備本發(fā)明的單體胰島素類似物。例如Chance等人(美國專利07/388210,EPO公開383472)以及Brange等人(EPO21482)公開了各種胰島素類似物的制備,在此將上述文獻引入本文作為參考。也可以使用重組DNA技術,經類似于胰島素原的前體分子制備本發(fā)明胰島素類似物的A鏈和B鏈。參見Frank等人,肽合成-結構-功能(PeptidesSysthesis-Structure-Function),Proc.Seventh Am.Pept.Symp.Eds.D,.Rich和E.Gross(1981)(該文獻引入本文作為參考)。
下列實施例僅為了進一步說明本發(fā)明。本發(fā)明的范圍不應僅由下列實施例來說明。實施例1在乙腈和水中用N-琥珀酰亞胺基棕櫚酸酯?;疞ysB28ProB29-人胰島素在pH2.5下將LysB28ProB29-人胰島素晶體(2.22g)溶解在100ml50mM的硼酸溶液中。用10%HCl將溶液的pH調到2.5,攪拌溶液直到肉眼觀察到晶體全部溶解。通過將270mg的固體活化酯加到27mL預加熱到約50℃的乙腈中,然后劇烈攪拌直到肉眼觀察到所有活化酯顆粒均溶解在溶液中,制備活化酯(N-琥珀酰亞胺基棕櫚酸酯)溶液。通過加入10%NaOH將溶液的pH調到約10.22,然后將溶液在4℃攪拌15分鐘。將乙腈(73ml)加到調整了pH的溶液中,然后預制備活化酯溶液。使反應在4℃進行85分鐘,然后通過加入1N乙酸(600mL)猝冷,得到2.35的pH。反應產率以在猝冷反應中B28-Nε-棕櫚?;鵏ysB28ProB29-人胰島素的量除以起始的LysB28ProB29-人胰島素量計算,結果為72.5%。實施例2C8(B28)LysB28ProB29-人胰島素在pH2.5下將Lys(B28),Pro(B29)-人胰島素(KPB)晶體(2.0g)溶解在200ml 50mM的硼酸緩沖溶液中。用10%HCl將溶液的pH調到2.5,攪拌溶液直到肉眼觀察到晶體全部溶解。通過將175mg的固體活化酯加到25.62mL的乙腈中,然后劇烈攪拌直到肉眼觀察到所有活化酯顆粒均溶解在溶液中,制備活化酯(1-辛?;?N-羥基琥珀酰亞胺酯)溶液。通過加入10%NaOH將KPB溶液的pH調到約10.4,然后將溶液在室溫攪拌約5分鐘。將乙腈(176ml)加到調整了pH的溶液中,然后預制備活化酯溶液。使反應在環(huán)境溫度進行90分鐘,通過加入5.5ml 10%HCl(2.75%v/v)和3倍體積(1200ml)的冷dH2O猝冷,得到2.70的pH。用猝冷反應中Lys B29(C8)KPB的量除以起始BHI的量來計算反應產率,為75.5%。將所述溶液分成兩個800ml以用于通過疏水層析(SP20SS)純化。柱層析后接著超濾和凍干。
如上所述,通過給需要所述治療的患者施用有效量的單?;葝u素類似物,本發(fā)明的?;葝u素類似物可以有效地治療高血糖。本文所用的術語“有效量”指所需的在治療或預防上用以降低或保持血糖水平的一種或多種本發(fā)明?;愃莆锏牧?。該量通??蓮拿刻旒s10單位或更多的單位(或約0.3-約2mg,假定每mg約29單位)。然而,應理解實際施用的酰化類似物數(shù)量是由醫(yī)生根據有關的情況而確定,所述情況包括待治療的狀態(tài)(即高血糖的原因),待施用的具體類似物,所選的非經胃腸給藥的途徑,個體患者的年齡,體重和反應以及患者癥狀的嚴重程度。因此,上述劑量范圍不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
通過藥物組合物給需要所述治療的患者(即環(huán)高血糖的患者)施用本發(fā)明的酰化胰島素類似物,所述藥物組合物含有有效量的至少一種單酰化胰島素類似物以及一種或多種可藥用賦形劑或載體。為了這些目的,通??梢耘渲扑幬锝M合物以便使其每ml含約100單位或含有效量酰化胰島素類似物的相似的濃度。盡管不需要,但通常這些組合物通常是非經胃腸給藥的,而且可以用常規(guī)用于非經胃腸給藥的產物的本領域熟知的賦形劑或載體,通過各種技術制備。參見,例如Remington′sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA(1985),該文獻引入本文作為參考。例如,通過將所需量的至少一種單-?;葝u素類似物懸浮或溶解在適用于注射的非毒性液體載體如水介質中,并將懸浮液或溶液滅菌,可以制備用于非經胃腸給藥的劑量形式。另外,可以將測量量的化合物放在小瓶中;然后將小瓶和其內含物滅菌密封。施用前,可以提供用于混合目的的附帶小瓶或載體。適用于非經胃腸給藥的藥物組合物使用稀釋劑,賦形劑和載體如水和水可混的有機溶劑如甘油,芝麻油,花生油,含水丙二醇,N,N-二甲基甲酰胺等。所述藥物組合物的實例包括無菌,等滲的,可以用可藥用緩沖劑緩沖并是無熱原的單-?;葝u素類似物的含水鹽溶液。另外,非經胃腸給藥的藥物制劑可以含有防腐劑如間-甲酚或調整最終產物的pH的其它試劑如氫氧化鈉或鹽酸。
還可以將本發(fā)明的?;葝u素類似物配制成混合物。所述混合物制劑含有未?;囊葝u素或胰島素類似物,和酰化的胰島素類似物。胰島素或胰島素類似物與酰化類似物的比例為1∶99到99∶1,以重量計。優(yōu)選,比例為75∶25-25∶75;最佳為40∶60-60∶40;但最好是50∶50。通過將所需體積的組分混合在標準非經胃腸給藥的制劑稀釋劑中以制備混合物制劑。標準稀釋劑包括等滲劑,鋅,生理學耐受的緩沖劑和防腐劑。生理學耐受的緩沖劑優(yōu)選是磷酸鹽緩沖劑,如磷酸氫二鈉。其它生理學耐受的緩沖劑包括TRIS或醋酸鈉。緩沖劑的選擇和濃度是本領域已知的??伤幱梅栏瘎┌ǚ?,間-甲酚,間苯二酚和對羥苯甲酸甲基酯。本發(fā)明的混合物制劑是特別有利的,因為相對速效胰島素或胰島素類似物以及單-?;葝u素類似物均可溶解在制劑中。因此,提供了可預測的作用時間模式。
下列制劑實施例僅是為了說明而不以任何方式限定本發(fā)明的范圍。
制劑1按如下制備非經胃腸給藥的制劑數(shù)量酚 30mM甘油 16mg/ml?;疞ysB28ProB29-人胰島素 100U鋅 0.7%醋酸鈉 3.8mg/ml將上述組分的溶液注射給需要所述治療的患者。
為了說明本發(fā)明化合物的效力,在有意識的狗模型中試驗B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素。用過夜禁食的有意識的體重為8-15kg的成年(1-2歲)雄性和雌性狗進行試驗。在研究前至少10天,用異氟烷麻醉動物,在左或右腹溝切口。將硅橡膠導管插入到股動脈和近尾股靜脈,然后用4-0絲線綁緊。用套針將導管的游離端經皮下通到背部。用甘油/肝素溶液(3∶1v/v;肝素終濃度為250KIU/ml)填充導管,將游離端打結,然后放在皮下囊中以使皮膚完全縫合。在手術前(20mg/kg,IV和20mg/kg,I.M)和手術后(250mg,p.o.每天一次,共7天)均施用頭孢氨芐以防止感染。手術后施用torbugesic(1.5mg/kg,I.M)以控制疼痛。
在進行研究的那天抽血以確定動物的健康情況。只使用血細胞比容高于38%而且白細胞數(shù)少于16000/mm3的動物。在試驗前的下午,從皮下囊中通過局部麻醉(2%利多卡因)作的一小切口將導管的游離端抽出,用固定用夾和頸套組合體將狗固定。
試驗的早晨,抽吸導管中的內含物(在這些研究中僅使用導管線),用鹽水沖洗導管,將延伸線(由不銹鋼外套保護的)與所述導管相連。將狗放在代謝籠中,將導管延伸線和外套與一旋轉開關系統(tǒng)相連以使狗可以在籠周圍自由走動。在15分鐘的休息期后(45分鐘,對照),抽血(2-3.5ml)以確定血漿葡萄糖濃度。在15分鐘后(0時)抽第二基線樣品。在頸后皮下施用試驗物質(磷酸鹽緩沖的鹽水或10.5mmol/kg的B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素;該劑量是1.75U/kg人胰島素的摩爾等量)。
然后在以后的2(對照)-6(B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素)小時,至少每隔30分鐘取一次動脈血樣品(2-3.5ml)。將樣品收集在含EDTA二鈉的真空血收集試管中,然后立即放在冰上。將樣品離心,然后將所得的血漿轉移到聚丙烯試驗試管中,在冰上貯存或冷凍用于研究。
在試驗結束時,麻醉(異氟烷)動物;用新鮮鹽水沖洗導管,然后用甘油/肝素混合物填充;將導管的游離端打結,然后按前述放在皮下;施用抗生素(300mg頭孢氨芐,I.M)。用貝克曼葡萄糖分析儀使用葡萄糖氧化酶方法確定研究那天的血漿葡萄糖濃度。數(shù)值列為均值±均值標準誤差(SEM)。
在注射磷酸鹽緩沖鹽水后的2小時觀察期內,血漿葡萄糖濃度與基線沒有顯著區(qū)別(表1)。在相同的時間期內,皮下施用B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素會使血漿葡萄糖濃度降低15%(17mg/dl)。在隨后的4小時內,B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素治療之動物的血漿葡萄糖濃度繼續(xù)逐漸降低,在注射后6小時葡萄糖水平降到低于基線的41mg/dl(降到35%)。
從文獻中知道,甚至在禁食后的一星期,正常狗的血漿葡萄糖濃度也不會明顯降低。在所述研究中觀察到的葡萄糖降低是由于施用了B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素,因此證實了該化合物的胰島素樣活性。
表1在皮下注射磷酸鹽緩沖鹽水(對照)或B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素后的血漿葡萄糖的濃度。
對照(n=5)B28-Nε-棕櫚酰-LysB28proB29-時間(分鐘)(mg/dL) 胰島素(n=1)(mg/dL)-15 114±3 1160 112±3 11630117±4 11460114±3 10790115±3 102120 117±599150101180100210100240 98270 87300 82330 79360 75
序列表(1)一般資料(I)申請人Baker等人(ii)發(fā)明題目?;囊葝u素類似物(iii)序列數(shù)2(iv)相關地址(A)受件人Eli Lilly and Company.
Patent Division/SPC(B)街道Lilly公司中心(C)城市印地安那波利斯(D)州印地安那波利斯(E)國家美國(F)郵政編碼46285(v)計算機可讀形式(A)介質類型軟盤,3.50英寸,1.4Mb內存(B)計算機Macintosh(C)操作系統(tǒng)Macintosh(D)軟件微軟Word(vi)當前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類號(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)代理人/代理資料(A)姓名Steven P.Caltrider(B)登記號36467(C)文檔號X9720(ix)通訊資料(A)電話(317)276-0757(B)傳真(317)277-1917
(C)電傳(2)SEQ ID NO1的資料(I)序列特征(A)長度21個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞可變位點(B)位置1(C)鑒定方法(D)其它資料“當SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ IDNO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly;或?;疓ly”(xi)序列描述SEQ ID NO1Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1 5 10 15Glu Asn Tyr Cys Asn20(3)SEQ ID NO2的資料(I)序列特征(A)長度30個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓撲結構線性(ii)分子類型多肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞可變位點(B)位置1(C)鑒定方法(D)其它資料“當SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,而SEQ IDNO2位置29的Xaa是Lys或Pro時,SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe;或?;疨he”(ix)特征(A)名稱/關鍵詞可變位點(B)位置28(C)鑒定方法(D)其它資料“當SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQ ID NO2位置1的Xaa是Phe,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Pro時,SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,Ala;或?;疞ys”(ix)特征(A)名稱/關鍵詞可變位點(B)位置29(C)鑒定方法(D)其它資料“當SEQ ID NO2位置28的Xaa是Asp,Lys,Leu,Val,或Ala,SEQ ID NO1位置1的Xaa是Gly,SEQID NO2位置1的Xaa是Phe時,SEQ ID NO2位置29的Xaa是Lys,Pro;或?;疞ys?!?xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1 5 10 15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr20 25 30
根據條約第19條修改時的聲明本申請的國際初步審查報告于1996年3月12日發(fā)出。根據《專利合作條約)》第19條的有關規(guī)定,申請人在此提交國際申請原始提交文本第23和24頁的替換頁(第23和24頁)。(相當于該國際申請原始提交的中文本的權利要求書第1頁)。
修改權利要求書是為了明確表明本發(fā)明胰島素類似物是單?;?。在說明書尤其是說明書第4頁、第4-6行(相當于相應中文本的第3頁第5行)的內容中有對所述修改的支持。根據第19條第2款規(guī)定,本發(fā)明所述修改沒有超出原始國際申請的內容,因此,申請人請求提交所述國際申請原始提交文本的第23和24頁的替換頁(相當于中文本權利要求書第1頁)。
權利要求書按照條約第19條的修改1.分子式如下的單-?;葝u素類似物與SEQ ID NO2適當交聯(lián)的SEQ ID NO1,或其可藥用鹽。
2.權利要求1的單-?;葝u素類似物,其中SEQ ID NO2位置28的Xaa是?;疞ys,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Pro。
3.權利要求2的單-?;葝u素類似物,其中?;鶊F是C6-C17脂肪酸。
4.權利要求2的單-?;葝u素類似物,其中?;鶊F是C13-C17脂肪酸。
5.B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素。
6.B28-Nε-肉豆蔻酰LysB28ProB29-人胰島素。
7.非經胃腸給藥的藥物制劑,含有權利要求1-7中任一權項的單一?;葝u素類似物以及一種或多種可藥用防腐劑,等滲劑或緩沖液。
8.非經胃腸給藥的藥物制劑,含有胰島素或胰島素類似物與權利要求1-7中任一權項的單一?;葝u素類似物的混合物,其中兩種組分的重量比為約1-99∶99-1。
9.權利要求8的非經胃腸給藥的藥物制劑,其中混合物是LysB28ProB29-人胰島素和B28-Nε-?;疞ysB28ProB29-人胰島素。
10.治療高血糖患者的方法,包括給所述患者施用一種藥物組合物,所述組合物含有有效量的權利要求1-7中任一權項的單一?;葝u素類似物。
11.制備非經胃腸給藥的藥物制劑的方法,包括混合權利要求1-7中任一權項的化合物,等滲劑和生理學耐受的緩沖劑。
12.權利要求1-7中任一權項的用于治療糖尿病的單一?;葝u素類似物。
13.基本上如任一實施例所述的單-?;葝u素類似物。
權利要求
1.分子式如下的單-?;葝u素類似物與SEQ ID NO2適當交聯(lián)的SEQ ID NO1,或其可藥用鹽。
2.權利要求1的胰島素類似物,其中SEQ ID NO2位置28的Xaa是酰化Lys,而SEQ ID NO2位置29的Xaa是Pro。
3.權利要求2的?;葝u素類似物,其中?;鶊F是C6-C17脂肪酸。
4.權利要求2的酰化胰島素類似物,其中?;鶊F是C13-C17脂肪酸。
5.B28-Nε-棕櫚酰LysB28ProB29-人胰島素。
6.B28-Nε-肉豆蔻酰LysB28ProB29-人胰島素。
7.非經胃腸給藥的藥物制劑,含有權利要求1-7中任一權項的胰島素類似物以及一種或多種可藥用防腐劑,等滲劑或緩沖劑。
8.非經胃腸給藥的藥物制劑,含有胰島素或胰島素類似物與權利要求1-7中任一權項的酰化胰島素類似物的混合物,其中兩種組分的重量比為約1-99∶99-1。
9.權利要求8的非經胃腸給藥的藥物制劑,其中混合物是LysB28ProB29-人胰島素和B28-Nε-?;疞ysB28ProB29-人胰島素。
10.治療高血糖患者的方法,包括給所述患者施用一種藥物組合物,所述組合物含有有效量的權利要求1-7中任一權項的?;葝u素類似物。
11.制備非經胃腸給藥的藥物制劑的方法,包括混合權利要求1-7中任一權項的化合物,等滲劑和生理學耐受的緩沖劑。
12.權利要求1-7中任一權項的用于治療糖尿病的?;葝u素類似物。
13.基本上如任一實施例所述的酰化胰島素類似物。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖尿病領域。具體地說,本發(fā)明涉及單體胰島素類似物,其中A鏈是人胰島素A鏈的天然序列,B鏈是在位置B28或B29或兩者同時進行修飾。所述類似物是在A鏈或B鏈的N-末端或在賴氨酸進行了單?;u;葝u素類似物的作用時間延長。
文檔編號C07K14/435GK1163574SQ95196266
公開日1997年10月29日 申請日期1995年11月14日 優(yōu)先權日1995年11月14日
發(fā)明者J·C·貝克, J·M·漢奎爾 申請人:伊萊利利公司
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