專利名稱：：制備成熟胰島素多肽的方法制備成熟胰島素多肽的方法發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在酵母中制備成熟人胰島素類似物的方法。發(fā)明背景胰島素是在胰島J3細(xì)胞中產(chǎn)生的多肽激素。有活性的胰島素分子是由通過兩個二硫鍵相連的B-鏈和A-鏈組成的雙鏈分子。胰島素以結(jié)構(gòu)為B-C-A的前體分子胰島素原形式合成，其中C-肽鏈將B-鏈的C-末端氨基酸殘基與A-鏈的N-末端氨基酸殘基相連。成熟的雙鏈胰島素通過在位于與A-和B-鏈的接點處的堿性氨基酸殘基對處切割C-肽形成。A-和B-鏈通過分別位于A7和B7以及A20和B19Cys殘基之間的兩個二硫鍵保持在一起。此外，生物學(xué)活性的胰島素分子還在A6和All位Cys殘基之間有一個內(nèi)部二硫鍵。在開發(fā)出重組DNA技術(shù)之后，已經(jīng)描述了許多在基因修飾宿主細(xì)胞中生產(chǎn)胰島素及其前體的方法。因此在例如Fmnk,B.H.,Pettee,J.M.,Zimmerman,R.E.&Burck,P丄In:PeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium(D.H.Rich和E.Gross,eds).PierceChemicalCompany,p.729(1981)中公開了從大腸桿菌(￡.co/O中制備胰島素的方法。由于大腸桿菌不具備將所表達(dá)的多肽進(jìn)行折疊的細(xì)胞機器且不確立在成熟胰島素中連接A-和B-鏈的二硫鍵，所以，該策略包括了許多體外加工步驟，比如在重折疊過程中體外確立二碌b鍵以及隨后的C-肽切割。與大腸桿菌形成對比，真核生物包含折疊和確立二硫鍵所必需的機器，且由此看來似乎是用于在基因修飾生物中生產(chǎn)成熟胰島素的好候選者。美國專利US4,914,026公開了一種在酵母中生產(chǎn)成熟胰島素的方法，其通過下述實現(xiàn)，在酵母宿主細(xì)胞中插入與酵母a-因子前導(dǎo)序列相連的人胰島素原基因并在一定條件下使轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長，由此表達(dá)和分泌成熟形式的胰島素原。Thim等人，ProcNatl.Acad.Sci.USA，第83巻，第6766誦6770頁，公開了人胰島素原以及多種帶有經(jīng)過修飾的C-肽的胰島素前體的表達(dá)，所迷經(jīng)過修飾的C-肽例如RREAENLQKR(SEEQIDNO:1)、RREAPLQKR(SEQIDNO:2)、RREALQKR(SEQIDNO:3)、KREALQKR(SEQIDNO:4)和RRLQKR(SEQIDNO:5)。SEQIDNO:5還公開于Thim等人，F(xiàn)EBSLetters,第212巻，第2期，第307-312頁。此外，WO97/03089公開了式為BZA的胰島素前體的表達(dá)，其中B和A是通過至少一個二硫鍵相連的人胰島素A和B肽鏈，Z是包含至少一個蛋白酶剪切位點的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQIDNO:6)。然而，所公開的胰島素前體僅在培養(yǎng)基中產(chǎn)生微量分泌的成熟胰島素。歐洲專利申請0163529A、PCT專利申請?zhí)朩O95/02059和WO90/10075公開了基于胰島素或胰島素類似物前體在酵母中的表達(dá)來制備胰島素和胰島素類似物的方法，這些胰島素或胰島素類似物前體在從發(fā)酵液體培養(yǎng)基中初始回收后被酶促轉(zhuǎn)化為成熟胰島素或胰島素類似物。這些前體分子包含特定的經(jīng)過修飾的C-肽，且還包含胰島素B-鏈的N-末端延伸。經(jīng)過修飾的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被設(shè)計成不在酵母中細(xì)胞^皮切割，且由此前體作為單鏈肽分泌，其中A-和B-鏈仍然通過經(jīng)過修飾的C-肽連接但具有正確定位的二硫鍵。之后通過許多隨后的體外酶促步驟以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰島素或胰島素類似物產(chǎn)物。這些酶促步驟是耗時的，常常是昂貴的，并且導(dǎo)入隨后在進(jìn)一步的下游加工步驟比如昂貴的層析步驟等中必須被除去的額外雜質(zhì)。美國專利號6,348,327中公開了在不能天然形成分泌顆粒的基因工程改造的動物細(xì)胞中制備成熟胰島素的方法。本發(fā)明的目的是開發(fā)能夠分泌完全加工的成熟人胰島素類似物的真菌菌抹，由此避免昂貴且費時的下游純化方法步驟。發(fā)明概述一方面，本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)含有編碼人胰島素類似物前體的DNA載體的真菌細(xì)胞制備成熟人胰島素類似物的方法，其中所述前體含有連接肽，在所述連接肽兩側(cè)與胰島素肽A-和B-鏈的兩個接點處分別帶有切割位點，所述切割位點在真菌細(xì)胞內(nèi)被切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌正確加工的成熟、雙鏈人胰島素類似物。根據(jù)本發(fā)明的人胰島素類似物在真菌細(xì)胞內(nèi)將作為單鏈前體表達(dá)，且將在該細(xì)胞內(nèi)被切割，并以成熟、雙鏈人胰島素類似物分泌，無需進(jìn)一步的體外加工。位于連接肽與胰島素分子A-和B-鏈各接點處的切割位點可以相同或不同，但通常是相同的，且在一種實施方案中，位于與A-和B-鏈接點處的切割位點均為Kex2切割位點。在另一種實施方案中，切割位點為Ypsl位點。連接肽將具有經(jīng)過最優(yōu)化以確保在真菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生切割以分泌正確成熟化的胰島素類似物多肽的氨基酸組成。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于與A-鏈接近的切割位點倒數(shù)第二位的氨基酸殘基選自Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp、Val、Met和Ala。在本發(fā)明的另一種實施方案中，連接肽在對于與A-鏈接近的切割位點倒數(shù)第二位將包含Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Val或Ala氨基酸殘基。在本發(fā)明的又一種實施方案中，連接肽在該位置將包含Leu或lie氨基酸殘基。我們還發(fā)現(xiàn)，相同位置的氨基酸殘基不應(yīng)當(dāng)是Asp、Glu或Gly。人胰島素中C-肽的大小是35個氨基酸殘基。因此在本發(fā)明的一個方面，該連接肽為約與天然C-肽相同長度。在一種實施方案中，連接肽將為2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2畫21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3個氨基酸殘基。在又一種實施方案中，連接肽將為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3陽25、3-24、3-23、3國22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3畫11、3-10、3-9、3畫8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。在又一種實施方案中，連接肽將由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34或35個氨基酸殘基組成。真菌細(xì)胞將分泌大量正確加工的人胰島素類似物，且在一種實施方案中，該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約20至約50mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。在另一種實施方案中，該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約20至約80mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。在另一種實施方案中，該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約100mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰烏素類似物。對來自胰島素類似物前體分子的連接肽的切割越有效，靶蛋白的終產(chǎn)量越高。因此，連接肽的氨基酸組成使得能夠分別對其與A-和B-鏈接點處的切割位點進(jìn)行有效切割將是令人滿意的。在本發(fā)明的一種實施方案中，至少50%表達(dá)的單鏈胰島素前體分子被切割成成熟雙鏈分子。在另一種實施方案中，至少60%表達(dá)的單鏈胰島素前體分子被切割成成熟雙鏈分子。在又一種實施方案中，至少70%表達(dá)的單鏈胰島素前體分子被切割成成熟雙鏈分子。在又一種實施方案中，至少75%表達(dá)的單鏈胰島素前體分子被切割成成熟雙鏈分子。在又一種實施方案中，至少85%或至少95%表達(dá)的單鏈胰島素前體分子被切割成成熟雙鏈分子。真菌細(xì)胞可以是任何能夠表達(dá)和分泌成熟胰島素類似物的真菌細(xì)胞。然而，酵母，尤其是啤酒糖酵母(S.cerev/wae),已顯示為最適于本發(fā)明目的的。人胰島素分子有三個螺旋結(jié)構(gòu)，一個在B-鏈中，且兩個在A-鏈中。A-鏈含有通過A9-A11位環(huán)相連的兩個螺旋部分A2-A8和A13-A19，且在胰島素的T-狀態(tài)構(gòu)象中，殘基B9-B19形成B-鏈的中央a-螺旋。已顯示，胰島素分子中的特定突變將增強這些螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)向高的生物學(xué)活性(參見N:Kaarsholm等人，Biochemistry1993,32，10773-10778)。由本發(fā)明方法制備的胰島素類似物通常將含有對人胰島素類似物分子螺旋結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定作用從而導(dǎo)致更高產(chǎn)量分泌的突變。因此，在一種實施方案中，由本發(fā)明方法制備的胰島素類似物在胰島素分子A8、B10和A14位中的一個或多個位置將含有突變，且在又一種實施方案中，這些位置的天然氨基酸殘基可突變?yōu)檫x自Asp、Glu、His、Gln和Arg的氨基酸殘基。胰島素分子的其它突變包括在B28和B29位的突變、在A18位的突變、B30或B1氨基酸殘基的缺失以及A21氨基酸殘基的突變。在本發(fā)明的一種實施方案中，B28位氨基酸殘基是Asp且B29位氨基酸殘基是Lys。在本發(fā)明的另一種實施方案中，B28位氨基酸殘基是Asp,B29位氨基酸殘基是Pro,且B30位氨基酸殘基是Thr。在本發(fā)明的又一種實施方案中，A18位的氨基酸是Gln。在本發(fā)明的又一種實施方案中，A21位的氨基酸殘基是Gly。在本發(fā)明的另一種實施方案中，B10位的氨基酸殘基是Glu。在本發(fā)明的另一種實施方案中，A8位的氨基酸殘基是His。在本發(fā)明的另一種實施方案中，A14位的氨基酸殘基是Glu。在本發(fā)明的又一種實施方案中，B10位的氨基酸殘基是Glu,A8位的氨基酸殘基是His，且A14位的氨基酸殘基是Glu。在本發(fā)明的又一種實施方案中，B30位的氨基酸殘基缺失。在一種實施方案中，人胰島素前體類似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中，B(l-30)是人胰島素B-鏈或其類似物，A(l-21)是人胰島素A-鏈或其類似物，各X和各Y各自獨立為Lys或Arg或Ypsl位點，且Z為1至約35個氨基酸殘基的肽序列，附帶條件是人胰島素A-和/或B-鏈中至少一個天然氨基酸殘基突變?yōu)榱硪粋€氨基酸殘基。在一種實施方案中，序列X-X和Y-Y均為Lys-Arg。在另一種實施方案中，序列X-X和Y-Y均為Arg-Arg、Lys-Lys或Arg-Lys。在又一種實施方案中，X-X是Lys-Arg且Y-Y是Arg-Arg,或X-X是Arg-Arg且Y-Y是Lys-Arg。在一種實施方案中，Z的大小為2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2國25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2國13、2-12、2-11、2陽10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4或2-3個氨基酸殘基。在又一種實施方案中，Z的大小為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3畫12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。在本發(fā)明的一種實施方案中，Z的大小可以是2、3、4、5、7、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34和35個氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-20個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-19個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-18個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-15個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-14個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-13個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-12個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-11個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-10個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-9個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-8個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-7個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-6個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-5個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一種實施方案中，Z是3-4個氨基酸殘基的氨基酸序列。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基選自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Phe、Trp、Val、Met和Ala。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Leu。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Ile。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Tyr。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Arg。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Lys。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是His。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Pro。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Phe。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Trp。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)笫二位的氨基酸殘基是Met。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)第二位的氨基酸殘基是Val。在本發(fā)明的一種實施方案中，對于切割位點Y-Y倒數(shù)笫二位的氨基酸殘基是Ala。在本發(fā)明的一種實施方案中，Z具有序列AspGlyLeuGly(SEQIDNo:7)。其余的Z為任何可編碼的氨基酸殘基，它們可以相同或不同。然而，在一種實施方案中，Z中對于切割位點Y-Y倒數(shù)笫二位的氨基酸殘基不是Asp、Glu或Gly。另一方面，本發(fā)明涉及編碼含有連接肽的人胰島素類似物前體的DNA序列，所述連接肽被設(shè)計為使得能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)對切割位點進(jìn)行有效切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。另一方面，本發(fā)明涉及含有編碼含有連接肽的人胰島素類似物前體的DNA序列的表達(dá)載體，所述連接肽被設(shè)計為使得能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)對切割位點進(jìn)行有效切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。在又一方面，本發(fā)明涉及含有表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的真菌細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有編碼含有連接肽的人胰島素類似物前體的DNA序列，所述連接肽被設(shè)計為使得能夠在真菌細(xì)胞內(nèi)對切割位點進(jìn)行有效切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。用本發(fā)明方法生產(chǎn)的人胰島素類似物可用于治療對胰島素敏感的狀態(tài)。因此，它們可用于治療l型糖尿病、2型糖尿病和高血糖癥，例如有些時候可以在嚴(yán)重受傷者和做了重大外科手術(shù)的人中看到的。在有利的情況下，胰島素類似物也可以以與其它類型的胰島素的混合物使用，例如具有更快開始作用的胰島素類似物。胰島素類似物的例子描述于，例如公開號為EP214826、EP375437和EP383472的歐洲專利申請中。另一方面，本發(fā)明涉及含有人胰島素類似物與適宜的藥學(xué)可接受佐劑和添加劑，比如一種或多種適于穩(wěn)定、保存或等滲性的試劑組合的藥物制劑。附圖簡述圖1顯示稱作pSA50的酵母質(zhì)粒例子。該質(zhì)粒包含表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有插入到該質(zhì)粒中哞酒糖酵母TPI基因轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的EcoRI-Z6al片段。圖2顯示實施例3中所述的包含胰島素前體B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的NcoI-XbalDNA片段(SEQIDN0:8),及其相應(yīng)氨基酸序列(SEQIDNO.10)。圖3顯示對起始體積為1.25L的發(fā)酵罐的物料添加速率(g物料/分鐘)的時間曲線。還顯示了作為時間函數(shù)的發(fā)酵罐中廢氣中的二氧化碳濃度。以及圖4顯示在600nm處測量的光密度和計算得到的每升發(fā)酵液體培養(yǎng)基胰島素的濃度的時間曲線(包括desB30胰島素)。發(fā)明詳述通過直接向發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分泌成熟產(chǎn)物來生產(chǎn)胰島素需要對含有在兩個末端都側(cè)接切割位點的連接肽的胰島素前體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)加工。這樣的連接肽可以是B-KR(W)nKR-A型，其中B是人胰島素的B-鏈，且W是長度不同的肽鏈。高爾基體蛋白酶Kexl和Kex2促成細(xì)胞內(nèi)加工。切割是多步驟過程，其中第一步的Kex2將切割與A-鏈附著的KR序列并將單鏈分子轉(zhuǎn)化為雙鏈分子。之后Kex2將切除連接肽W以得到雙鏈中間體胰島素分子，其中二肽KR仍然與B-鏈的C-末端氨基酸相連。最后，Kexl將除去最后的KR肽序列，從而得到成熟的雙鏈分子。試驗已顯示，對A鏈接點處的切割位點的有效切割對于切割過程的進(jìn)一步發(fā)展是重要的，且本發(fā)明的連接肽被設(shè)計成能夠?qū)崿F(xiàn)對A-鏈Kex2的切割位點的有效體內(nèi)切割，從而導(dǎo)致產(chǎn)生高產(chǎn)量的分泌的雙鏈胰島素分子而無需額外的體外加工步驟。從酵母中分泌大量活性成熟雙鏈人胰島素類似物將顯著減少為產(chǎn)生純度足夠高以用于藥用目的的人胰島素類似物所必需的下游純化步驟的數(shù)目。因此，在美國專利號4916212中公開的在酵母中制備胰島素的方法中，胰島素前體在兩個步驟中被轉(zhuǎn)化為人胰島素，即，轉(zhuǎn)肽作用以將單鏈胰島素前體B(1-29)-Alal畫Ala隱Lys國A(1-21)轉(zhuǎn)化為人胰島素酯，以及之后將胰島素酯水解為人胰島素。各轉(zhuǎn)化步驟將需要初始分離步驟，以及至少一個隨后的純化步驟。因此需要包括至少一個酶促轉(zhuǎn)化的至少六個額外步驟來生產(chǎn)成熟的雙鏈胰島素。已熟知的是，沒有酶促切割達(dá)到100%切割，從而導(dǎo)致未切割雜質(zhì)或部分切割的雜質(zhì)，在藥物產(chǎn)品的情況下這些雜質(zhì)必須被有效除去。因此，各切割步驟之后將有至少一個分離或純化步驟，通常是借助交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等的層析純化。可商業(yè)規(guī)模應(yīng)用的層析柱材料是非常昂貴的，且因此減少這樣的層析步驟的數(shù)目對于生產(chǎn)經(jīng)濟有顯著的影響。此外減少下游轉(zhuǎn)化和純化步驟將減少工作量和在該過程中所消耗的時間，且因此進(jìn)一步提高生產(chǎn)經(jīng)濟。在本發(fā)明的方法中，其中成熟雙鏈胰島素類似物可直接以高產(chǎn)量從培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中分離出來，需要更少的下游加工步驟來生產(chǎn)純度足夠于藥物用途的產(chǎn)品。除了穩(wěn)定化胰島素分子中的螺旋結(jié)構(gòu)的修飾外，用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的胰島素類似物還可以在A-和或B-鏈的特定位置進(jìn)行修飾。因此，B28位的氨基酸殘基可以是Asp。在另一組胰島素類似物中，Bl位的氨基酸殘基已缺失。該組胰島素類似物的具體例子是desBl人胰島素。在另一組胰島素類似物中，B30位的氨基酸殘基已缺失。在另一組胰島素類似物中，B28位的氨基酸殘基是Lys且B29位的氨基酸殘基是Pro。在另一組胰島素類似物中，A18位的氨基酸殘基可以是Gln,且在又一種實施方案中，A21位的氨基酸殘基可以是Gly。編碼胰島素前體類似物的DNA序列可以是基因組或cDNA起源的，例如可以是通過制備基因組或cDNA文庫以及利用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見，i^H口,Sambrook,J,Fritsch,EF禾口Maniatis,T,Mo/ecw/orC7om力g.'爿丄aZ)ora/o,少Mz聰a/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork,1989)合成的寡核普酸探針雜交篩選編碼全部或部分多肽的DNA序列來獲得的。編碼胰島素前體的DNA序列也可以用確定的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制《尋,侈'H口,Beaucage和Caruthers,7Wra/zet/rawZ^〃era22(1981),1859-1869所述的亞磷酰胺(phosphoamidite)方法，或由Matthes等人，￡"MSOJow"a/3(1984),801—805所述的方法。DNA序列還可以用具體引物通過聚合酶鏈反應(yīng)制備，例如US4,683,202或Saiki等人，Sc/e"ce239(1988),487—491中所述的。可將DNA序列插入任何可經(jīng)歷重組DNA程序的載體中，且載體的選擇通常將依賴于其所將導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，該載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴染色體的復(fù)制，例如質(zhì)粒。作為選擇，該載體可以是當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合到宿主細(xì)胞基因組中并與其所整合入的染色體一起復(fù)制的載體。載體優(yōu)選為其中編碼胰島素前體的DNA序列與DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它部分，比如啟動子，可操作地連接的表達(dá)載體。該啟動子可以是任何在所選的宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，并且可衍生自編碼該與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。適于在酵母宿主細(xì)胞中使用的啟動子的例子包括來自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.255(1980),12073—12080;Alber和Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1(1982),419-434)或醇脫氫酶基因(Young等人,inGeneticEngineeringofMicroorganismsforChemicals(Hollaender等人，eds.),PlenumPress,NewYork,1982)的啟動子、或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4c(R畫11等人，Nature304(1983),652-654)啟動子。如果必需的話，編碼胰島素前體的DNA序列還可以是與適宜的終止子、多腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強子序列和翻譯增強子序列可操作地連接的。本發(fā)明的重組載體還可含有使載體能夠在正被討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。為指導(dǎo)胰島素進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可向重組載體提供分泌信號序列(也已知為前導(dǎo)序列、前序列原或前序列)。該分泌信號序列以正確的讀框與編碼胰島素前體的DNA序列相連。分泌信號序列通常定位于編碼肽的DNA序列的5'。信號肽可以是天然存在的信號肽、或其功能性部分，或者它可以是合成肽。為了在酵母中有效分泌，也可將編碼前導(dǎo)肽的序列插入信號序列下游和編碼胰島素前體的DNA序列的上游。被導(dǎo)入DNA序列或重組載體的酵母宿主細(xì)胞可以是任何能夠表達(dá)胰島素前體的酵母細(xì)胞，且包括糖酵母屬物種(S"cc/^ram，yc^w/.)或裂殖糖酵母屬物種(Sc/nzoyacc/zaram^c^),尤其是菌林啤酒糖酵母或克魯弗利氏糖酵母(S"cc/"raw;/c^/Ww少veh)。其它的適宜酵母細(xì)胞的例子是菌抹克魯維氏酵母屬(《/z^vwomyc^)，比如乳克魯維氏酵母(I./ac〃力，漢遜氏酵母屬(/a朋e"w/a),例如多形漢遜氏酵母(7/./omor;7/2a)或畢赤氏酵母屬CPzc/na),例如，巴斯德畢赤氏酵母(尸./"Wo^)(cf.Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,pp.3459-3465;US4,882,279)。用異源DNA轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞和從其生產(chǎn)異源多肽的方法描述于例如US4,599,311、US4,931,373、US4,870,008、5，037,743和US4,845,075。所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過由選擇標(biāo)記確定的表型來選擇，所述表型通常是藥物抗性或在無特定營養(yǎng)物(例如亮氨酸)存在下生長的能力。在酵母中使用的優(yōu)選載體是在US4,931,373中公開的P0T1載體。本發(fā)明的方法是所謂的發(fā)酵法。該發(fā)酵優(yōu)選在無菌攪拌罐中進(jìn)行，所述攪拌罐帶有添加由空氣、氧和氨組成但不限于此的壓縮無菌氣體的供應(yīng)線。發(fā)酵罐可包含用于監(jiān)控pH、溫度、壓力、攪拌速率、溶解氧水平、液體含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和堿添加速率的設(shè)備/傳感器。溫度可以在約25至約35、約26至約31、或約26至約29。C范圍內(nèi)。pH將在約4.0至約6.8或約5.0至約6.5范圍內(nèi)?？刂茢嚢枰源_保最小溶解氧濃度為最小5%飽和。此外，發(fā)酵罐可裝備有監(jiān)控細(xì)胞密度水平、不考慮其物理-化學(xué)形式的代謝物和產(chǎn)物濃度的光學(xué)設(shè)備。利用對氣體進(jìn)入和氣體排出發(fā)酵罐的氣體分析來監(jiān)控?fù)]發(fā)性化合物的形成和消耗。所有監(jiān)控的變量的信號可用于控制目的，從而允許將這些變量維持在預(yù)定范圍內(nèi)或者根據(jù)關(guān)于時間預(yù)定的概況持續(xù)變化。作為選擇，響應(yīng)于來自其它監(jiān)控的變量的信號變化來控制變量。溶材料形式或以包括聚集材料在內(nèi)的;溶材料形式的細(xì)胞內(nèi)材;牛存^:產(chǎn)物的形成是組成型的或者誘導(dǎo)的，且依賴于或不依賴于微生物生長。發(fā)酵過程在工作體積為100mL至200.000L范圍內(nèi)的罐內(nèi)實施。發(fā)酵過程可以作為分批過程、補料分批過程、重復(fù)補料分批過程或連續(xù)過程操作。發(fā)酵過程中所使用的培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于生長宿主細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)基，比如基本培養(yǎng)基或含有適當(dāng)補料的復(fù)合培養(yǎng)基。適宜的培養(yǎng)基可獲自商業(yè)提供者，或者可以根據(jù)已公開的配方(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)目錄中的)制備。因此該培養(yǎng)基將包含至少一種碳源，一種或幾種氮源，包括鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、磷酸鹽、硝酸鹽和硫酸鹽在內(nèi)的必需的鹽，痕量金屬，水溶性維生素，加工助劑，包括但不限于蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑、配體、消泡劑和誘導(dǎo)物。培養(yǎng)基可包含在包括加熱滅菌在內(nèi)的一些操作條件下在液體培養(yǎng)基中部分沉淀或分散的組分。培養(yǎng)基可通過將幾種液體和氣溶體混合來制備。這些溶液可以在進(jìn)入發(fā)酵罐之前混合，或者它們可以作為分開的液體流以預(yù)定比率供應(yīng)入發(fā)酵罐中。不同的培養(yǎng)基組分液體溶液之間的比率可在發(fā)酵過程的不同階段發(fā)生變化，這意味著培養(yǎng)基總組成可以在發(fā)酵過程期間變化。適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基可包含20至60mM的PO^鹽，50至70mM的K+，20至35mM的S042-，4至6mM的Na+,6至13mM的Mg2+,0.5至1.5mM的Mn2+,0.02至0.04mM的Cu2+,0.1至0.3mM的Fe2+,0.01至0.05mM的Zn2+,痕量Co、Mo和Ni，作為復(fù)合氨基酸源的部分添加，1至40g/L的酵母提取物，選自m-肌醇(100至250mg/L)、泛酸釣(2至20mg/L)、鹽酸硫胺素(0.5至20mg/L)、吡。多醇(0.2至20mg/L)、煙酸煙酰胺(2至7mg/L)、生物素(0.03至0.8mg/L)、檸檬酸二氬膽堿(0.1至0.2mg/L)的維生素，比如檸檬酸這樣的配體，H20(0.5至7g/L)和作為碳源的葡萄糖(50至200g/L)。以400至1800mM的量持續(xù)加入作為氣體NH3或液體NH4OH的氮。以自來水作為天然釣和cr源。之后可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收由細(xì)胞生產(chǎn)的肽，所述常規(guī)方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，借助鹽(例如硫酸銨)從上清液或者濾液中沉淀蛋白質(zhì)組分，依賴于正被討論的蛋白的類型用多種層析法純化，例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。胰島素或胰島素類似物從培養(yǎng)液體培養(yǎng)基中分離出來之后可以，例如通過酰化尤其是B29Lys殘基的s-氨基基團(tuán)，轉(zhuǎn)化為?；问?。對胰島素的?；椒ㄊ潜绢I(lǐng)域熟知的，且公開于例如，EP專利792,290和894,095以及美國專利號5,693,609、5,646,242、5,922,675、5,750,497和6,011,007。?；葝u素的例子為N出"-十四烷酰des(B30)人胰島素、N孤、石膽酰(lithocholoyl)-丫-谷氨酰des(B30)人胰島素、NsB29—(Na-(HOOC(CH2)14CO)-Y-Glu)des(B30)人胰島素或NsB29—(Na-(HOOC(CH2)16CO)-，Glu)des(B30)人胰島素。"desB30"或"B(l-29)"意指缺乏B30氨基酸殘基的天然胰島素B鏈，B(l-30)意指人胰島素的天然B鏈，且"A(1-21)"意指天然胰島素A鏈。A18Q人胰島素是在人胰島素A-鏈A18位為Gln的胰島素類似物。B10E、A8H、A14E分別是B10位為Glu、A8位為His及A14位為Glu的胰島素類似物。"B1"、"A1"等分別意指胰島素B鏈1位(從N末端開始計數(shù))的氨基酸殘基以及胰島素A鏈1位(從N末端開始計數(shù))的氨基酸殘基。具體位置的氨基酸殘基還可用例如，PheW表示，其意指B1位的氨基酸殘基為苯丙氨酸殘基。"C-肽"意指將胰島素分子的A-和B-肽鏈連接在一起的肽序列，包括各末端的切割位點。"連接肽"分別意指與A-和B-鏈各接點處的兩個切割位點之間的肽序列。"成熟人胰島素類似物"意指具有與天然人胰島素分子相同結(jié)構(gòu)構(gòu)象的活性雙鏈胰島素類似物，例如，在Cys"和CysB7以及Cys扁和CysB19之間帶有二硫鍵，以及在Cys^和CysA"之間帶有內(nèi)部二硫鍵，但是與相應(yīng)位置的天然氨基酸殘基相比，在A和/或B-鏈的一個或多個位置帶有特定的突變。本文所使用的"胰島素類似物"意指多肽，其具有形式上可通過缺失和/或取代至少一個存在于天然胰島素中的氨基酸殘基和/或通過添加至少一個氨基酸殘基，源自天然存在的胰島素(例如人胰島素)結(jié)構(gòu)的分子結(jié)構(gòu)。所添加和/或取代的氨基酸殘基可以是可編碼氨基酸或其它天然存在的氨基酸殘基或純合成的氨基酸殘基。與人胰島素相比，胰島素類似物通常將不包含超過約7個突變，更一般不超過5個且甚至更一般最多3個突變。胰島素類似物可以是這樣的，其中B鏈28位可以從天然的Pro殘基修飾為Asp、Lys或Ile。B29位的Lys還可以修飾為Pro。而且，A21位的Asn可修飾為Ala、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val,尤其是Gly、Ala、Ser或Thr，且尤其是Gly。此外，B3位的Asn可修飾為Lys或Asp。胰島素類似物的其它例子是des(B30)人胰島素，其中Bl和B2中的一個或者二者均被缺失的胰島素類似物；其中A-鏈和/或B-鏈具有N-末端延伸的胰島素類似物和其中A-鏈和/或B-鏈具有C-末端延伸的胰島素類似物。其它胰島素類似物是這樣的，其中B26-B30中的一個或多個已被缺失。本文中所使用的"胰島素衍生物"意指已經(jīng)過化學(xué)修飾的天然存在的胰島素或胰島素類似物，例如，通過向胰島素主鏈中的一個或多個位置導(dǎo)入側(cè)鏈，或通過氧化或還原胰島素中氨基酸殘基基團(tuán)，或?qū)⒂坞x氨基基團(tuán)或羥基基團(tuán)?；?。"Kex2"意指優(yōu)先催化在兩個堿性殘基(賴氨酸或精氨酸)序列后切割的枯草桿菌蛋白酶樣內(nèi)切蛋白酶(Rockwell,NC，Krysan，DJ，Komiyama,T&Fuller,RS2002PrecursorProcessingbyKex2/FurinProteases.Chem.Rev.102:4525-4548)。"Kexl"意指優(yōu)先催化去除C-末端賴氨酰和/或精氨酰殘基的絲氨酸羧肽酶(ShiltonBH,ThomasDY,CyglerM1997CrystalstructureofKexldeltap,aprohormone-processingcarboxypeptidasefrom5"acc/^o，cescerev^z'ae.Biochemistry36:9002-9012)。"Ypsl，，意指在缺乏天然前a交配因子(pro-alpha-matingfactor)加工酶Kex2的酵母突變體中部分抑制前a交配因子加工缺陷的天冬氨酰蛋白酶(Egel-Mitani等人，Yeast6，1990，pp.127-137)。"正確加工的"意指在所需切割位點酶切，從而得到具有正確氨基酸殘基序列的所需產(chǎn)物。"尸Or，是粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因，且"77V/"是啤酒糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因。術(shù)語"信號肽"被理解為意指在蛋白質(zhì)前體形式中作為N-末端序列存在的前-肽。信號肽的功能是使異源蛋白能夠容易地轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。信號肽通常在該加工過程中被切除。信號肽可以是與產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主生物異源或同源的。絲狀真菌宿主細(xì)胞的有效信號肽編碼區(qū)是獲自米曲霉(J^wg"/MoO^ae)TAKA淀粉酶基因、黑色曲霉(A^erg/〃wmgw)中性淀粉酶基因、米黑根毛霉(i^/zomwcorw/e/^)天冬氨酸蛋白酶基因、柔毛腐質(zhì)霉(//wm/co/a/cmwgwoM)纖維素酶或脂肪酶基因、或米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶基因、曲霉屬物種(Ay/erg/〃wsp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶、編碼米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶的基因的信號肽編碼區(qū)。信號肽優(yōu)選源自編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑色曲霉中性a-淀粉酶、黑色曲霉酸穩(wěn)定淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。可用于酵母宿主細(xì)胞的有用信號肽獲自啤酒糖酵母a-因子和啤酒糖酵母轉(zhuǎn)化酶基因。可與本發(fā)明的DNA構(gòu)建體使用的許多信號肽包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(Ypsl)信號肽或其任何功能類似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST6:127-137和US5,726,038)和MFa/基因的a-因子信號(Thorner(1981)inTheMolecularBiologyoftheYeastSacc/zfaromvcesStrathern等人，eds.,pp143-180,ColdSpringHarborLaboratory,NY和US4,870,008,小鼠唾液淀粉酶信號肽(參看O.Hagenbuchle等人,Nature289,1981,pp.643-646)、修飾的叛肽酶信號肽(參看L.A.Vails等人，Cell48，1987,pp.887-897)和酵母BAR1信號肽(參看WO87/02670)。術(shù)語"前-肽，，意指多肽序列，其功能為允許將所表達(dá)的多肽從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)導(dǎo)向高爾基體并進(jìn)一步導(dǎo)向分泌小泡以分泌進(jìn)入培養(yǎng)基(即，多肽穿過細(xì)胞壁或至少穿過細(xì)胞膜輸出到酵母細(xì)胞的周質(zhì)間隙內(nèi))。前肽可以是酵母a-因子前肽，參見US4,546,082和4,870,008.作為選擇，前肽可以是合成前肽，也就是說自然界中未曾發(fā)現(xiàn)的前肽。適宜的合成前肽是US5,395,922、5，795,746、5,162，498、WO89/02463、WO92/11378和WO98/32867中公開的那些。本發(fā)明的多核苷酸序列還可以是混合基因組、cDNA和合成來源的。例如，可將編碼前導(dǎo)肽的基因組或cDNA序列與編碼A和B鏈的基因組或cDNA序列相連，之后可以才艮據(jù)熟知的方法，通過插入用于同源重組的編碼所需氨基酸序列的合成寡核苷酸或優(yōu)選用適宜的寡核香酸通過PCR產(chǎn)生所需序列，對該DNA序列進(jìn)行位點修飾。本發(fā)明包括載體，所迷載體能夠在所選擇的微生物或宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體，且?guī)в芯幋a本發(fā)明的胰島素前體的多核苷酸序列。該重組載體可以是自主復(fù)制載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴染色體的復(fù)制,例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含任何確保自我復(fù)制的工具。作為選擇，該載體可以是當(dāng)其被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時整合到基因組中并與其所整合入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單個載體或質(zhì)粒、或者兩個或更多個共同包含全部將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組中的DNA的載體或質(zhì)粒、或轉(zhuǎn)座子。載體可以是線性或閉環(huán)質(zhì)粒，且優(yōu)選將包含允許載體穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞基因組或載體在細(xì)胞中獨立于基因組自主復(fù)制的元件。在一種實施方案中，重組表達(dá)載體能夠在酵母中復(fù)制。能夠使載體在酵母中復(fù)制的序列的例子為酵母質(zhì)粒2nm復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起點。載體還可包含選擇標(biāo)記，例如，產(chǎn)物補償宿主細(xì)胞缺陷的基因或賦予藥物抗性的基因，所述藥物例如氨千青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨曱蝶呤。用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記包括am必(乙酰胺酶)、(鳥氨酸氨曱酰基轉(zhuǎn)移酶)、/,G(乳清酸核苷-5，-磷酸脫羧酶)和(鄰氨基苯甲酸合酶。用于酵母宿主細(xì)胞的合適標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母優(yōu)選的選擇標(biāo)記是粟酒裂殖糖酵母TPI基因(Russell(1985)Gene40:125-130)。載體中，多核苷酸序列與適宜的啟動子序列可操作地連接。該啟動子可以是在所選的宿主細(xì)胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何核酸序列，包括突變的、截短的和雜交的啟動子，而且可獲自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的適宜啟動子的例子是獲自米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性ot-淀粉酶、和黑色曲霉酸穩(wěn)定a-淀粉酶基因的啟動子。在酵母宿主中，有用的啟動子是哞酒糖酵母MFal、TPI、ADH或PGK啟動子。本發(fā)明的多核苷酸構(gòu)建體通常也與適宜的終止子可操作地連接。酵母中適宜的終止子是TPI終止子(Alber等人，(1982)J.Mol.Appl.Genet.1:419-434)。用于分別連接編碼胰島素前體的DNA序列、啟動子以及任選地終止子和/或分泌信號序列，以及把它們插入包含復(fù)制所必需信息的適宜載體的方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(參見，例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)?？梢岳斫?，可以通過首先制備包含編碼本發(fā)明胰島素前體的完整DNA序列的DNA構(gòu)建體，和隨后將該片段插入適宜的表達(dá)載體中，或通過連接前順序插入包含各元件(比如信號、前肽、經(jīng)過修飾的C-肽、A和B鏈)遺傳信息的DNA片段，來構(gòu)建載體。本發(fā)明還涉及含有編碼本發(fā)明胰島素前體的多核苷酸序列的重組真菌細(xì)胞。如前述，將含有這樣的多核苷酸序列的栽體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，從而該載體作為染色體整合體或作為自我復(fù)制的染色體外載體維持。術(shù)語"宿主細(xì)胞"包含親本細(xì)胞的由于復(fù)制過程中發(fā)生突變而導(dǎo)致與親本細(xì)胞不相同的任何子代。本發(fā)明中所使用的宿主細(xì)胞是真菌細(xì)胞。本文所使用的"真菌"包括子嚢菌門(爿scowycoto)、4旦子菌門(Sas/Aowyco^r)、壺菌門(C7^f"Womycoto)和4妻合菌門(Zygowycoto)(長口Hawksworth等人,Jz>wwoW/2awt/5&^y、Z)z'c/v'ow(3^yo/77zeFwwgz',8thedition,1995,CABInternational,UniversityPress,Cambridge,UK所定義的)以及卵菌門(Oomycota)(如Hawksworth等人,1995,同上，第171頁所引述的)以及所有有絲分裂孢子真菌(Hawksworth等人，1995,同上)。在一種實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。本文所使用的"酵母"包括產(chǎn)子嚢酵母(內(nèi)孢霉目(Endomycetales))、產(chǎn)擔(dān)孢子(basidiosporogenous)酵母和屬于半知菌的酵母(芽孢綱(Blastomycetes))。產(chǎn)子嚢酵母分作蝕精霉科(S戸歸/雄謹(jǐn)c騰)和糖酵母科(S"cc/zaramyc"aceae)。后者包含四個亞科，裂殖糖酵母亞科(Sc/^o^cc/wTOmycoWeae)(*如，粟酒裂殖糖酵母屬(Sc/n'zosacc/zaromyc^))、拿遜氏酵母亞禾牛(TW/^isom'o/c/eae)、油月旨酵母亞科(丄—mycoz'(ieae)和糖酵母亞科(Sacc/z"r謹(jǐn)少co油ae)(辨如，畢赤氏酵母屬(尸/c/na)、克魯維氏酵母屬(《/t(yvwomyc^)和糖酵母屬(5""cc/artwy/ce《))。產(chǎn)4旦孑包子酵母包4舌丄ewcay/o〃'6^'w、纟工冬孑包屬(i^^/os;wn力wm)、鎖擲酵母屬(S/onJ/oZw/w)、線黑粉酵母屬(Fz7o^w,Wwm)和線黑粉菌屬(F歸認(rèn)c/幽)。屬于半知菌的酵母分作兩個科,擲孑包酵母科(iS/wo6o/蘭ycetocefle)(伊/如，5VraZ)o/簡yc^和布氏彈孢酵母屬(Sw〃era))和隱球酵母科(07ptococcaceae)(*如，假絲酵母屬(Om&^))。由于酵母分類將來可能發(fā)生變化，所以為了本發(fā)明的目的，酵母應(yīng)4姿照5Zo/ogy爿c"W""o/(Skinner,F.A.,Passmore,S.M.，和Davenport,R.R.，eds,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)所述的進(jìn)行定義。酵母的生物學(xué)和酵母遺傳學(xué)操作是本領(lǐng)域熟知的(參見，辨如，^oc/zem/W^a"c/GewWcso/Teos"Bacil,M.，Horecker,B丄和Stopani，A.O.M.編，笫二版，1987;r/zer^w",Rose,A.H.，和Harrison,J.S.編，第二版，1987;以及T7zeM/ecw/arWo/ogy/7ze7ea>stSacc/zaramycM,Strathern等人編，1981)。酵母宿主細(xì)胞可選自假絲酵母屬、克魯維氏酵母屬、糖酵母屬、裂殖糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、漢遜氏酵母屬、耶羅威亞酵母屬()^TOW/")的物種的細(xì)胞。在一種實施方案中，酵母宿主細(xì)胞是卡爾斯伯糖酵母(Sacc/zarom少c^ccjrAs"^ge腦's)、啤酒糖酵母(5^cc/7(ar函yc^cereWw'ae)、糖化糖酵母(5^cc/zar麵少cesdz'(^Wcz^)、iSacc/z"r讓Fes(iowgAxs7'/、克魯弗利氏沖唐酵母(Sacc/^rw^yces^:/wyven')、Sacc/an7附y(tǒng)ceswor6e服'A、卵形糖酵母(S"cc/z(3r纖yc^ovz》nm、)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/z/zas^cc/^omyces/麵6e)、葡萄汁糖酵母(5V7cc/zor謂ycesmw麵)、克魯弗利氏畢赤氏酵母(尸纟c/na^^veh)>解脂耶羅威亞酵母(7amw/a/0。/jw7ca)、產(chǎn)朊假絲酵母(OmoWaw"fe)、可可假絲酵母(Ca"c/,Wa)和發(fā)酵性絲孢酵母(GeoiWc/zwm/erme"to朋)。其它可用的酵母宿主細(xì)胞是乳克魯維氏酵母(A7w"eramyc^/acto)、脆壁克魯維氏酵母(^"—veromyces/rag〃/s)、多形漢遜氏酵母(//(mye"w/a/o/，or//za)、巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/z/a/^Won^)、解脂耶羅威亞酵母(/—一ca)、粟酒裂殖糖酵母(Sc/n'm^"cc/2(ar謹(jǐn)jA^p謂6e)、f/幼7go、麥芽糖假絲酵母(Ca"力Wam"/to化)、季也蒙氏畢赤氏酵母(尸/c/n'agw/〃ermowc/〃)禾口尸/c/n'"me//zawo//o/(參看Gleeson等人，J.Gen.Microbiol.132,1986,第3459-3465頁；US4,882,279和US4,879,231)。在一種實施方案中，真菌宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。"絲狀真菌"包括真菌門(五wmycoto)和卵菌門亞類的所有絲狀形式(如Hawksworth等人所定義的，1995,見前述)。絲狀真菌的特征在于，由殼多糖、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖和其它復(fù)合多糖組成的營養(yǎng)菌絲體。絲狀真菌宿主細(xì)胞可選自支頂孢屬(Jc"momw附)、曲霉屬(^4^erg"/uy)、鐮孢屬(Fw^nwm)、腐質(zhì)霉屬(//w,mco/a)、毛霉屬(Mwco"、毀絲霉屬(A^ce/Zop/^/zorat)、《連孑包霉屬(iVewros/9on3)、青霉屬(尸em'cz〃zwm)、草根霉屬(T7^/av^)、彎頸霉屬(7W;^oc/a力wm)和木霉屬(7Wc/zc^e/7wa)。"可編碼氨基酸"或"可編碼氨基酸殘基"這一表達(dá)用于表示可由核苷酸三聯(lián)體(密碼子)編碼的氨基酸或氨基酸殘基。本發(fā)明上下文中，氨基酸三字母或單字母表示法以下表中所示的常規(guī)的含義使用。除非明確指明，本文所提到的氨基酸是L-氨基酸。此外，除非另外說明，肽的氨基酸序列的左右末端分別為N-和C-末端。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>發(fā)酵意指增殖浸沒在液體培養(yǎng)基中的微生物的無菌過程。發(fā)酵優(yōu)選在無菌攪拌罐中進(jìn)行，所述攪拌罐帶有添加由空氣、氧和氨組成但不限于此的壓縮無菌氣體的供應(yīng)線。發(fā)酵罐可包含用于監(jiān)控pH、溫度、壓力、攪拌速率、溶解氧水平、液體含量、泡沫水平、物料添加速率以及酸和堿添加速率的設(shè)備/傳感器。此外，發(fā)酵罐可裝備有監(jiān)控細(xì)胞密度水平、不考慮其物理-化學(xué)形式的代謝物和產(chǎn)物濃度的光學(xué)設(shè)備。利用對氣體進(jìn)入和氣體排出發(fā)酵罐的氣體分析來監(jiān)控?fù)]發(fā)性化合物的形成和消耗。所有監(jiān)控的變量的信號可用于控制目的，從而允許將這些變量維持在預(yù)定范圍內(nèi)或者根據(jù)關(guān)于時間預(yù)定的概況持續(xù)變化。作為選擇，響應(yīng)于來自其它監(jiān)控的變量的信號變化來控制變量。發(fā)酵過程中所生產(chǎn)的所需產(chǎn)物以可溶性細(xì)胞外材料存在，或者以可溶材料形式或以包括聚集材料在內(nèi)的不溶材料形式的細(xì)胞內(nèi)材料存在。產(chǎn)物的形成是組成型的或者誘導(dǎo)的，且依賴于或不依賴于微生物生長。發(fā)酵過程在工作體積為100mL至200.000L范圍內(nèi)的罐內(nèi)實施。發(fā)酵過程可以作為分批過程、補料分批過程、重復(fù)補料分批過程或連續(xù)過程操作。分批過程意指，在將微生物加入罐中之前發(fā)酵罐中含有無菌培養(yǎng)基的發(fā)酵。在該過程期間，自動或手工加入酸、堿、消泡劑、抑制劑、穩(wěn)定劑和"i秀導(dǎo)物。酸和石咸以'液體溶'液或氣體組分加入。這些《且分可通過一條補料線加入，或者它們可以在分離的線中供應(yīng)于發(fā)酵罐。發(fā)酵過程期間，為了分析目的僅取出發(fā)酵罐內(nèi)容物。在發(fā)酵過程結(jié)尾收獲發(fā)酵罐中的所有內(nèi)容物。然而，對于連續(xù)分批過程，僅部分收獲發(fā)酵罐中的內(nèi)容物，并用新鮮無菌培養(yǎng)基重新填充發(fā)酵罐，從而允許發(fā)生另一批發(fā)酵。補料分批過程是在加入微生物之前僅向發(fā)酵罐中填入部分培養(yǎng)基的發(fā)酵。將剩余的培養(yǎng)基組分或剩余量的已部分添加的培養(yǎng)基組分作為一次脈沖、作為一系列不連續(xù)的脈沖或作為以恒定或可變速率添加的連續(xù)流供應(yīng)給發(fā)酵罐。分批過程可以在補料分批過程之前，之后為補料分批操作模式。過程期間加入發(fā)酵罐的培養(yǎng)基組分由生長限制組分、微溶組分、揮發(fā)性組分或在液體環(huán)境中穩(wěn)定性有限的組分組成但不限于此。微生物的生長速率可通過速率調(diào)節(jié)來控制，通過此調(diào)節(jié)來向發(fā)酵罐中添加培養(yǎng)基組分。在該過程期間自動或手工加入酸、堿、消泡劑、抑制劑、穩(wěn)定劑和誘導(dǎo)物。酸和^咸以液體溶液的部分或氣體組分加入。補料分批過程期間，所有組分可通過一條補料線加入，或者它們可以在分離的線中供應(yīng)于發(fā)酵罐。補料分批過程期間，為了分析目的僅取出發(fā)酵罐內(nèi)容物。在過程結(jié)尾收獲發(fā)酵罐中的所有內(nèi)容物。補料分批過程的一種變化方式是重復(fù)補料分批過程(Repeated-Fed-batchprocess)。重復(fù)補料分批發(fā)酵的實施類似于補料分批過程，但是在過程期間一次或幾次取出部分發(fā)酵罐內(nèi)容物。部分取出發(fā)酵罐內(nèi)容物后可加入新鮮培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基加入后在重新開始補料分批過程操作之前可接著分批過程。新鮮培養(yǎng)基的組成以及補料分批過程期間加入的培養(yǎng)基無需相同。連續(xù)過程意指，在加入微生物以及發(fā)酵開始之前向罐中加入一些培養(yǎng)基的發(fā)酵。連續(xù)加入含有生長所必需的所有培養(yǎng)基組分以及抑制劑、誘導(dǎo)物、消泡劑、酸、堿和穩(wěn)定產(chǎn)物的組分的新鮮培養(yǎng)基。這些組分可以通過一條補料線加入，或者它們可以在分離的供應(yīng)線中向發(fā)酵罐供應(yīng)，以提高所使用的培養(yǎng)基的穩(wěn)定性或提高其品質(zhì)。酸和堿作為液體溶液的部分抑或作為氣體組分加入。所有組分作為一系列不連續(xù)的脈沖或作為以恒定或可變速率添加的連續(xù)流加入發(fā)酵罐。為將發(fā)酵罐內(nèi)容物維持在預(yù)定范圍內(nèi)，連續(xù)收獲發(fā)酵罐的內(nèi)容物。微生物的生長可通過向發(fā)酵罐中添加培養(yǎng)基的速率以及調(diào)節(jié)發(fā)酵罐內(nèi)容物來控制。培養(yǎng)基意指包含下述的液體溶液，至少一種碳源，一種或幾種氮源，包括鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽和硫酸鹽在內(nèi)的必需鹽，痕量金屬，水溶性維生素，加工助劑，包括但不限于蛋白酶抑制劑、穩(wěn)定劑、配體、消泡劑和誘導(dǎo)物。培養(yǎng)基可包含，在包括加熱滅菌在內(nèi)的一些操作條件下，在液體培養(yǎng)基中部分沉淀或分散的組分?？赏ㄟ^將幾種液體和氣溶體混合來制備培養(yǎng)基。這些溶液可以在進(jìn)入發(fā)酵罐之前混合，或者它們可以作為分開的液體流以預(yù)定比率供應(yīng)入發(fā)酵罐中。不同這^味j培養(yǎng)基總組成可以在發(fā)酵i程期間變化。下、丄包含不同培養(yǎng)基組分的濃度范圍列表。這些濃度以所加入的培養(yǎng)基組分總量除以發(fā)酵罐中初始培養(yǎng)基體積來計算。連續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基濃度以進(jìn)入發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基中的濃度包括在其中。下表是對發(fā)酵培養(yǎng)基的一般組分的評論。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>含有本發(fā)明胰島素類似物的藥物組合物可用于治療對胰島素敏感的狀態(tài)。因此，它們可用于治療1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖癥，例如有些時候可以在嚴(yán)重受傷者和做了重大外科手術(shù)的人中看到的。對任何患者的最佳劑量水平將依賴于多種因素，包括所使用的具體胰島素衍生物的效力、患者年齡、體重、身體活性以及飲食、與其它藥物的可能組合以及所治療的狀態(tài)的嚴(yán)重程度。推薦由本領(lǐng)域技術(shù)人員以類似于已知胰島素組合物的方式來確定本發(fā)明胰島素衍生物對各單獨患者的曰劑量。胰島素類似物的藥物組合物將包含通常的佐劑和添加劑，且優(yōu)選配制成水溶液。例如，使用氯化鈉、乙酸鈉或甘油將水性培養(yǎng)基制成等滲的。此外，水性培養(yǎng)基可包含鋅離子、緩沖液和防腐劑?？蓪⒔M合物的pH值調(diào)至所需值，且其可為約4至約8.5。在本發(fā)明的一種實施方案中，制劑的pH選自2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9和10.0。藥物組合物將包含一種或多種適于穩(wěn)定、保存或等滲性的試劑這樣的通常的佐劑，例如，鋅離子、酚、甲酚、對羥基苯曱酸酯(parabene)、氯化鈉、甘油或甘露糖醇。藥物中所使用的緩沖液可選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉、和三羥曱基氨基曱烷、,二(羥乙基)甘氨酸、#-[2-羥-1,1-二羥曱基乙基]甘氨酸、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。藥學(xué)可接受防腐劑可選自酚、鄰甲酚、間甲酴、對曱盼、對羥基苯曱酸曱酯、對羥基苯曱酸丙酯、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、節(jié)醇、氯代丁醇、和乙基汞硫代水楊酸鈉(thiomerosal)、溴硝丙二醇(bron叩ol)、安息香酸、咪唑烷脲(imidurea)、氯己定、脫氫乙酸鈉、氯甲酚、對羥基苯曱酸乙酯、氯化卡乙氧銨、氯酚醚(3對氯苯氧基丙烷-l,2-二醇)或其混合物。在本發(fā)明的又一種實施方案中，防腐劑以0.1mg/ml至20mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一種實施方案中，防腐劑以O(shè).lmg/ml至5mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一種實施方案中，防腐劑以5mg/ml至10mg/ml的濃度存在。在本發(fā)明的又一種實施方案中，防腐劑以10mg/ml至20mg/ml的濃度存在。這些具體的防腐劑的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一種替代實施方案。藥物組合物中的防腐劑的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。為方便起見，可參見Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版,1995。等滲劑可選自鹽(例如，氯化鈉)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-組氨酸、精氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、蘇氨酸)、糖醇(例如，甘油、1,2-丙二醇(丙二醇)、1,3-丙二醇、1,3-丁二醇)聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物?？梢允褂萌魏翁牵热鐔翁?、二糖或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、普魯分支葡聚糖、糊精、環(huán)糊精、可溶淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素-Na。在一種實施方案中，糖添加劑是蔗糖。糖醇的定義是，具有至少一個-OH基團(tuán)的C4-C8烴，且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、衛(wèi)矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一種實施方案中，糖醇添加劑是甘露糖醇。上述糖或糖醇可單獨或組合使用。對于用量沒有固定的限制，只效果產(chǎn)生不利作用。在一種實施方案中，糖或糖醇濃度為約1mg/ml至約150mg/ml。在本發(fā)明的又一種實施方案中，等滲劑的存在濃度為1mg/ml至50mg/ml。在本發(fā)明的又一種實施方案中，等滲劑的存在濃度為1mg/ml至7mg/ml。在本發(fā)明的又一種實施方案中，等滲劑的存在濃度為8mg/ml至24mg/ml。在本發(fā)明的又一種實施方案中，等滲劑的存在濃度為25mg/ml至50mg/ml。等滲劑在藥物組合物中的使用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。為方便起見，可參見Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thedition,1995。本文中所引述的所有參考文獻(xiàn)，包括公開出版物、專利申請和專利，均全文引入本文作為參考，且程度如同各參考文獻(xiàn)單獨或具體指明引入本文作為參考，且全文引入本文(至法律所允許的最大程度)。本文所使用的所有標(biāo)題和副標(biāo)題僅為方便而使用，且不應(yīng)當(dāng)理解為以任何方式限制本發(fā)明。本文中所提供的任何和所有實施例、或例舉式語言(例如，"比如......這樣的")的使用僅意欲更好地闡述本發(fā)明，且不限制本發(fā)明的范圍，除非另外聲明。本發(fā)明說明書中的任何語言均不應(yīng)當(dāng)被解釋為將任何非請求保持的要素視為對于本發(fā)明的實踐來說關(guān)鍵的。的專利文獻(xiàn)的有效性、可專利性和/或可實施性的任何觀點。如適用的法律所允許的，本發(fā)明包括對本文所附權(quán)利要求書中所述主題的所有改變或等同方案。實施例通用程序所有表達(dá)質(zhì)粒均為C-POT型，類似于EP171,142中所描述的那些。這些是基于2p的表達(dá)載體，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶基因(POT)以在啤酒糖酵母中選擇和穩(wěn)定質(zhì)粒。這些質(zhì)粒還包含啤酒糖酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶啟動子和終止子序列。這些序列類似于質(zhì)粒pKFN訓(xùn)3(描述于WO9010075)中的相應(yīng)序列。通過轉(zhuǎn)化宿主菌株哞酒糖酵母菌株MT663或ME1719制備酵母轉(zhuǎn)化體。酵母菌抹MT663(MATa/MATapep4-3/pep4-3HlS4/his4Atpi::LEU2/Atpi::LEU2Cir')與申請WO92111378關(guān)聯(lián)，保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen,且所得保藏號為DSM6278。啤酒糖酵母菌抹ME1719(MATa/aleu2/leu2pep4-3/pep4-3Atpi:丄EU2/Atpi::LEU2Aura3/Aum3Aypsl::URA3/Aypsl::ura3Cir十)描述于WO98/01535。MT663或ME1719在YPGaL(1%細(xì)菌用酵母提取物，2%細(xì)菌用蛋白胨，2%半乳糖，1%乳酸)上生長至600nm處O.D.為0.6。通過離心收獲100ml培養(yǎng)物，用10ml水洗滌，再次離心并重懸于10ml含有1.2M山梨糖醇、25mMNa2EDTApH二8.0和6.7mglml二硫蘇糖醇(d池iotreitol)的溶液中。30°C下溫育該懸浮液15分鐘，離心，并將細(xì)胞重懸于10ml含有1.2M山梨糖醇、10mMNa2EDTA.0.1M檸檬酸鈉、pH05.8和2mgNovozymC3234的溶液中。將懸浮液在30。C下溫育30分鐘，通過離心收集細(xì)胞，在10ml1.2M的山梨糖醇和10mlCAS(1.2M山梨糖醇，10mMCaCl2,10mMTrisHC1(Tris=三(羥曱基(-氨基甲烷)pH:7.5)中洗滌，并重懸于2mlCAS中。為進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將1mlCAS-懸浮的細(xì)胞與約0.1mg質(zhì)粒DNA混合，且在室溫下放置15分鐘。加入1ml(20%聚乙二醇4000，10mMCaCl2,10mMTrisHC1，pH=7.5),并將混合物在室溫下再放置30分鐘。離心混合物，將沉淀重懸于0.1mlSOS(1.2M山梨糖醇，33%vlvYPD,6.7mMCaCl2)中并于30。C溫育2小時。之后離心懸浮液并將沉淀重懸于0.5ml的1.2M山梨糖醇中。之后，于52。C下加入6ml的上層瓊脂(Sherman等人，(1982),MethodsinYeastGenetics,ColdSpringHarborLaboratory的SC培養(yǎng)基(含有1.2M山梨糖醇加2.5%瓊脂))，之后將懸浮液倒入含有相同的瓊脂固化的含山梨糖醇培養(yǎng)基平板頂部上。實施例1構(gòu)建Al8Q-胰島素的酵母表達(dá)系統(tǒng)圖1顯示名為pSA50的酵母質(zhì)粒。該質(zhì)粒含有表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含插入到質(zhì)粒的哞酒糖酵母TPI基因的轉(zhuǎn)錄啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的五coRI—X6al片段。在質(zhì)粒pSA50中，五coRI-X6al片段編碼由MFal*前前導(dǎo)序列原、二元加工內(nèi)肽酶KEX2的Lys-Arg切割位點、和胰島素前體B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q組成的融合產(chǎn)物。按照下述構(gòu)建包含編碼胰島素前體B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的序列的DNA片段。將2.5pmol寡核普酸ASA-SCI-2(對應(yīng)于圖2中的序歹'j1279-1358)和SCI-kex2-3(對應(yīng)于圖2中的序列1425-1337——反向引物)混合入含有10X高保真緩沖液、2.5mMdNTP、1^1高保真聚合酶和76nlH20的PCR反應(yīng)物中。一個循環(huán)(94。C下30秒，50。C下30秒，72。C下l分鐘)后，加入100pmol寡核苷酸ASA-SCI1(對應(yīng)于圖2中的1252-1301)和ASA誦SCI-7(對應(yīng)于序列1464-1407——反向引物)后進(jìn)行如上的9個循環(huán)。所得PCR片段用Roche的PCR純化試劑盒純化，用Ncol和Xbal消化，并最終在瓊脂糖凝膠上跑電泳并用GFX-PCR凝膠帶純化試劑盒(AmershamBiosciences#27-9602-01)純化。將片段與來自上述("通用程序")C-POT型表達(dá)載體的Ncol-Xbal載體片段相連。使表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中增殖，在存在氨千青霉素的條件下生長，并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離(Sambrook等人，1989)。利用適宜的限制性核酸酶(例如，EcoRI,M:ol，檢查質(zhì)粒DNA中的插入片段，并通過序列分析顯示包含正確胰島素前體B(l-3O)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q序列(圖2)。將質(zhì)粒pSA50轉(zhuǎn)化入啤酒糖酵母菌抹MT663。通過在YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖)瓊脂(2%)平板上作為碳源的葡萄糖利用選擇攜帶質(zhì)粒pSA50的酵母轉(zhuǎn)化體，并將所得菌抹命名為ySA63。實施例2人胰島素類似物的生產(chǎn)采用與實施例1中所述方法相應(yīng)的方法制備含編碼特定人胰島素類似物的DNA的質(zhì)粒。如實施例1所述用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母菌林并分離轉(zhuǎn)化體。所有的胰島素類似物前體均有C-肽KRDGLGKR(SEQIDN0:9)。將用表達(dá)胰島素類似物的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的啤酒糖酵母菌抹MT663接種到5ml由以下組成的培養(yǎng)基中5g/L(NH4)2S04、184mg/L(NH4)2HP04、2.88g/LKH2P04、1.42g/LMgS047H20、1.28g/L、K2S04、10.00g/L琥珀酸、10.00g/L水解酪蛋白氨基酸、0.0112g/LFeS047H20、0.0086g/LMnS04H20、0.0014g/LCuS04.5H20、0.00185g/LZnS047H20、0.0129g/LCaC12.2H20、0.071g/L檸檬酸、28.0mg/Lm誦肌醇、14.0mg/L氯化膽堿、2.8mg/L硫胺素、2.8mg/L煙酰胺、2.1mg/LCa-泛酸、0.14mg/L生物素、0.14mg/L葉酸、40g/L葡萄糖。30。C下培養(yǎng)3天。離心后，取出上清液以進(jìn)行定量HPLC分析，通過該方法測量分泌的胰島素類似物濃度。通過LC/MS分析確定胰島素類似物的特性。產(chǎn)量(mg/1)示于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例3補料分批發(fā)酵將表達(dá)B(l-30)-KRDGLGKR-(A1-21),A18Q的啤酒糖酵母菌抹ySA63接種到由酵母提取物(Difco):20g/L和蛋白胨(Bacto):10g/L和60g/L葡萄糖和0.1mL消泡劑(PEO/PPO嵌段共聚物)組成的培養(yǎng)基中。加熱滅菌前將培養(yǎng)基的pH調(diào)至6.5-6.6。將葡萄糖分開滅菌，并加入其余無菌組分中。將200mL培養(yǎng)物(于500mL三角瓶中)于30。C下在定軌搖床上及于250rpm溫育16-30小時。將50mL搖瓶培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有1.2L由下述組成的生長培養(yǎng)基的發(fā)酵罐50g/L液體酵母提取物(50%干物質(zhì))、3.6g/LKH2P04、2.3g/LK2S04、1.5g/LMgS04'7H20、0.064g/KFeS04.7H20、0.016g/LMnS04.H20、0.011g/LCuS04.5H20、0.016g/LZnS04'7H20、0.8g/L斗寧檬酸、2g/Lm-肌醇、0.2g/L氯化膽堿、0.2g/L鹽酸硫胺素、0.1g/L鹽酸吡。多醇、0.2g/L煙酰胺、1g/LCa-泛酸、0.005g/L生物素、0.05g/L對氨基苯甲酸、0.66mL/L消泡劑(PEO/PPO嵌段共聚物)和21g/L葡萄糖。除葡萄糖之外的所有組分均加熱滅菌。將葡萄糖單獨滅菌且加入發(fā)酵罐。30。C下培養(yǎng)，其中pH設(shè)定點為5.9,且通氣速率為lvvm。通過加入NH40H來使培養(yǎng)基pH保持在調(diào)定點。對溶解氧與廢氣組成(氧、二氧化碳和乙醇)共同進(jìn)行監(jiān)控。發(fā)酵過程從持續(xù)23小時的分批生長階段開始，該過程中發(fā)酵消耗葡萄糖，之后在之前形成的乙醇上進(jìn)行需氧分批生長。隨后，當(dāng)廢氣中的乙醇水平開始下降時，開始添加由50%(w/w)葡萄糖組成的物料溶液。物料添加速率遵循圖3所示的曲線，包括為將廢氣中的乙醇水平維持在250ppm以下進(jìn)行人工調(diào)節(jié)。在該過程期間，通過測量稀釋的發(fā)酵樣品在600nm處的光密度來監(jiān)控生長。利用HPLC對樣品的胰島素濃度進(jìn)行定量，所述樣品為用酸性乙醇(552g乙醇、340g去離子水和5mL濃疏酸)以1:1體積比稀釋并以3000-5000xg離心的。計算每升發(fā)酵液體培養(yǎng)基中的胰島素濃度時，包括了對由酵母細(xì)胞所占的體積的校正，其中假定沉淀中細(xì)胞為菱形包裝(rhombicpackaging)。所報告的胰島素濃度包括完整胰島素和desB30胰島素。69小時后停止添加葡萄糖溶液，但在收獲產(chǎn)物之前再繼續(xù)發(fā)酵4小時。光密度和胰島素濃度相對時間作圖示于圖4，其顯示37mg/L發(fā)酵液體培養(yǎng)基的最終胰島素濃度。權(quán)利要求1.通過培養(yǎng)含有編碼人胰島素類似物前體的DNA載體的真菌細(xì)胞來制備成熟人胰島素類似物的方法，其中所述前體含有連接肽，在所述連接肽兩側(cè)與胰島素肽A-和B-鏈的兩個接點處分別帶有切割位點，所述切割位點在真菌細(xì)胞內(nèi)被切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌正確加工的成熟、雙鏈人胰島素類似物。2.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述切割位點是Kex2切割位點。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述連接肽中對于與A-鏈接近的切割位點倒數(shù)第二位的氨基酸殘基選自Leu、Ile、Tyr、Arg、Lys、His、Pro、Met、Val、Ala和Phe。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述氨基酸殘基選自Leu和Ile。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的方法，其中所述連接肽的大小為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3畫16、3-15、3-14、3畫13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述胰島素類似物具有在A8、B10、A18和A14位中至少之一的突變。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述突變選自Asp、Glu、His、Gln和Arg。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述胰島素類似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰島素。9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其中該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約20至約50mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。10.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其中該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約20至約80mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。11.根據(jù)權(quán)利要求1-8的方法，其中該真菌細(xì)胞能夠向培養(yǎng)基中分泌至少約100mg/L正確加工的成熟雙鏈人胰島素類似物。12.根據(jù)權(quán)利要求1-11的方法，其中所述真菌細(xì)胞是酵母細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求l的方法，其中所述人胰島素前體類似物具有氨基酸序列B(l-30)-X-X-Z-Y-Y-A(1-21)其中B(l-30)是人胰島素B-鏈或其類似物，A(1-21)是人胰島素A-鏈或其類似物，各X和各Y各自獨立為Lys或Arg或Ypsl位點，且Z為1至約35個氨基酸殘基的肽序列，附帶條件是人胰島素A-和/或B-鏈中至少一個天然氨基酸殘基突變?yōu)榱硪粋€氨基酸殘基。14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中Z的大小為3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3國9、3-8、3-7、3-6、3-5或3-4個氨基酸殘基。15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中X-X和Y-Y均為Kex2位點。16.編碼具有以下氨基酸序列的胰島素前體的DNA序列B(l-30)-X曙X-Z-Y-Y-A(l-21)其中，B(l-30)是人胰島素B-鏈或其類似物，A(l-21)是人胰島素A-鏈或其類似物，各X和各Y各自獨立為Lys或Arg或Ypsl位點，且Z為1至約35個氨基酸殘基的肽序列，附帶條件是人胰島素A-和/或B-鏈中至少一個天然氨基酸殘基突變?yōu)榱硪粋€氨基酸殘基。17.含有根據(jù)權(quán)利要求16的DNA序列的表達(dá)載體。18.用根據(jù)權(quán)利要求17的載體轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明涉及通過培養(yǎng)含有編碼人胰島素類似物前體的DNA載體的真菌細(xì)胞來制備人胰島素類似物的方法，其中所述前體含有連接肽，在所述連接肽兩側(cè)與胰島素肽A-和B-鏈的兩個接點處分別帶有切割位點，所述切割位點在真菌細(xì)胞內(nèi)被切割，從而允許細(xì)胞向培養(yǎng)基中分泌大量正確加工的成熟、雙鏈人胰島素類似物。文檔編號C07K14/62GK101243190SQ200680029943公開日2008年8月13日申請日期2006年8月15日優(yōu)先權(quán)日2005年8月16日發(fā)明者A·S·安德森,L·H·克里斯滕森申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司