一種地特胰島素結(jié)晶的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及人胰島素類似物結(jié)晶的制備方法，特別涉及一種地特胰島素結(jié)晶的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們生活質(zhì)量水平大幅度的提高，糖尿病患者的數(shù)量也急劇增長(zhǎng)。根據(jù)最新調(diào)查報(bào)告顯示，中國(guó)糖尿病患者持續(xù)增加，至2013年，成人糖尿病患病率接近12%，糖尿病患者人數(shù)突破I億，位居全球第一位。糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷后/或其生物效應(yīng)降低(胰島素抵抗)引起的以高血糖為特征的慢性全身代謝性病癥。慢性高血糖將導(dǎo)致人體多組織，尤其是眼、腎、神經(jīng)及心血管的長(zhǎng)期損害，功能不全和衰竭，危害性極大。
[0003]胰島素治療一直被公認(rèn)為是治療糖尿病以及控制糖尿病患者血糖的重要手段。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程的發(fā)展，20世紀(jì)90年代末，人們?cè)趯?duì)胰島素結(jié)構(gòu)和成分的深入研宄中發(fā)現(xiàn)，對(duì)肽鏈進(jìn)行修飾有可能改變胰島素的理化和生物學(xué)特征，從而能研制出較傳統(tǒng)人胰島素更適合人體生理需要的胰島素類似物(Insulin analog)。人胰島素類似物的出現(xiàn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)人胰島素的局限性，滿足不同糖尿病患者的治療需求。
[0004]地特胰島素作為新一代的長(zhǎng)效可溶性胰島素類似物，是第一個(gè)采用化學(xué)修飾的方法獲得的胰島素類似物，即將人胰島素天然排列在B30位的蘇氨酸去掉后，通過?；磻?yīng)，在B29位的賴氨酸ε氨基上結(jié)合一個(gè)14碳脂肪酸鏈(肉豆蔻酸)。一方面，這14碳脂肪酸側(cè)鏈可使地特胰島素在皮下注射后形成雙六聚體而延緩吸收，同時(shí)還與皮下組織的的白蛋白可逆性結(jié)合，進(jìn)一步減緩入血速度；另一方面，地特胰島素在進(jìn)入外周血循環(huán)后，98%與白蛋白可逆性結(jié)合，靶器官分布也延緩。這些特點(diǎn)使地特胰島素的作用時(shí)間長(zhǎng)達(dá)24小時(shí)。在多個(gè)國(guó)家的研宄學(xué)者發(fā)布的地特胰島素最新研宄結(jié)果中顯示，地特胰島素與其他胰島素相比，具有長(zhǎng)效降糖作用的同時(shí)，糖尿病患者用后出現(xiàn)低血糖較少，且還具有獨(dú)特的減少體重增加的作用。
[0005]以固態(tài)晶體形式存在的胰島素，相比較于不定形固體粉末以及溶液狀態(tài)的形式，對(duì)于產(chǎn)品穩(wěn)定性、貯存性能等均較為有優(yōu)勢(shì)。因此，亟需一種有效能將地特胰島素結(jié)晶的方法。中國(guó)專利CN2 01110118 O 2 6.2公開了一種長(zhǎng)效胰島素類似物一甘精胰島素(GlyA21-ArgB31-ArgB32-人胰島素)的結(jié)晶方法:在室溫條件下，制備含2.8?3.2g/L甘精胰島素、體積分?jǐn)?shù)為10?30%的乙醇、體積分?jǐn)?shù)為0.01?0.2%的苯酚、0.4?0.6M乙酸、70?100mg/L氯化鋅、0.3?0.4M氯化鈉的結(jié)晶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0?8.5，將結(jié)晶液溫度降至2?8°C，調(diào)節(jié)pH值至7.1?7.8，結(jié)晶3h。本發(fā)明發(fā)明人參照此專利中的實(shí)施例1和實(shí)施例2進(jìn)行了地特胰島素結(jié)晶的制備，未能得到地特胰島素結(jié)晶。應(yīng)用甘精胰島素結(jié)晶的制備方法進(jìn)行地特胰島素結(jié)晶，地特胰島素只能形成沉淀。根本原因在于甘精胰島素與地特胰島素是兩種分子結(jié)構(gòu)完全不同的胰島素，物理化學(xué)性質(zhì)差異大。甘精胰島素是將人胰島素的A21突變并添加B31和B32位氨基酸形成的，即GlyA21-ArgB31_ArgB32-人胰島素，其等電點(diǎn)變?yōu)?.7左右，在中性pH條件下微溶。而地特胰島素是用脂肪酸鏈酰化修飾去(B30)人膜島素得來的膜島素類似物，即賴氨酸B29 (Νε-十四燒酰)去(Β30)人膜島素，其疏水性增強(qiáng)，等電點(diǎn)約為5.0至6.0，但在中性pH條件下澄清易溶。其次由于甘精胰島素難溶于中性PH條件，因此結(jié)晶中使用了大量的有機(jī)酸作為溶解緩沖體系，但這反而不利于地特胰島素結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定?？梢姡靥匾葝u素的結(jié)晶對(duì)于PH，緩沖鹽，離子強(qiáng)度，溶液組成等與其他胰島素相比有著完全不同的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種地特胰島素結(jié)晶的制備方法。該方法能更好的與上游工藝銜接(可從干燥/凍干固體粉末樣品或者純化收集的液體樣品中直接制備地特胰島素結(jié)晶)；該方法獲得的地特胰島素結(jié)晶具有均一穩(wěn)定的固體形態(tài)，沉降體積小，易于與上清分離(可采用離心或抽濾的方式)，凍干時(shí)間短，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種地特胰島素結(jié)晶的制備方法，包括如下步驟:在0.1?0.2M檸檬酸三鈉體系，并且含體積百分比5?10%的有機(jī)溶劑的條件下，從含有地特胰島素、鋅離子、酚類物質(zhì)及一定鹽濃度的結(jié)晶液中，在PH8.0?8.5的條件下使地特胰島素結(jié)晶。
[0008]所述的地特胰島素結(jié)晶的制備方法，優(yōu)選包含如下步驟:
[0009](I)配制含0.1?0.2M檸檬酸三鈉、I?6g/L地特胰島素、體積百分比5?10%的有機(jī)溶劑、0.05?0.5M鹽、質(zhì)量體積百分比0.005%?0.2%的酚類物質(zhì)的結(jié)晶液；調(diào)節(jié)pH值至8.5?9.0，加入鋅離子；
[0010](2)調(diào)節(jié)含鋅離子的結(jié)晶液的pH值至8.0?8.5，結(jié)晶3?6小時(shí)；
[0011](3)然后在2?8°C條件下靜置結(jié)晶12?24小時(shí)，得到地特胰島素結(jié)晶。
[0012]步驟(I)和(2)宜在室溫條件下進(jìn)行；室溫條件指的是10?30°C，優(yōu)選為15?28。。。
[0013]所述的檸檬酸緩三鈉體系是地特胰島素形成結(jié)晶至關(guān)重要的條件。發(fā)明人經(jīng)實(shí)驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，在沒有檸檬酸三鈉的結(jié)晶體系下，地特胰島素只能形成無固定形態(tài)的沉淀，無法形成結(jié)晶；所述的檸檬酸三鈉在所述的結(jié)晶液中的濃度優(yōu)選為0.1?0.15M。
[0014]所述的有機(jī)溶劑的濃度是地特胰島素形成結(jié)晶的重要參數(shù)之一。與其他胰島素相比，由于地特胰島素在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，疏水性較強(qiáng)，導(dǎo)致其在水相中的溶解度較差，在結(jié)晶液中需要加入一定體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑以增強(qiáng)其溶解性質(zhì)。發(fā)明人經(jīng)試驗(yàn)研宄發(fā)現(xiàn)，在沒有加入有機(jī)溶劑的條件下，地特胰島素只能形成無固定形態(tài)的沉淀，無法形成晶體；而有機(jī)溶劑濃度的過度增加又會(huì)使地特胰島素溶解度增加，以致無法達(dá)到利于結(jié)晶析出的過飽和狀態(tài)；只有在含體積分?jǐn)?shù)5?10%有機(jī)溶劑的結(jié)晶液中，地特胰島素才能形成結(jié)晶。所述的有機(jī)溶劑為乙腈、乙醇和異丙醇中的一種或至少兩種，其中優(yōu)選的有機(jī)溶劑為乙腈，結(jié)晶液中有機(jī)溶劑的濃度優(yōu)選為體積百分比7?10%。
[0015]所述的地特胰島素可以為干燥/凍干固體粉末或純化收集的液體樣品中的一種；其制備方法可參照專利W098/02460或CN94193852中披露的方法進(jìn)行；所述的地特胰島素在所述的結(jié)晶液中的濃度為I?6g/L，優(yōu)選2?4g/L。
[0016]所述的鋅離子可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的鋅鹽，其中優(yōu)選的鋅鹽是乙酸鋅、氯化鋅、溴化鋅、碘化鋅、氧化鋅和硫酸鋅中的一種或至少兩種，更優(yōu)選為乙酸鋅。所述的鋅離子的用量按鋅離子與地特胰島素按摩爾比(1.5?7):1計(jì)，優(yōu)選為(2.5?4):1。
[0017]所述的酚類物質(zhì)選自苯酚、間甲苯酚、鄰甲苯酚、對(duì)甲苯酚、間苯二酚和對(duì)羥基苯甲酸甲脂中的一種或至少兩種，更為優(yōu)選苯酚。所述的酚類物質(zhì)在所述的結(jié)晶液中濃度為質(zhì)量體積百分(g/mL)比0.005?0.2%，優(yōu)選0.03?0.07%。
[0018]所述的鹽選自氯化鈉、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽和乙酸銨中的一種或至少兩種。所述的鹽在所述的結(jié)晶液中的濃度為0.05?0.5M，優(yōu)選為0.25?0.5M ;其中優(yōu)選的鹽為乙酸銨和氯化鈉組合，優(yōu)選鹽的濃度為乙酸銨0.05M?0.1M、氯化鈉0.2M。
[0019]本發(fā)明結(jié)晶體系中，pH值的調(diào)節(jié)也是關(guān)鍵之一。在加入鋅鹽時(shí)，會(huì)導(dǎo)致結(jié)晶液體系的PH值降低，若pH值降低至7.8或以下，會(huì)導(dǎo)致地特胰島素在結(jié)晶液中形成無固定形態(tài)的沉淀。發(fā)明人研宄發(fā)現(xiàn)，一旦地特胰島素在結(jié)晶液中形成沉淀，就難以再溶解澄清；因此，在加入鋅鹽之前，可將結(jié)晶液pH值調(diào)節(jié)至結(jié)晶pH值以上(8.5?9.0，優(yōu)選為8.5?8.7)，加入鋅鹽后再調(diào)節(jié)至結(jié)晶需要的PH值(8.0?8.5)。本發(fā)明所述的結(jié)晶液的pH值可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的酸