Ubq10和gapdh作為水稻條紋病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明運(yùn)用geNorm和NormFinder軟件鑒定了感水稻條紋病毒（Rice strip virus，RSV)植株中熒光定量PCR的內(nèi)參基因組合，UBQ 10和GAPDH作為RSV侵染植株中基 因功能分析的雙內(nèi)參基因，明顯優(yōu)于單個(gè)內(nèi)參基因的校正效果，可應(yīng)用于RSV侵染植株基 因功能研宄，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】：
[0002] 水稻條紋葉枯病，病原為水稻條紋病毒，是一種由介體昆蟲(chóng)灰飛虱以持久性經(jīng)卵 方式傳毒。水稻感染RSV后引起死苗，減產(chǎn)嚴(yán)重，除水稻外，還危害小麥等作物。20世紀(jì)60、 90年代后期該病害在華北、華東等地暴發(fā)成災(zāi)，近年來(lái)，感病品種的廣泛種植及稻麥輪作方 式的推廣和冬季氣候變暖等環(huán)境條件的變化使傳毒介體灰飛虱的發(fā)生量不斷上升，導(dǎo)致該 病害在華東稻區(qū)大面積發(fā)生。迄今為止，幾乎沒(méi)有能有效防治病毒病的化學(xué)藥劑，治蟲(chóng)防病 的應(yīng)急措施無(wú)法作為一項(xiàng)長(zhǎng)期策略，而研宄寄主在病毒侵染后基因的功能進(jìn)而病害防控中 加以利用則是一種更為環(huán)保的手段。要獲得準(zhǔn)確和可靠的基因表達(dá)結(jié)果首先需要有用于 數(shù)據(jù)校正的內(nèi)參基因，也有利于不同研宄間數(shù)據(jù)的借鑒與比較。用于校正和標(biāo)準(zhǔn)化的內(nèi)參 基因必需在任何條件下是持續(xù)且穩(wěn)定的表達(dá)，否則就會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果，現(xiàn)有的研宄多以 THMl-Like等單個(gè)基因作為內(nèi)參基因，其在不同處理時(shí)可能會(huì)有穩(wěn)定性問(wèn)題，有必要盡快 確立一種合適的內(nèi)參基因體系以解決這一問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0003] 本發(fā)明針對(duì)上述研宄背景，以接種水稻條紋病毒的日本晴水稻為材料對(duì)常用的內(nèi) 參基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)UBQ 10和GAPDH是表達(dá)最穩(wěn)定的基因，以這兩個(gè)基因作為RSV侵染 后水稻中基因功能分析的內(nèi)參基因組合，明顯優(yōu)于單個(gè)內(nèi)參基因的校正效果。
[0004] 本發(fā)明所提供的水稻條紋病毒侵染植株中基因功能分析的雙內(nèi)參基因組合，是通 過(guò)以下方法獲得的：
[0005] 1)用熒光定量PCR的方法，對(duì)接種水稻條紋病毒的日本晴水稻以14對(duì)水稻中常用 內(nèi)參基因的表達(dá)及其相關(guān)引物的特異性進(jìn)行評(píng)估；
[0006] 2)運(yùn)用geNorm程序評(píng)估候選內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性；
[0007] 3)通過(guò)NormFinder軟件驗(yàn)證geNorm程序的運(yùn)算結(jié)果；
[0008] 4)依據(jù)geNorm程序可以計(jì)算引入一個(gè)新內(nèi)參基因后標(biāo)準(zhǔn)化因子的配對(duì)差異V值， 其默認(rèn)閾值為0.15。根據(jù)Vn/n+Ι比值可以判斷引入一個(gè)新內(nèi)參基因是否會(huì)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化因子 產(chǎn)生顯著影響，如果Vn/n+Ι大于0. 15,則需要再引入第n+1個(gè)內(nèi)參基因；如果Vn/n+Ι小于 0. 15,則不必再引入新的內(nèi)參基因；
[0009] 5) RSV侵染條件下熒光定量PCR多內(nèi)參和單內(nèi)參校正的數(shù)據(jù)分析比較，驗(yàn)證多內(nèi) 參基因的組合是否優(yōu)于單內(nèi)參基因。
[0010] 在RSV侵染的條件下鑒定的用于校正熒光定量PCR最合適的內(nèi)參基因 UBQ 10和 GAPDH的應(yīng)用范圍包括：RSV侵染植物中病毒的定量；RSV侵染植株中相關(guān)基因的表達(dá)分析 以及RSV侵染植株模式的研宄。
[0011] 本發(fā)明能為在RSV侵染植株中獲得準(zhǔn)確和可靠的基因表達(dá)結(jié)果提供理論依據(jù)，其 結(jié)果可以用于研宄RSV侵染植株基因功能。
【附圖說(shuō)明】：
[0012] 圖1熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性分析。㈧候選內(nèi)參基因的溶解曲線圖，實(shí)驗(yàn)有三 次生物學(xué)重復(fù)，溶解曲線呈單峰；(B)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)候選內(nèi)參基因擴(kuò)增的特性條 帶；(C) 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；
[0013] 圖2候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平分析。㈧14個(gè)候選內(nèi)參基因的平均Ct值；(B)比 較RSV侵染植株與對(duì)照（不侵染）植株中14個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平，注：Ct values : Ct值；
[0014] 圖3 RSV侵染條件下熒光定量PCR內(nèi)參基因的geNorm分析，注：Average expression stability values (M):內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性平均值（M)，pairwise variation (V):配對(duì)差異值（V);
[0015] 圖4 RSV侵染條件下焚光定量PCR內(nèi)參基因的NormFinder分析，注：Average expression stability values (M):內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性平均值（M);
[0016] 圖5 RSV侵染條件下OsPRlb和OsWRKY基因表達(dá)在多內(nèi)參或單內(nèi)參條件下的數(shù)據(jù) 分析比較，注：Relative expression levels:相對(duì)表達(dá)水平。
【具體實(shí)施方式】：
[0017] 下面實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0018] 實(shí)施例1，RSV侵染植株中基因功能分析內(nèi)參基因組合的獲得
[0019] 1、植物材料、病毒分析以及侵染方法
[0020] 水稻種子（日本晴）首先用0· 1% HgCl2消毒1小時(shí)；然后用去離子水沖洗干凈， 25°C浸種一天，催芽一天；催芽后的種子用木村B培養(yǎng)液中培養(yǎng)，光照14小時(shí)，黑暗10小 時(shí)，溫度28±1°C。
[0021] 2005年4-5月從江蘇海安重病區(qū)中采集灰飛虱若蟲(chóng)，在感病品種武育粳3號(hào)上進(jìn) 行飼養(yǎng)，交配后單頭雌蟲(chóng)單獨(dú)產(chǎn)卵，再采用斑點(diǎn)免疫結(jié)合法檢測(cè)雌蟲(chóng)帶毒情況，保留帶毒雌 蟲(chóng)的后代，飼養(yǎng)2-3代后獲得灰飛虱群體，選擇帶毒率大于50 %的群體分別飼養(yǎng)，獲得RSV 傳毒介體灰飛虱群體H，連續(xù)5代監(jiān)測(cè)其群體帶毒率均大于50%。
[0022] 接種前每批蟲(chóng)中隨機(jī)取出100頭經(jīng)DIBA方法（江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004,（I) :50-51) 測(cè)定其帶毒率，用于測(cè)算有效接種蟲(chóng)量[有效接種蟲(chóng)量（蟲(chóng)）=接種蟲(chóng)量（蟲(chóng)）X帶毒率 (% )]。14天大小的幼苗按有效接種蟲(chóng)量4頭/苗接種灰飛虱；接毒3天后，移除灰飛虱， 將幼苗移栽到大田中；取接病毒后7、14、21天的水稻葉片保存在-80°C冰箱中做后續(xù)研宄 (RT-PCR方法確認(rèn)侵染是否成功）。
[0023] 2、RNA 提取
[0024] 總RNA按照說(shuō)明書(shū)用Trizol提取，并用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和質(zhì) 量。只有260/280的比值在I. 9和2. 1之間且260/230的比值大于2. O的RNA可以用作后 續(xù)的實(shí)驗(yàn)。RNA的完整性用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有的樣品都標(biāo)準(zhǔn)化到同一濃度，用于后 續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0025] 3、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR分析
[0026] 用2 μ g的總RNA作為模板，oligo (dT)作為引物，M-MLV為反轉(zhuǎn)酶合成 cDNA。熒