專利名稱：蛋白表達系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般性地涉及用于提高基因，例如編碼目的蛋白質(zhì)的異源基因，在植物和 其它真核生物細(xì)胞內(nèi)表達的方法和材料，特別是源自病毒的序列。
背景技術(shù)：
豇豆花葉病毒屬病毒(comoviruses，CPMV)豇豆花葉病毒屬是具有二分體(bipartite)基因組的RNA病毒。豇豆花葉 病毒RNA基因組的節(jié)段稱作RNA-1和RNA-2。RNA-1編碼VPg、復(fù)制酶和蛋白酶蛋白 (L0m0n0SS0ff&ShankS，1983)。復(fù)制酶是病毒復(fù)制病毒基因組需要的。豇豆花葉病毒屬的 豇豆花葉病毒(CPMV)的RNA-2編碼一個58K和一個48K的蛋白質(zhì)，以及兩個病毒衣殼蛋白 L 禾口 So所有豇豆花葉病毒RNA-2的翻譯起始于兩個不同的起始位點，它們位于相同的三 聯(lián)閱讀框內(nèi)，最終合成兩種共羧基端蛋白質(zhì)(carboxy coterminalproteins) 0這種雙起始 現(xiàn)象的發(fā)生是翻譯期間核糖體“遺漏掃描(leakyscarming)，，的結(jié)果。CPMV RNA-2的5，端起始密碼子(AUG)出現(xiàn)在位置115、161、512和524。位置161 和512位的起始密碼子處于相同的三聯(lián)閱讀框內(nèi)。從161位的起始密碼子起始則合成一 個105K的多聚蛋白(polyprotein)，而從512位的起始密碼子起始則合成一個95K的多聚 蛋白。因為這兩種多蛋白質(zhì)的合成在3299位的相同終止密碼子處終止，所以105K和95K 蛋白質(zhì)是共羧基端的。如果512位的AUG被刪除，那么524位的AUG密碼子可以作為起始 子。然而，在AUG 512存在時，它不發(fā)揮這一功能，而只是編碼氨基酸甲硫氨酸(Holness et al.，1989 ；ffellink et al.，1993)。115位的起始密碼子不是病毒復(fù)制必需的(Wellink et al.，1993)。由CPMV RNA-2基因組節(jié)段編碼的105K和95K蛋白質(zhì)是主要的翻譯產(chǎn)物，它們隨 后被RNA-1編碼的蛋白水解活性切割，產(chǎn)生所述的58K或48K蛋白質(zhì)(這取決于所處理的 是105K還是95K蛋白質(zhì))和兩個病毒衣殼蛋白，L和S。在CPMV的512位的起始密碼子處 起始翻譯比在161位更加高效，從而產(chǎn)生比105K多蛋白質(zhì)更多的95K多蛋白質(zhì)。CPMV RNA-2的115位的起始密碼子位于161位和512位起始位置的上游，并處于 另一閱讀框內(nèi)。因為該起始密碼子與位置175處的種子密碼子同相(in-phase)，所以在該 位點起始應(yīng)可產(chǎn)生一條20個氨基酸的肽。然而，迄今尚未發(fā)現(xiàn)這種肽的產(chǎn)生。保持不同AUG之間合框的必要性突變實驗已經(jīng)顯示，保持CPMV RNA-2位置161和512處的起始位點之間合框 對于由RNA-1編碼的復(fù)制酶高效復(fù)制RNA-2是至關(guān)重要的(Holness et al.，1989 ；van Bokhoven et al. , 1993 ；Rohll et al. , 1993 ；ffellink etal.，1993)。在基于 CPMV RNA-2 的表達載體(見下文)中，這種要求限制了 512位起始密碼子上游可插入的序列的長度，使 得將外來基因克隆進入這種載體比理想情況下更難。例如無法使用多接頭(polylinker)， 因為使用多接頭往往會改變這些起始位點之間的開放閱讀框(0RF)。CPMV 載體
人們已經(jīng)使用CPMV作為開發(fā)適合于在植物內(nèi)產(chǎn)生異源多肽的載體系統(tǒng)的基礎(chǔ) (Liu et al. ,2005 ；Sainsbury et al.，2007)。這些系統(tǒng)是基于RNA-2的修飾，但是在使用 全長型RNA-2還是缺失型的RNA-2上有所不同。然而在兩種情況下，都可通過與RNA-I共 溫育(co-inoculation)實現(xiàn)經(jīng)修飾的RNA-2的復(fù)制。基于全長型RNA-2的表達系統(tǒng)包括 將外來蛋白質(zhì)融合到RNA-2來源多蛋白質(zhì)的C端。N端多蛋白質(zhì)的釋放由來自口蹄疫病毒 2A催化肽序列的作用介導(dǎo)(Gopinath et al.，2000)。最終的RNA-2分子能夠在植物內(nèi)部 和植物之間傳播。這種策略已經(jīng)被用于在豇豆植物體內(nèi)表達許多種重組蛋白質(zhì)，例如乙型 肝炎核心抗原(HBcAg)和小免疫蛋白(Small Immune Protein) (SIPs)。(Mechtcheriakova et al. ,2006 ；Monger et al. ,2006 ；Alamillo et al.，2006)。盡管全長病毒載體的利用取 得了成功，但是在插入序列大小的限制，以及對生物防護的關(guān)切方面尚有不足。為了解決這些問題，最近開發(fā)出了基于缺失型CPMV RNA-2的系統(tǒng)(Cafiizares et al.，2006)。在該系統(tǒng)中，編碼運動蛋白和兩種衣殼蛋白的RNA-2區(qū)域被除去。然而，經(jīng) 缺失的分子仍然具有RNA-I編碼的復(fù)制酶進行復(fù)制必需的順式作用序列，因此保持了高水 平的基因擴增，但經(jīng)過修飾的病毒沒有污染環(huán)境的污染問題。除了 RNA-I之外，通過在接種 體(inoculum)中進一步引入基因沉默的抑制子，例如來自PVY的HcPro (Brigneti et al.， 1998)，經(jīng)缺失的CPMV載體可用作瞬時表達系統(tǒng)(W0/2007/135480) (Bipartite System, Method And Composition For The Constitutive And Inducible Expression OfHigh Levels Of Foreign Proteins In Plants ；同見 Sainsbury 等，2009)。然而，與使用基于全 長RNA-2的載體的情況相對，復(fù)制被限制于被接種的葉子。這些CPMV載體已經(jīng)用于表達由 單一類型多肽構(gòu)成的多鏈復(fù)合體。基于全長或刪節(jié)版本CPMV RNA-2的載體的多個拷貝已經(jīng)顯示適合于在植物內(nèi)產(chǎn) 生異聚體(heteromeric)蛋白(Sainsbury et al. ,2008) 人們已經(jīng)利用在RNA-1存在 下將兩種含有不同標(biāo)記基因的全長RNA-2構(gòu)建體共滲透(Co-infiltration)到本氏煙草 (Nicotiana benthamiana)中，來顯示兩個外來蛋白可以在所接種組織的相同細(xì)胞內(nèi)高效 表達。而且，蛋白質(zhì)可以被共定位到相同的亞細(xì)胞器，這是形成異聚體至關(guān)重要的先決條 件。人們也已經(jīng)研究了不同CPMV RNA-2載體對于植物內(nèi)表達異聚體蛋白的適用性。將 IgG重鏈和輕鏈插入到全長和缺失型RNA-2中，兩種方法均顯示全長IgG分子在被接種的組 織內(nèi)積累，但使用缺失型RNA-2載體的水平顯著更高。因此，全長RNA-2構(gòu)建體的全身擴散 的能力似乎與異聚體蛋白的產(chǎn)生無關(guān)，并且使用缺失型RNA-2明顯更有利，特別是因為它 們提供了生物防護方面的益處。因此，已知的基于CPMV的載體系統(tǒng)是在植物內(nèi)表達編碼目的蛋白的異源基因的 有用工具。然而，在現(xiàn)有技術(shù)中對于可提高所表達的異源蛋白質(zhì)的產(chǎn)量、改善載體的易用性 的最優(yōu)化的載體系統(tǒng)仍然存在需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，突變CPMV RNA-2載體的161位的起始密碼子可強烈提高由 插入在512位起始密碼子之后的基因編碼的蛋白質(zhì)的表達水平。與唯一差異在于161位的 起始密碼子完整的CPMV RNA-2載體表達的相同蛋白質(zhì)相比，蛋白質(zhì)表達水平增加了大約20-30倍(Sainsbury and Lomonossoff，2008)。本發(fā)明允許產(chǎn)生高水平的外來蛋白質(zhì)，而
不需要病毒復(fù)制。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，通過突變161位的起始密碼子，不再需要保持161位突變的起始 密碼子與位置512處起始密碼子之間的框，因此允許在位置161處被突變的起始密碼子之 后插入任意長度的序列。這是特別有利的，因為它允許將任意長度的多接頭插入到RNA-2 載體被突變的起始密碼子之后，然后其可用于幫助將目的基因克隆到載體內(nèi)。此外，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，盡管蛋白表達增加，用161位包含突變起始密碼子的CPMV RNA-2載體轉(zhuǎn)化的植物看上去比用已知CPMV RNA-2載體轉(zhuǎn)化的植物更加健康，也就是，顯 示的壞死更少。植物的健康在蛋白質(zhì)植物表達中是一個重要的因素，因為健康的植物可存 活更長的時間。此外，植物健康在從植物純化蛋白中也是重要的，因為由于壞死而釋放的單 寧會干擾蛋白質(zhì)純化(Sainsbury and Lomonossoff, 2008) 因此，本發(fā)明涉及基于經(jīng)過修飾的二分體病毒序列的改良的蛋白質(zhì)產(chǎn)生系統(tǒng)和方 法。因此，在本發(fā)明的各種方面中，提供或利用了一種表達增強子序列，該序列源自 (或同源于)二分體RNA病毒(例如豇豆花葉病毒屬病毒)的RNA-2基因組節(jié)段，其中目標(biāo) 起始位點已突變。本發(fā)明進一步提供了用于增加源自二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的序列的表達 或翻譯增強活性的方法，該方法包括突變其中的目標(biāo)起始位點。本發(fā)明一些特殊的定義和實施方案現(xiàn)在將在下文更加詳細(xì)地說明。這里所說的“增強子”序列(或增強子元件)是源自(或同源于)二分體RNA病 毒(例如豇豆花葉病毒屬病毒)RNA-2基因組節(jié)段的序列，其中目標(biāo)起始位點已突變。這些 序列可以增強它們所連接的異源ORF的下游表達。不作為限定，認(rèn)為當(dāng)這些序列存在于被 轉(zhuǎn)錄的RNA中時，能夠增強其所連接的異源ORF的翻譯。這里所說的“目標(biāo)起始位點”是所述增強子序列所來源的二分體病毒(例如豇豆 花葉病毒屬病毒)野生型RNA-2基因組節(jié)段中的起始位點(起始密碼子)，其作為起始位 點用于產(chǎn)生(翻譯)由野生型RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共羧基末端蛋白質(zhì)中較長的一 個。如上所述，由CPMV RNA-2編碼的兩個共羧基末端蛋白質(zhì)中較長的一個一105K蛋 白質(zhì)一的產(chǎn)生，起始于野生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段的第161位處的起始位點。因此，源 自CPMV RNA-2基因組節(jié)段的增強子序列中的目標(biāo)起始位點是野生型CPMV RNA-2中第161 位的起始位點。第161位起始密碼子的周圍的突變可能與第161位起始密碼子自身的突變具有相 同(或相似)的效果，例如破壞該起始密碼子周圍的上下文可能意味著起始密碼子被繞過 的頻率更高。因此在本發(fā)明的一個方面中，目標(biāo)起始位點可以間接地被突變，即通過突變目標(biāo) 起始位點上游和/或下游的一個或多個核苷酸，但保留野生型目標(biāo)起始位點，其中突變這 些核苷酸的效果與當(dāng)目標(biāo)起始位點自身被突變時觀察到的效果是相同或者相似的。既然目標(biāo)起始位點是產(chǎn)生由野生型RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共羧基末端蛋 白其中較長一個的起始位點，那么由此可知該目標(biāo)起始位點與同一野生型RNA-2基因組節(jié)段上的第二個起始位點-其是產(chǎn)生由野生型RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共羧基末端蛋白 中較短一個的起始位點-同框(同相)。如果兩個起始位點位于同一個三聯(lián)閱讀框內(nèi)，則它 們是同框的(in-frame)。源自野生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段的增強子序列中的目標(biāo)起始位點，即第161位 的起始位點，與第512位的起始位點同框，第512位的起始位點是產(chǎn)生由野生型RNA-2基因 組節(jié)段編碼的兩個共羧基末端蛋白中較短的一個的起始位點。因此，目標(biāo)起始位點位于所述增強子序列所來源的野生型RNA-2基因組節(jié)段中的 第二個起始位點的上游(5’)，其中第二個起始位點是產(chǎn)生由野生型RNA-2基因組節(jié)段編碼 的兩個共羧基末端蛋白中較短的一個的起始位點。此外，目標(biāo)起始位點還可位于所述增強 子序列所來源的野生型RNA-2基因組節(jié)段的第三個起始位點的下游(3’)。在CPMV中，目 標(biāo)起始位點，即第161位的起始位點，位于第512位的第二起始位點(它是產(chǎn)生95K蛋白的 起始位點)的上游和第115位的第三起始位點的下游。因此，源自二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的增強子序列中的目標(biāo)起始位點是用于 產(chǎn)生由野生型RNA-2編碼的兩個共羧基末端蛋白的兩個起始位點中的第一個。在這個語境 中“第一個”是指靠近野生型RNA-2基因組節(jié)段5’端的那個起始位點。如果需要，序列中可以有多于一個起始位點被突變。例如，海可以刪除或改變位 于(或相應(yīng)于)第115位的“第三”起始位點。已經(jīng)證明，除了除去AUG 161之外，除去AUG 115 也可進一步增強表達(Sainsbury andLomonossoff，2008)。本發(fā)明的增強子序列是基于源自二分體RNA病毒RNA-2基因組節(jié)段的修飾序列。這里所稱的二分體病毒或具有二分體基因組的病毒可以是豇豆花葉病毒科 (Comoviridae)的成員。豇豆花葉病毒科的所有屬似乎都編碼兩個共羧基末端蛋白質(zhì)。豇豆 花葉病毒科的屬包括豇豆花葉病毒屬(Comovirus)、線蟲傳多角體病毒屬(Nepovirus)、蠶 豆萎蔫病毒屬(Fabavirus)、櫻桃銼葉病毒屬(Cheravirus)和矮縮病毒屬(Sadwavirus)。 豇豆花葉病毒屬包括豇豆花葉病毒(Cowpea mosaic virus，CPMV)、豇豆重花葉病毒 (Cowpea severe mosaic virus, CPSMV)、南瓜花葉病毒(Squash mosaic virus, SqMV)、紅 三葉草斑點病毒(Red clover mottle virus, RCMV)、菜豆莢斑點病毒(Bean pod mottle virus, BPMV)。優(yōu)選地，二分體病毒(或豇豆花葉病毒屬病毒)是CPMV。這些豇豆花葉病毒屬病毒的RNA-2基因組節(jié)段的序列和數(shù)種具體的病毒株可 以從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得，登錄號在括弧中列出豇豆花葉病毒RNA-2 (NC_003550)，豇豆重 花葉病毒RNA-2 (NC_003544)，南瓜花葉病毒RNA-2 (NC_003800)，南瓜花葉病毒Kimble 株RNA-2 (AF059533)，南瓜花葉病毒Arizona株RNA-2 (AF059532)，紅三葉草斑點病毒 RNA-2 (NC_003738)，菜豆莢斑點病毒RNA-2 (NC_003495)，菜豆莢斑點病毒K_Hopkinsl株 RNA-2 (AF394609)，菜豆莢斑點病毒K_Hancockl株RNA-2 (AF394607)，安第斯馬鈴薯斑駁病 毒(APMoV :L16239)和蘿卜花葉病毒(RaMV ；AB295644)。也有可得自菜豆粗縮豇豆花葉病 毒(BRMV ；AF263548)和豇豆花葉病毒屬的一個試探性成員一蕪菁輪點病毒(EF191015)的 部分RNA-2序列。源自豇豆花葉病毒科其它屬的許多序列也是可得的。迄今，所有已研究的豇豆花葉病毒屬病毒均顯示具有兩個可選擇的起始密碼子， 用于從其RNA-2基因組節(jié)段表達兩個共羧基端多蛋白質(zhì)。特別地，CPMV, CPSMV, BPMV, SqMV 和RCMV的RNA-2基因組節(jié)段已知包含兩個可選擇的起始密碼子，用于表達兩個共羧基端多蛋白質(zhì)。因此，可以通過本領(lǐng)域已知的方法鑒定其它豇豆花葉病毒屬病毒中與CPMV野生 型RNA-2節(jié)段第161位的起始位點等價的(即相應(yīng)的)目標(biāo)起始位點。例如，可以通過野生 型CPMV RNA-2基因組節(jié)段序列和另一種豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段序列之間 的序列比對來鑒定目標(biāo)起始位點。然后可以使用這種序列比對，通過鑒定出(至少在該比 對中)位于野生型CPMV RNA-2中第161位目標(biāo)起始位點附近或處于與野生型CPMV RNA-2 中第161位目標(biāo)起始位點相同位置的起始位點，來鑒定出該豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基 因組節(jié)段序列中的目標(biāo)起始位點。也可以通過確定擔(dān)任由該野生型豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段編碼的 兩條共羧基端蛋白質(zhì)中較長一個的合成的起始位點來鑒定其他豇豆花葉病毒屬病毒中的 目標(biāo)起始位點。這種方法還可用于和上述比對結(jié)合使用，也就是說，可以利用這種方法來確 認(rèn)通過與CPMV RNA-2比對方法鑒定的豇豆花葉病毒起始位點是目標(biāo)起始位點。當(dāng)然，上述方法還可用于鑒定其它豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段中與野 生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段中第512位起始位點等價的起始位點。不過，不是鑒定出擔(dān)任 由野生型豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩條共羧基端蛋白質(zhì)中較長一個 的合成的起始位點，而是鑒定出擔(dān)任由野生型豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段編碼 的兩條共羧基端蛋白質(zhì)中較短一個的合成的起始位點的起始密碼子。一旦鑒定了可能與CPMV RNA-2的第161和512位起始位點等價的兩個豇豆花葉 病毒屬病毒RNA-2起始位點，即可通過檢查這兩個起始位點是否同框，即處于同一三聯(lián)閱 讀框內(nèi)，來確認(rèn)目標(biāo)起始位點的鑒定結(jié)果，因為只有在這兩個起始位點同框的情況下，它們 才能擔(dān)任產(chǎn)生兩個共羧基端蛋白質(zhì)的起始位點。在本發(fā)明的一個實施方案中，增強子序列包括CPMV RNA-2基因組節(jié)段的核苷酸 1-512(見表1)，其中第161位的目標(biāo)起始位點已突變。在本發(fā)明的另一個實施方案中，增 強子序列包括來自另一種豇豆花葉病毒屬病毒的等價序列，其中與CPMV第161位起始密碼 子等價的目標(biāo)起始位點被突變。目標(biāo)起始位點可以通過替換、刪除或插入進行突變。優(yōu)選 地，目標(biāo)起始位點通過點突變加以突變。在本發(fā)明的一個可選擇的實施方案中，增強子序列包括豇豆花葉病毒屬病 毒 RNA-2 基因組節(jié)段序列的核苷酸 10-512，20-512，30-512，40-512，50-512，100-512， 150-512，1-514，10-514，20-514，30-514，40-514，50-514，100-514，150-514，1-511， 10-511,20-511,30-511,40-511,50-511,100-511,150-511,1-509,10-509,20-509, 30-509,40-509,50-509,100-509,150-509,1-507,10-507,20-507,30-507,40-507, 50-507，100-507，或150-507，并具有突變的目標(biāo)起始位點。在本發(fā)明的其他實施方案中， 增強子序列包括表1所示CPMV RNA-2基因組節(jié)段序列的核苷酸10-512，20-512，30-512， 40-512,50-512,100-512,150-512,1-514,10-514,20-514,30-514,40-514,50-514, 100-514，150-514，1-511，10-511，20-511，30-511，40-511，50-511，100-511，150-511， 1-509，10-509，20-509，30-509，40-509，50-509，100-509，150-509，1-507，10-507，20-507， 30-507，40-507，50-507，100-507，或 150-507，其中野生型 CPMVRNA-2 基因組節(jié)段中第 161 位的目標(biāo)起始位點被突變。在本發(fā)明進一步的實施方案中，增強子序列包括豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段序列的核苷酸 1-500，1-490，1-480，1-470，1-460，1-450，1-400，1-350，1-300， 1-250，1-200，或1-100，并具有突變的目標(biāo)起始位點。在本發(fā)明的可選擇的實施方案中，增強子序列包括表1所示CPMVRNA-2基因組 節(jié)段序列的核苷酸 1-500，1-490，1-480，1-470，1-460，1-450，1-400，1-350，1-300，1-250， 1-200，或1-100，其中野生型CPMVRNA-2基因組節(jié)段中第161位的目標(biāo)起始位點被突變。包括豇豆花葉病毒屬病毒RNA-2基因組節(jié)段序列至少100或200，至少300，至少 350，至少400，至少450，至少460，至少470，至少480，至少490，或者至少500個核苷酸并 具有突變的目標(biāo)起始位點的增強子序列也是本發(fā)明的實施方案。此外，包括表1所示CPMV RNA-2基因組節(jié)段序列的至少100或200，至少300，至 少350，至少400，至少450，至少460，至少470，至少480，至少490，或者至少500個核苷酸， 其中野生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段第161位的目標(biāo)起始位點已突變的增強子序列，也是本 發(fā)明的實施方案。本發(fā)明的可選擇的實施方案是與表1所示CPMV RNA-2基因組節(jié)段序列具有至少 99%，98%，97%，96%，95%，90%，85%，80%，75%，70%，65%，60%，55%，或 50% 同一 性，且其中野生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段第161位的目標(biāo)起始位點已突變的增強子序列。在指具體序列時，術(shù)語“百分比相似度”、“百分比同一性”和“百分比同源性”的用 法與Wisconsin大學(xué)GCG軟件程序中所述的相同。因此，增強子序列可以與表1所示CPMV RNA-2基因組節(jié)段序列的互補序列特異雜交，條件是與野生型CPMV RNA-2基因組節(jié)段中第 161位對應(yīng)的目標(biāo)起始位點被突變。詞語“特異雜交”是指兩條具有足夠互補序列的單鏈核酸分子之間的締合 (association)，從而允許這種雜交在本領(lǐng)域通常使用的預(yù)定條件下發(fā)生(有時稱作“基本 上互補”)。特別地，該術(shù)語是指寡核苷酸與本發(fā)明單鏈DNA或RNA分子內(nèi)含有的一段基本 上互補的序列雜交，從而基本上排除該寡核苷酸具有非互補序列的單鏈核酸的雜交?！盎?補”是指核酸序列通過堿基配對(A-G-T與互補序列T-C-A配對)的自然締合。兩條單鏈分 子間的互補可以是部分的-只有一些核酸對是互補的；或者是完全的-全部的堿基對都是 互補的?；パa的程度影響雜交和擴增反應(yīng)的效率和強度。本發(fā)明增強子序列中的目標(biāo)起始位點可以通過刪除、插入或替換加以突變，從而 使之不再發(fā)揮翻譯起始位點的功能。例如，可以在增強子序列目標(biāo)起始位點的位置處進行 點突變?；蛘?，可以將增強子序列中的目標(biāo)起始位點部分或完全刪除。例如，可以進行跨增 強子序列目標(biāo)起始位點的刪除。與該增強子所來源的野生型RNA-2基因組節(jié)段的序列相 比，跨起始位點的刪除的長度最多可以達5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個核苷酸。不希望受限于任何理論，CPMV第161位起始密碼子的突變被認(rèn)為可導(dǎo)致翻譯抑制 子失活，從而增強從位于該被失活翻譯抑制子下游的起始密碼子的翻譯起始。因此，本發(fā)明進一步提供了源自二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的增強子序列，其 中該增強子序列包括失活的翻譯抑制子序列。本發(fā)明進一步提供了用于增加源自二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的序列的表達 或翻譯增強活性的方法，該方法包括使其中的翻譯抑制子序列失活。如上面已經(jīng)提到的，CPMV RNA-2基因組節(jié)段第161位的起始位點的突變被認(rèn)為可 導(dǎo)致正常存在于CPMV RNA-2中的翻譯抑制子失活。
這里所說的翻譯抑制子序列，是所討論的增強子序列所來源的二分體病毒(例如 豇豆花葉病毒屬病毒)野生型RNA-2基因組節(jié)段中的一段序列，其包括產(chǎn)生(翻譯)由野 生型RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共羧基端蛋白質(zhì)中的較長一個的起始位點，或者由該位 點構(gòu)成。源自CPMV RNA-2基因組節(jié)段增強子序列中的翻譯抑制子序列是包括或者由上述 目標(biāo)起始位點構(gòu)成的序列。因此，翻譯抑制子序列包括如上文定義的目標(biāo)起始位點或者由 如上文定義的目標(biāo)起始構(gòu)成，并可以通過如上所述的突變加以失活。上面定義的增強子序列可以用在下面本發(fā)明的各種方面和實施方案中。因此，在本發(fā)明的一個方面中，提供或者使用了一種分離的核酸，其由或者基本上 由如上所述的表達增強子序列構(gòu)成。這里使用的“核酸”或“核酸分子”是指任何DNA或RNA分子，單鏈或者是雙鏈，如 果是單鏈，其互補序列的分子可以是線性或環(huán)狀形式。在討論核酸分子時，具體核酸分子的 序列或結(jié)構(gòu)可以按照常規(guī)的方式描述，即以從5’到3’的方向給出序列。當(dāng)提及本發(fā)明核 酸時，有時會使用術(shù)語“分離的核酸”。該術(shù)語在用于DNA時，是指和在其來源的生物體的天 然存在的基因組內(nèi)與其直接相鄰的序列分離的DNA分子。例如，“分離的核酸”可以包括插入到載體(例如質(zhì)?；虿《据d體)內(nèi)的DNA分子， 或者整合到原核或真核細(xì)胞或宿主生物體基因組DNA內(nèi)的DNA分子。在用于RNA時，術(shù)語“分離的核酸”主要是指由上面定義的分離DNA分子編碼的RNA 分子?？蛇x擇地，該術(shù)語可以指與其在自然狀態(tài)下(例如在細(xì)胞或組織中)相關(guān)聯(lián)的其它 核酸充分分離的RNA分子?！胺蛛x的核酸” (DNA或RNA)還可以是通過生物或合成方法直接 產(chǎn)生的、并已與其在產(chǎn)生過程中存在的其它成分分離的分子。因此，核酸可以由該增強子所來源的二分體RNA病毒RNA-2基因組節(jié)段的一部分 或片段組成，或者基本上由其組成。例如，在一個實施方案中，核酸至少不包括一部分其所 來源的RNA-2基因組節(jié)段的編碼區(qū)。該編碼區(qū)可能是編碼兩個共羧基端蛋白質(zhì)中較短一個 的RNA-2基因組節(jié)段的區(qū)域。核酸可以由二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的如下所述的一部 分組成或者基本上由其組成該部分從野生型RNA-2基因組節(jié)段的5’端起，延伸到起始產(chǎn) 生(翻譯)由野生型RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共羧基端蛋白質(zhì)中較短一條的起始位 點ο詞語“基本上由......組成”在指示特定的核苷酸或氨基酸時，意思是指具有給
定SEQ ID NO.性質(zhì)的序列。例如，當(dāng)用于指示氨基酸序列時，該詞語包括該序列本身和不 會影響該序列基本和新特征的分子修飾。例如，當(dāng)用于指示核酸時，該詞語包括序列本身和 不會影響序列的增強子功能或可提供進一步(附加)功能的少量改變和/或延伸。本發(fā)明進一步涉及包括本發(fā)明增強子序列的基因表達系統(tǒng)。因此，在本發(fā)明的另一個方面中，提供了一種包括上述增強子序列的基因表達系 統(tǒng)。該基因表達系統(tǒng)還可以包括插入在增強子序列下游的編碼目的蛋白的基因。所插 入的編碼目的蛋白質(zhì)的序列可以是任何大小。因此，在本發(fā)明進一步的方面中，提供了一種基因表達系統(tǒng)，其包括(a)如上所述的增強子序列；和(b)編碼目的蛋白質(zhì)的基因，其中該基因位于增強子序列的下游。目標(biāo)基因和蛋白質(zhì)可以是異源的，即不是由該增強子所來源的野生型二分體RNA 病毒編碼的?；虮磉_系統(tǒng)可用于在宿主生物體內(nèi)表達目的蛋白質(zhì)。在這種情況下，目的蛋白 還可以是相對所討論的宿主生物體異源的，即使用基因工程，即通過人類干預(yù)，引入到所討 論的細(xì)胞內(nèi)(例如植物或其祖先)。生物體內(nèi)的異源基因可以代替內(nèi)源的等價基因，即在通 常情況下執(zhí)行相同或相似功能的基因，或者插入序列是可以在內(nèi)源基因或其它序列的基礎(chǔ) 上添加的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解，目的基因的表達需要存在位于被表達基因上游的起始 位點(AUG)。這些起始位點可以作為增強子序列的一部分提供或者作為編碼目的蛋白質(zhì)的 基因的一部分加以提供。宿主生物體可以是植物。然而，因為翻譯機制在真核生物中是非常保守的，所以基 因表達系統(tǒng)也可以用于在除植物之外的其它真核宿主生物體中，例如在昆蟲細(xì)胞中作為修 飾的桿狀病毒載體，或者在酵母或哺乳動物細(xì)胞中，來表達目的蛋白質(zhì)?；虮磉_系統(tǒng)可以和啟動子和終止子序列可操作地連接。因此，基因表達系統(tǒng)可以進一步包括終止序列，并且編碼目的蛋白質(zhì)的基因可以 位于增強子序列和終止序列之間，即在增強子序列的下游(3’ )和終止序列的上游(5’)。因此，本發(fā)明進一步提供了一種表達盒，其包括(i)啟動子，其可操作地連接于(ii)如上所述的增強子序列(iii)期望表達的目的基因(iv)終止子序列。優(yōu)選地，用于驅(qū)動目的基因的啟動子是強啟動子。在植物中使用的強啟動子的實 例包括(l)p35S :0dell et al.，1985(2)木薯葉脈花葉病毒啟動子，pCAS, Verdaguer et al.，1996(3)核酮糖二磷酸羧化酶小亞單位的啟動子，pRbcS :0utchkourov et al.，2003.其它的強啟動子包括pUbi (用于單子葉和雙子葉植物)和pActin。在一個優(yōu)選實施方案中，啟動子是誘導(dǎo)型啟動子。用于啟動子的術(shù)語“誘導(dǎo)型”是本領(lǐng)域技術(shù)人員完全理解的。本質(zhì)上，誘導(dǎo)型啟動 子控制下的表達會響應(yīng)施加的刺激而“開啟”或增加。不同啟動子間刺激的性質(zhì)存在差異。 一些誘導(dǎo)型啟動子在不存在合適刺激時導(dǎo)致的表達很少或者表達水平不可檢測到(或不 表達)。其它誘導(dǎo)型啟動子在不存在刺激的情況下導(dǎo)致可檢測的組成性表達。無論不存在 刺激時的表達水平如何，任何誘導(dǎo)型啟動子在存在正確的刺激時表達都會提高。終止(終止子)序列可以是源自二分體RNA病毒(例如豇豆花葉病毒屬病毒) RNA-2基因組節(jié)段的終止序列。在一個實施方案中，終止序列可以與增強子序列來源于相同 的二分體RNA病毒。終止序列可以包括終止密碼子。終止序列之后還可以有多聚腺苷酸信 號。本發(fā)明的基因表達盒、基因表達構(gòu)建體和基因表達系統(tǒng)還可以包括非翻譯區(qū)(UTR)。UTR可以位于存在于基因表達盒、基因表達構(gòu)建體或基因表達系統(tǒng)中的終止子序列 的上游。當(dāng)基因表達盒、基因表達構(gòu)建體或基因表達系統(tǒng)包括編碼目的蛋白質(zhì)的基因時， UTR可以位于所述基因的下游。因此，UTR可以位于編碼目的蛋白質(zhì)的基因和終止子序列 之間。UTR可以源自二分體RNA病毒，例如源自二分體RNA病毒的RNA-2基因組節(jié)段。UTR 可以是與存在于基因表達盒、基因表達構(gòu)建體和基因表達系統(tǒng)中增強子序列所來源相同的 RNA-2基因組節(jié)段的3’ UTR0優(yōu)選地，UTR是豇豆花葉病毒屬病毒屬RNA-2基因組節(jié)段的 3，UTR，例如CPMV RNA-2基因組節(jié)段的3，UTR。如上所述，先前已經(jīng)證明，保持CPMV RNA-2中第161位和512位起始位點之間的 框，即將兩個起始位點保持在同一三聯(lián)閱讀框內(nèi)，對于由CPMV RNA-I編碼的復(fù)制酶高效復(fù) 制CPMV RNA-2是至關(guān)重要的(Holnesset al.，1989 ；van Bokhoven et al.，1993 ；Rohll et al.，1993)。這個要求限制了在基于CPMV的表達載體中第512位起始位點上游可以插入的 序列的長度。特別地，它排除了使用多接頭的可能，因為多接頭的使用往往會改變這兩個起 始位點之間的閱讀框(ORF)。本發(fā)明人已經(jīng)證明，保持CPMV RNA-2第161位和512位起始位點之間的閱讀框也 是在第512位起始位點的高效翻譯起始所需要的，也就是說，它是由CPMV編碼的兩個共羧 基端蛋白質(zhì)較短一條(95K蛋白質(zhì))的高效表達所需要的。然而，本發(fā)明人還證明，CPMV RNA-2中第161位起始位點的突變使得在第512位起 始位點的上游插入可改變突變起始密碼子與第512位起始位點之間的框的序列成為可能， 而對95K蛋白質(zhì)的表達水平?jīng)]有任何負(fù)面影響。因此，第161位起始位點的突變意味著能 夠插入到第512位起始位點上游的序列的長度不再有限制。當(dāng)在其它二分體病毒中也需要保持用于編碼兩個共羧基端蛋白質(zhì)的起始位點之 間的閱讀框時，這種需要也可以通過突變用作產(chǎn)生由病毒RNA-2基因組節(jié)段編碼的兩個共 羧基端蛋白質(zhì)中較長一個的起始位點的AUG加以克服。因此，在本發(fā)明的另一個方面中，提 供了一種基因表達構(gòu)建體，其包括(a)如上所述的增強子序列；和(b)用于幫助將編碼目的蛋白質(zhì)的基因插入基因表達系統(tǒng)的異源序列，其中異源 序列位于增強子序列中被突變的目標(biāo)起始位點的下游。異源序列可以位于該基因表達系統(tǒng)增強子序列所來源的野生型RNA-2基因組節(jié) 段中負(fù)責(zé)兩個共羧基端蛋白質(zhì)中較短的一個的產(chǎn)生的起始密碼子的上游?；蛘?，異源序列 可以設(shè)置在該基因表達系統(tǒng)增強子序列所來源的野生型RNA-2基因組節(jié)段中負(fù)責(zé)兩個共 羧基端蛋白質(zhì)中較短的一個的產(chǎn)生的起始密碼子位點的周圍(around)，或者代替該起始密 碼子。在具有源自CPMV RNA-2的增強子序列的基因表達系統(tǒng)中，異源序列可以設(shè)置在野生 型RNA-2CPMV基因組節(jié)段第512位起始密碼子的上游、其周圍、或代替該起始密碼子。異源序列可以是多接頭或多克隆位點，即幫助將編碼目的蛋白質(zhì)的基因克隆到表 達系統(tǒng)內(nèi)的序列。例如，如下文中介紹的，本發(fā)明人提供了構(gòu)建體，其包括位于基于CPMV的表達盒 的5’前導(dǎo)序列和3’UTR之間的多接頭。如下文所述，任何多接頭可以任選地編碼一組或多 組多聚組氨酸殘基，以便融合N-或C-端His標(biāo)簽來幫助蛋白質(zhì)提純。優(yōu)選地，上面的表達構(gòu)建體存在于載體內(nèi)，并且優(yōu)選地包括可用于將表達盒轉(zhuǎn)移和整合到生物體基因組中的邊界序列(border sequence) 0優(yōu)選地，構(gòu)建體是植物雙元載體。優(yōu)選地，雙元轉(zhuǎn)化載體基于pPZP (Hajdukiewicz, et al. 1994)。其它的示例構(gòu)建體包括 pBinl9 (見 Frisch, D. A.，L. ff. Harris-Haller，et al. (1995). “Complete Sequence of the binary vector Bin 19. "Plant Molecular Biology 27 405-409)。如這里所述，本發(fā)明可以通過將具有必要組件的表達盒移動到現(xiàn)有的pBin表達 盒內(nèi)來實施，或者，在其它實施方案中，可以使用直接克隆型(direct-cloning)pBin表達 載體。例如，如下文所述，本發(fā)明人擁有設(shè)計用于(但不僅限于)與這里所述的增強子序 列一起使用的模塊性雙元載體。這些載體是基于對pBINPLUS載體的改良，通過這些改良已 經(jīng)證明，在不損害復(fù)制和TDNA轉(zhuǎn)化方面性能的前提下大大降低載體的大小有可能的。而 且，增強子系統(tǒng)(例如所謂的“CPMV-HT”系統(tǒng))的元件已經(jīng)以模塊化的方式整合到所得的 載體內(nèi)，從而能夠從單個T-DNA表達多個蛋白質(zhì)。通過這些改良獲得了一種多功能、表達水 平高、允許高效地直接克隆外來基因的載體。這些實施例代表了優(yōu)選的雙元植物載體。優(yōu)選地，它們包括ColEI復(fù)制起點，盡 管含有其它可產(chǎn)生高拷貝數(shù)的復(fù)制起點的質(zhì)粒(例如基于pRi的質(zhì)粒，Lee and Gelvin, 2008)也是優(yōu)選的，特別是對于瞬時表達系統(tǒng)而言。如果需要，構(gòu)建體中可以包括可選擇遺傳標(biāo)記，例如提供可選擇的表型的標(biāo)記， 例如賦予對抗生素或除草劑(例如卡那霉素、潮霉素、草銨膦(phosphinotricin)、綠黃隆 (chlorsulfuron)、甲氨蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮類和草甘膦)的抗性的標(biāo)記。最優(yōu)選的載體是如下所述的pEAQ載體，它們允許直接克隆的版本(direct cloning version)，其是通過使用位于T-DNA上包含本發(fā)明的翻譯增強子的表達盒的5’前 導(dǎo)序列和3’ UTR之間的多接頭，其中該T-DNA同時還有基因沉默抑制子和NPTII盒。該多 接頭還編碼一組或多組6x組氨酸殘基，以便融合N-或C-端His標(biāo)簽來幫助蛋白質(zhì)提純。pEAQ來源載體的一個優(yōu)點是，多鏈蛋白質(zhì)(例如IgG)的每個組分可以被自動地輸 送到每一個被感染的細(xì)胞。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的基因表達系統(tǒng)在宿主生物體(例如植物、酵母、昆 蟲或哺乳動物細(xì)胞)內(nèi)表達蛋白質(zhì)(例如異源蛋白質(zhì))的方法。本發(fā)明進一步提供了提高從與上述RNA-2來源序列可操作地連接的編碼目的異 源蛋白質(zhì)的基因或0RF翻譯該異源蛋白質(zhì)的方法，該方法包括突變所述RNA-2來源序列中 的目標(biāo)起始位點。這里描述的增強子序列也可以和如W0/2007/135480所述的二分體表達系統(tǒng)一起 使用。因此，本發(fā)明還涉及基于截短的RNA-2基因節(jié)段的基因表達系統(tǒng)，任選地進一步包括 與啟動子和終止子序列可操作地連接的編碼基因沉默抑制子的第二基因構(gòu)建體。因此，在進一步的方面中，本發(fā)明涉及一種基因表達系統(tǒng)，其包括(a)第一基因構(gòu)建體，其包括攜帶至少一個與啟動子和終止子序列可操作地連接 編碼異源目的蛋白質(zhì)的外來基因的二分體病毒基因組截短型RNA-2，其中該基因構(gòu)建體包 括位于該外來基因上游的突變的目標(biāo)起始位點；和任選地(b)第二基因構(gòu)建體，其包括與啟動子和終止子序列可操作地連接的所述二分體病毒基因組的RNA-1 ；和任選地(c)第三基因構(gòu)建體，其任選地被整合在所述第一基因構(gòu)建體中、所述第二基因構(gòu) 建體中或兩者中，并包括與啟動子和終止子序列可操作地連接的基因沉默抑制子。本發(fā)明基因表達系統(tǒng)(包括上述的任何一個)中存在基因沉默抑制子是優(yōu)選的， 但不是必需的。因此，如上定義的基因表達系統(tǒng)優(yōu)選包括第三基因構(gòu)建體，其任選地整合在 所述第一基因構(gòu)建體、所述第二基因構(gòu)建體或兩者內(nèi)，并包括與啟動子和終止子序列可操 作地連接的基因沉默抑制子。因此，在本發(fā)明另一個方面中，提供了在植物內(nèi)表達蛋白質(zhì)的方法，包括如下步 驟(a)將本發(fā)明的基因表達構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)；和任選地(b)將包含與啟動子和終止子序列可操作地連接的所述二分體病毒基因組RNA-1 的第二基因構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)；和任選地(c)將第三基因構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)，所述第三基因構(gòu)建體任選地整合在所 述第一基因構(gòu)建體、所述第二基因構(gòu)建體或兩者內(nèi)的，并包括與啟動子和終止子序列可操 作地連接的基因沉默抑制子。優(yōu)選地，在如上定義的在植物內(nèi)表達蛋白質(zhì)的方法包括將第三基因構(gòu)建體引入到 植物細(xì)胞內(nèi)的步驟，該第三基因構(gòu)建體任選地整合在所述第一基因構(gòu)建體、所述第二基因 構(gòu)建體或兩者內(nèi)，并包括與啟動子和終止子序列可操作地連接的基因沉默抑制子。本發(fā)明還提供了包括將這種構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)的方法。本發(fā)明人已經(jīng)揭示，通過將目的基因和作為翻譯增強子的沉默抑制子一起整合到 同一 T-DNA上可獲得非常高的表達水平。因此，優(yōu)選的實施方案可以利用所有這些存在于 同一 T-DNA上的組件。此外，應(yīng)當(dāng)理解，RNA-1不是在這里所述的系統(tǒng)內(nèi)實現(xiàn)高水平表達所必需的，并且 確實，這里描述的“CPMV-HT”系統(tǒng)不借助RNA-1的作用(not bythe action of RNA-1)。因此，在進一步方面中，本發(fā)明涉及一種基因表達系統(tǒng)，其包括(a)第一基因構(gòu)建體，其包括攜帶至少一個與啟動子和終止子序列可操作地連接 的編碼目的異源蛋白的外來基因的二分體病毒基因組截短型RNA-2，其中該基因構(gòu)建體包 括位于該外來基因上游的突變的目標(biāo)起始位點；和任選地(b)第二基因構(gòu)建體，其任選地被整合在所述第一基因構(gòu)建體內(nèi)，包括與啟動子和 終止子序列可操作地連接的基因沉默抑制子。因此，在另一個方面中，本發(fā)明提供了在植物內(nèi)表達蛋白質(zhì)的方法，包括如下步 驟(a)將本發(fā)明的基因表達構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)；和任選地(b)將任選地整合在所述第一基因構(gòu)建體內(nèi)、并包括與啟動子和終止子序列可操 作地連接的基因沉默抑制子的第二基因構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞內(nèi)。可用于這些方面中的基因沉默抑制子是本領(lǐng)域已知的，并且在W0/2007/135480 中有說明。它們包括源自馬鈴薯病毒Y的HcPro，源自TEV的He-Pro，源自TBSV的P19，源 自FHV的rgsCam，B2蛋白，CPMV的小衣殼蛋白、和源自TCV的衣殼蛋白。最優(yōu)選地，該系統(tǒng) 的RNA-2是截短的，從而不會產(chǎn)生感染性病毒。
在產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物時，優(yōu)選的抑制子是具有R43W突變的P19抑制子。在本發(fā)明進一步方面中，公開了一種宿主細(xì)胞，其含有根據(jù)本發(fā)明的異源構(gòu)建體。本發(fā)明的基因表達載體可以被瞬時或穩(wěn)定整合到植物細(xì)胞內(nèi)。對于小規(guī)模生產(chǎn)，用本發(fā)明的構(gòu)建體對葉子進行機械農(nóng)桿菌滲入 (agroinfiltration)。大規(guī)?？梢酝ㄟ^例如使用真空滲透實現(xiàn)。在其它實施方案中，本發(fā)明的表達載體可以被穩(wěn)定地整合到轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì) 胞的基因組內(nèi)。在一個方面中，本發(fā)明可以進一步包括從被轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生植物的步驟。在下列文獻中介紹了先前被廣泛成功地用于植物的具體實驗程序和載體 Guerineau and Mullineaux(1993)(Plant transformation and expressionvectors. In Plant Molecular Biology Labfax(Croy RRD ed)Oxford,BlOSScientific Publishers,pp 121-148)。合適的載體可以包括源自植物病毒的載體(見例如EP-A-194809)。如果期望， 可以在構(gòu)建體內(nèi)包含選擇遺傳標(biāo)記，例如賦予對抗生素或除草劑(例如卡那霉素、潮霉素、 草銨膦、綠黃隆、甲氨蝶呤、慶大霉素、大觀霉素、咪唑啉酮類和草甘膦)的抗性的標(biāo)記?？梢杂萌魏魏线m的技術(shù)將核酸引入到植物細(xì)胞內(nèi)，例如由農(nóng)桿菌攜帶的利用其 天然基因轉(zhuǎn)移能力的去甲(disarmed) Ti質(zhì)粒載體(EP_A_270355，EP-A-0116718，NAR 12(22)8711-872151984 ；the floral dip method ofCloughand Bent，1998)、微?；蛭?彈(microprojectile)轟擊(US 5100792，EP-A-444882，EP-A-434616)、顯微注射(W0 92/09696， W0 94/00583， EP 331083， EP 175966， Green et al. (1987)Plant Tissue and Cell Culture, Academic Press)、電穿孔(EP290395,W0 8706614 Gelvin Debeyser)、其它 形式的直接DNA攝取(DE4005152，W0 9012096, US 4684611)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA攝取(例如 Freemanet al. Plant Cell Physiol. 29 :1353 (1984))、或渦旋方法(例如 Kindle，PNASU. S.A.87 :1228(1990d))。在 0ard，1991，Biotech. Adv. 9 :1_11 中綜述了用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞 的物理方法。Ti質(zhì)粒，特別是雙元載體，在下面有更詳細(xì)的討論。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化被本領(lǐng)域技術(shù)人員廣泛用于轉(zhuǎn)化雙子葉物種。然而，在幾乎所有有經(jīng) 濟意義的單子葉植物內(nèi)常規(guī)產(chǎn)生穩(wěn)定可育的轉(zhuǎn)基因植物方面也取得了相當(dāng)?shù)某晒?見例 如Hiei et al. (1994) The Plant Journal 6，271-282))。當(dāng)單獨使用農(nóng)桿菌效率低或無效 時，微彈轟擊、電穿孔和直接DNA攝取是優(yōu)選的?？蛇x擇地，不同技術(shù)的組合可用于提高轉(zhuǎn) 化過程的效率，例如使用涂布有農(nóng)桿菌的微粒轟擊(EP-A-486234)，或者用微彈轟擊誘導(dǎo)傷 口，隨后與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)(EP-A-486233)。轉(zhuǎn)化技術(shù)的具體選擇可以根據(jù)其轉(zhuǎn)化特定植物物種的效率以及實踐本發(fā)明的人 在特殊方法學(xué)選擇方面的經(jīng)驗和偏愛來確定。對于技術(shù)人員顯而易見的是，用于將核酸引入植物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的具體選擇 不是本發(fā)明至關(guān)重要的或構(gòu)成限制，用于植物再生的技術(shù)的選擇也不是。在本發(fā)明人實施 的實驗中，在多種T-DNA整合模式中均見到了提高的表達效果。因此，本發(fā)明的各個方面提供了轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，涉及將本發(fā)明的構(gòu)建體引 入到植物組織(例如植物細(xì)胞)內(nèi)，并導(dǎo)致或允許載體和植物細(xì)胞基因組重組，從而將根據(jù) 本發(fā)明的核酸引入到基因組內(nèi)?？梢赃@樣做來引起瞬時表達。或者，轉(zhuǎn)化植物組織之后，可以被再生植株，例如從單個細(xì)胞、愈傷組織或葉盤再生，這是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。幾乎任何植物均能夠從植物的細(xì)胞、組織或器官完整再 生?？梢垣@得的技術(shù)在下列文獻中有綜述Vasil etal. , Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press, 1984,禾口 Weissbach and ffeissbach, Methods for Plant Molecular Biology, AcademicPress,1989?？捎D(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)生已經(jīng)在谷類植物中實現(xiàn)，例如水稻、玉米、小麥、燕麥 和大麥，以及許多其它植物物種(綜述見Shimamoto，K. (1994)Current Opinion in Biotechnology 5，158-162. ；Vasil, et al. (1992)Bio/Technology 10,667-674 ；Vain et al.,1995,Biotechnology Advances 13(4) 653-671 ；Vasil,1996,Nature Biotechnology 14page 702)。再生植物或其部分可用于提供克隆、種子、自交或雜交子代和后代(例如F1和F2 后代)、插枝(cuttings)(例如可食用部分)、繁殖體等。本發(fā)明進一步提供了轉(zhuǎn)基因生物體(例如通過這里所述方法獲得的或可以獲得 的)，其中引入了表達載體或盒，并且其中盒中的異源基因以高水平表達。本發(fā)明進一步包括用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法，該方法包括如下步驟執(zhí)行如上 所述的方法(或使用生物體)，和任選地至少收獲一種組織，其中目的蛋白質(zhì)被表達，并從 該組織分離目的蛋白質(zhì)。具體地，本發(fā)明因此提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其被本發(fā)明的表達載體 瞬時轉(zhuǎn)染。在一個進一步的方面中，本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其被本發(fā) 明的表達載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。本發(fā)明還提供了源自這類植物的植物繁殖體，它是任何可以用在生殖或繁殖的部 分，有性或者無性，包括插枝、種子等。還提供了包含上述植物細(xì)胞或異源DNA的這些植物 的任何部分。因此，在各種方面中(沒有限制)，本發(fā)明提供了 由本發(fā)明增強子序列構(gòu)成或基本上由其構(gòu)成的核酸(該增強子序列可以(例如) 由CPMV RNA-2基因組節(jié)段核苷酸1-512構(gòu)成，或者來源于它，或者來源于另一種二分體RNA 病毒的RNA-2基因組節(jié)段，在每種情況下，相應(yīng)于CPMV RNA-2位置161的目標(biāo)起始位點被 突變)。 基因表達系統(tǒng)，其包括位于例如編碼目的蛋白質(zhì)的0RF上游的這些增強子序列， 或者多接頭，和任選地終止子。 如W0/2007/135480中描述的二分體表達系統(tǒng)，其根據(jù)本發(fā)明進行了修改以便使 用本文所述的增強子序列。 表達盒，其包括(i)啟動子，其可操作地連接于(ii)如上所述的增強子序列， (iii)多接頭或期望表達的目的基因，(iv)同源3’UTR(即源自CPMV RNA-2基因組節(jié)段的 3，UTR)，(v)終止子序列。 使用本發(fā)明的基因表達系統(tǒng)或載體在宿主生物體內(nèi)(例如植物內(nèi))表達蛋白質(zhì) (例如異源蛋白質(zhì))的方法。 從本發(fā)明的基因表達系統(tǒng)或載體表達蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞和生物體(例如植物或酵母)，和產(chǎn)生它們的方法。除非上下文有其它要求，否則“基因”是指編碼用于翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的遺 傳信息的任何核酸。因此，除非上下文有其它要求，否則它可以和“0RF”互換使用。可能期望表達的基因可以是轉(zhuǎn)基因或內(nèi)源基因。目的基因包括編碼農(nóng)藝性狀、昆蟲抗性、疾病抗性、除草劑抗性、不育、顆粒特征等 的基因?；蚩梢詤⑴c油、淀粉、碳水化合物、營養(yǎng)物質(zhì)等的代謝。因此，目的基因或性狀包 括，但不僅限于，環(huán)境或脅迫相關(guān)性狀、疾病相關(guān)性狀、和影響農(nóng)藝性質(zhì)的性狀。目標(biāo)序列還 包括負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)、肽、脂肪酸、脂類、蠟質(zhì)、油、淀粉、糖、碳水化合物、香料、氣味、毒素、類胡 蘿卜素、激素、聚合物、黃酮、儲藏蛋白、酚酸、生物堿、木質(zhì)素、丹寧、纖維素、糖蛋白、糖脂等 的基因。最優(yōu)選地，單子葉植物和/或雙子葉植物中的目標(biāo)基因可以包括編碼如下酶或蛋 白質(zhì)的基因，如負(fù)責(zé)在植物中，例如在油菜、向日葵、大豆和玉米中產(chǎn)生油的酶；參與植物 中，例如馬鈴薯、玉米、谷物中淀粉合成的酶；合成天然藥物(例如藥品或獸藥產(chǎn)品)的酶或 本身即為天然藥物的蛋白質(zhì)。異源核酸可以編碼(除其它之外)細(xì)菌、真菌、植物或動物來源的基因。多肽可以 在植體內(nèi)(in planta)使用(用于改變植物的特征，例如關(guān)于害蟲易感性、活力(vigor)、組 織分化、育性、營養(yǎng)價值等)，或者植物可以是用于產(chǎn)生多肽的中間媒介，可以從中提純多肽 并用于其它方面。這樣的蛋白質(zhì)包括，但不僅限于，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein)、p53、血管抑制素、和瘦蛋白。類似地，本發(fā)明的方法可用于產(chǎn)生哺乳動物調(diào)節(jié)蛋 白。其它的目的序列包括蛋白質(zhì)、激素、生長因子、細(xì)胞因子、血清白蛋白、血紅蛋白、膠原蛋 白等。因此，目標(biāo)基因或核苷酸序列優(yōu)選編碼下述目的蛋白抗蟲蛋白、抗病蛋白、抗雜 草蛋白、哺乳動物蛋白。“載體”定義為包括任何質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒或農(nóng)桿菌雙元載體，等等，處于 雙鏈或單鏈線性或環(huán)形形式，其可以是或者不是自身可傳遞(transmissible)或可移動 (mobilizable)的，能夠轉(zhuǎn)化原核或真核宿主，或者通過整合到細(xì)胞基因組內(nèi)，或者在染色 體外存在(例如具有復(fù)制起點的自主復(fù)制質(zhì)粒)。所用的構(gòu)建體可以是完全或部分合成的。 特別地，它們是重組的，體現(xiàn)在自然條件下不出現(xiàn)在一起(不連續(xù)相接)的核酸序列被連接 在一起或者人工組合在一起。除非特別指出，否則根據(jù)本發(fā)明的載體不需要包括啟動子或 其它調(diào)節(jié)序列，特別是當(dāng)載體是用于將核酸引入到細(xì)胞內(nèi)以重組進入基因組時。“雙元載體”正如本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，雙元載體系統(tǒng)包括(a)邊界序列， 其允許將期望的核苷酸序列轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞基因組中；(b)期望的核苷酸序列本身，其一 般包括由下構(gòu)成的表達盒(i)植物活性啟動子，其可操作地連接于(ii)目標(biāo)序列和/或增 強子(視情況合適)。期望的核苷酸序列位于邊界序列之間，并且能夠在合適的條件下插入 到植物基因組中。雙元載體系統(tǒng)一般需要其它的序列(源自根瘤農(nóng)桿菌)來實現(xiàn)整合。一 般地，這可以通過使用所謂的“農(nóng)桿菌滲透”來實現(xiàn)，其使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化。簡而 言之，該技術(shù)是基于農(nóng)桿菌將其部分DNA(" T-DNA ”)轉(zhuǎn)移進入宿主細(xì)胞，并可在細(xì)胞內(nèi)整 合進入核DNA的性質(zhì)。T-DNA由左右邊界序列限定，長度為大約21-23個核苷酸。滲透可以 通過例如注射器(葉子)或真空(整個植物)實現(xiàn)。在本發(fā)明中，邊界序列一般地包圍在期望核苷酸序列(T-DNA)的周圍，并有一個或多個可通過農(nóng)桿菌滲透引入到植物材料中的 載體。“表達盒”是指如下的情況，其中核酸處于合適的啟動子或其它調(diào)節(jié)元件的控制 下，并與之可操作地連接，用以在宿主細(xì)胞，例如微生物或植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄?！皢幼印笔沁@樣的核苷酸序列，從該序列可以起始該序列下游與之可操作地連接 (即沿著雙鏈DNA有義鏈3，方向)的DNA的轉(zhuǎn)錄?！翱刹僮鞯剡B接”的意思是連接起來作為同一核酸分子的一部分，并適當(dāng)?shù)囟ㄎ缓?取向，以便從啟動子起始轉(zhuǎn)錄。目的“植物”物種包括，但不僅限于，玉米(Zea mays)、蕓薹屬(例如甘藍型 油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜)，特別是那些可用作種子油來源的油菜物種，紫花苜 猜(Medicago sativa)、禾S (Oryza sativa)、黑麥(Secale cereale)、高梁(舌甘高梁、高 粱)、粟米(例如珍珠稷(Pennisetum glaucum)、黍(Panicummiliaceum)、粟(Setaria italica) > ^fciTlfM (Eleusine coracana)) > (n| H ^ (Helianthusannuus)(Carthamus tinctorius)、小麥(Triticum aestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotiana tabacum)、 本氏煙草、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum)、甘暮(Ipomoea batatus)、木暮(Manihot esculenta)、 叻口 啡(Coffea spp.)、椰子(Cocosnucifera)、菠蘿(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶樹(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、魚萼 梨(Persea americana)、無花果(Ficus casica)、番石槽(Psidium guajava)、芒果 (Mangifera indica) (Oleaeuropaea) (Carica papaya) (Anacardium occidentale) (Macadamia integrifolia) (Prunus amygdalus)、！ 舌甘菜(Betavulgaris)、甘蔴(Saccharum spp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物(ornamentals) 和針葉樹。技術(shù)人員會意識到，這里公開的病毒載體的趨向性會不同。然而，確定對這些病 毒的易感性完全是技術(shù)人員能力可及的。而且，還有可能通過重組表達易化病毒進入植物 細(xì)胞的受體來改變這種特異性?，F(xiàn)在，本發(fā)明將通過參考下面的非限制性附圖和實施例進行更詳細(xì)的說明。鑒于 這些，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以獲得本發(fā)明的其它實施方案。因為這里引用的所有參考文獻的公開可被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于實施本發(fā)明，因此 本文特別通過提述并入它們。附圖簡述

圖1顯示了 CPMV表達載體00、10、01和11的示意圖。在00表達載體中，第115 和161位的起始位點均是完整的。在10表達載體中，第115位的起始位點已突變，但第161 位的起始位點是完整的。在01表達載體中，第161位的起始位點已突變，但第115位的起 始位點是完整的。在11表達載體中，第115和161位的起始位點均已突變。CPMV表達載體 00、10、01、11 還包括位于第 512 (FSC2-152)，513 (FSC2-513)或 514 (FSC2-514)位的起始位 點。柱條用來指示預(yù)期從該起始位點發(fā)生蛋白質(zhì)表達。圖2顯示了在用圖1中示意的CPMV表達載體轉(zhuǎn)染的植物體內(nèi)表達的可溶性綠色 熒光蛋白(GFP)的水平。在表達載體FSC2-512，F(xiàn)SC2-513和FSC2-514中，編碼GFP的基 因被分別插入在第512、513和514位的起始密碼子之后。SDS-PAGE凝膠泳道被標(biāo)記為00、10、01和11，這取決于CPMV載體第115和161位起始位點中哪個是完整的或是突變的。標(biāo) 記‘500ng’的泳道顯示了一個相應(yīng)于500ng GFP蛋白的條帶的位置，因此指示了從CPMV表 達載體表達的GFP蛋白的預(yù)期位置。每個SDS-PAGE凝膠的左手邊的泳道顯示了蛋白質(zhì)大 小標(biāo)記物的位置。圖3顯示了在用與圖2所示實驗所用相同的CPMV表達載體轉(zhuǎn)染的本氏煙葉片中 的GFP表達水平。葉片尖端的灰白區(qū)域?qū)?yīng)于GFP表達區(qū)域。用于使表達載體10、01和11 中第115和/或161位的起始位點失活的突變也已標(biāo)明。圖4顯示了用于瞬時表達綠色熒光蛋白(GFP)、?？?Discosoma)紅色熒光蛋白 (DsRed)和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的Del_RNA_2(圖1中的表達載體00 [FSC2-512])和 HT(圖1中的表達載體01[FSC2-512])的比較結(jié)果。每種蛋白的delRNA_2或HT克隆用沉 默抑制子P19滲透。(A)用delRNA-2構(gòu)建體滲透7天后的組織當(dāng)DsRed或HBcAg表達時開 始壞死，而在HT驅(qū)動表達的場合則不是如此。實際上，通過HT表達DsRed的組織在日光條 件下看上去明顯呈紅色。⑶蛋白質(zhì)表達的考馬斯染色SDS-PAGE分析。所示的相應(yīng)于重組 蛋白的顯著條帶經(jīng)過了 western印跡確認(rèn)。1_標(biāo)記，2_未滲透組織，3_delRNA-2構(gòu)建體， 4-HT構(gòu)建體，5-市售標(biāo)準(zhǔn)品(如果有的話)。每個泳道加載來自大約5mg經(jīng)滲透組織的粗 提物，2 μ g GFP標(biāo)準(zhǔn)品，2 μ g HbcAg標(biāo)準(zhǔn)品。目前無法獲得DsRed的標(biāo)準(zhǔn)品。圖5顯示了用于瞬時表達人抗人免疫缺陷病毒抗體2G12的Del_RNA_2(圖1中的 表達載體00[FSC2-512])和HT (圖1中的表達載體01 [FSC2-512])的初步比較。IgG重鏈 或者是天然型(HL)或者是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留型(ER-retained) (HEL)并經(jīng)輕鏈和P19滲透。㈧ 通過del-RNA-2表達2G12-HEL，導(dǎo)致被滲透組織壞死，而這在HT表達中沒有發(fā)生。(B)用 抗體重鏈加P19滲透過的組織粗提物(delRNA-2或HT)的SDS-PAGE分析。對于每個樣品， 加載來自5mg滲透組織的粗提物，或Iyg人IgG標(biāo)準(zhǔn)品。考馬斯染色后可以容易地看到對 應(yīng)于2G12的條帶。(C)通過俘獲到蛋白質(zhì)A和表面等離子體共振光譜學(xué)來測量5天后抗 體2G12的積累量，其代表提取到2體積緩沖液(PBS，5mM EDTA)中后的濃度。這樣，我們在 沒有對植物溫育或提取進行優(yōu)化的條件下可以得到接近150mg/kg (對于HT HEL)的鮮重濃 度。每個處理測量了三個樣品。圖6顯示了已裝配的HbcAg顆粒的電子顯微圖片，這些顆粒是用這里所述的 HT(表1中的表達載體01[FSC2-512])表達載體表達的。已裝配HbcAg顆粒呈空心球體狀， 直徑大約30nm。含有HbcAg顆粒的汁液(sap)在進行電子顯微照相之前并未濃縮，但除去 了不需要的鹽。因此，電子顯微圖片代表了汁液中HbcAg顆粒的濃度。圖 7 顯示了載體 pM81-FSCl。圖 8 顯示 了載體 pM81_FSC2。圖9顯示了 pEAQ構(gòu)建的示意圖。(A)用灰色顯示的帶有外來序列的基于pBINPLUS 的起始質(zhì)粒。(B)含有雙元載體必需元件的PCR產(chǎn)物。(C)末端剪裁(end-tailored)PCR 產(chǎn)物的3部分連接反應(yīng)后的中間質(zhì)粒。(D)從中間物擴增并隨后連接兩條片段后得到的最 終質(zhì)粒。圖10顯示了主要的pEAQ衍生物的T-DNA的示意圖。T-DNA如所示地含有P19和 /或NPTII，并且如所示地保留了克隆到限制位點中的可能。圖11顯示了由pEAQ載體產(chǎn)生的GFP的表達水平，并與其親本質(zhì)粒
20PBB-FSC2-512-HT比較。將組織用P19和所示的載體滲透(除pEAQexpress之外； pEAQexpress以標(biāo)準(zhǔn)0D或兩倍稀釋單獨滲透)6天后進行分析。將葉子在(A)UV光、(B)考 馬斯染色12% SDS-PAGE和(C)熒光分光光度分析下成像。圖12顯示了與野生型P19相比，P19(R43W)增強GFP表達的能力。組織在用兩倍 稀釋的 pEAQselectK(selK-P19)、pEAQselectK 與 P19(selK)、pEAQspecialK(spK)、兩倍稀 釋的 pEAQspecialK(spK 1 2)、pEAQspecialKm(spKm)、兩倍稀釋的 pEAQspecialKm(spKm 1 2)、pEAQexpress (ex)、和兩倍稀釋的pEAQexpress (ex 1 2)滲透6天后進行分析。 葉子在(A)UV光和(B)熒光分光光度分析下成像。圖13顯示了用單個pEAQ質(zhì)粒表達全長IgG 2G12。(A)兩個被構(gòu)建來表達2G12 的pEAQexpress驅(qū)動的質(zhì)粒的示意圖。(B)滲透方案指示了每種質(zhì)粒組合的稀釋度和其各 自的0D，以及在每個0D下滲透后獲得的蛋白提取物的濃度(士SD)。(C)滲透8天后2G12 重鏈(Y )的考馬斯染色12-4% SDS-PAGE分析和⑶滲透8天后2G12重鏈(Y )的免疫檢 測，和(E)滲透8天后2G12Fab區(qū)(Fab)鏈的免疫檢測。M，標(biāo)明了大小的標(biāo)記；C，對照提取 物；Std，CH0產(chǎn)生的2G12。對于考馬斯染色，每條泳道內(nèi)添加來自相當(dāng)于3mg滲透組織的量 的蛋白質(zhì)與lPg CH02G12。對于western印跡，每條泳道內(nèi)添加來自相當(dāng)于0. 75mg滲透組 織的量的蛋白質(zhì)與250ng CH02G12。標(biāo)明了估計的組裝/降解產(chǎn)物。圖14顯示了從pEAQ-HT克隆和表達天然和his-標(biāo)簽變體形式的GFP。(A)具 有pEAQ-HT T-DNA示意圖，標(biāo)明了多接頭的詳情。(B)GFP表達的熒光光度分析。spK = pEAQspecialK-GFP-HT,GFP,HisGFP,GFPHis = pEAQ-HT 克隆。(C)GFP 表達的 12% SDS-PAGE 和western分析。C =對照提取物圖15顯示了本發(fā)明的核構(gòu)建體，其適于作為桿狀病毒載體的一部分用在昆蟲細(xì) 胞中。
實施例實施例11.1 方法表達載體FSC2及其衍生物的產(chǎn)生從pBinP-S2NT(Liu and Lomonossoff, 2002)中切出兩側(cè)翼為花椰菜花葉病毒 (CaMV)35S啟動子和胭脂堿合成酶(nos)終止子的完整RNA-2序列，并將其作為一個AscI/ PacI片段插入到誘變質(zhì)粒pM81W(Liu and Lomonossoff, 2006)中，構(gòu)建出一個合適的克隆 載體用來從基于pBinP-1-GFP的質(zhì)粒(Cafiizares et al.，2006)表達外來蛋白質(zhì)。對于所 得的質(zhì)粒，PM81W-S2NT，進行一輪誘變，同時引入4個變化(見Liu and Lomonossoff，2006 中的方法)，得到PM81B-S2NT-1。該誘變從載體骨架除去兩個BspHI位點，而在AUG512附近 引入一個BspHI位點(T/CATGA)，并且在UAA 3299 (RNA-2編碼的多聚蛋白的終止密碼子) 后面引入一個 StuI 位點(AGG/CCT)。隨后，從 pBinP-NS-l(Liu et al. ,2005)切出 BamHI/ AscI片段，并連接到同樣消化的pM81B-S2NT-l中，產(chǎn)生pM81-FSC-l。該載體允許通過BspHI 和StuI消化將AUG512下游的整個RNA-20RF加以切離，并用任何具有與BspHI和StuI (平 末端)兼容的末端的序列代替。BspHI位點的使用是重要的，因為它可以保留512位的AUG， 而該起始位點(initiator)被用來驅(qū)動所插入基因的翻譯。為了在植物內(nèi)表達外來基因，將該pM81-FSC-l衍生的質(zhì)粒用AscI和PacI消化，將含有包括外來序列在內(nèi)的表達盒的片 段轉(zhuǎn)移到同樣消化的PBINPLUS中，并將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入農(nóng)桿菌。為了使克隆更容易，擴大可應(yīng)用限制酶的選擇，也為了研究閱讀框?qū)ν鈦砘虮?達的影響，將整個RNA-20RF用一個短的多接頭代替。核苷酸插入和定點突變的組合產(chǎn)生 了 pM81-FSC-2，其允許用 Nrul (TCG/CGA)與 Xhol (C/TCGAG)或 StuI 進行克隆。Nrul 位點 的末端腺苷酸位于512位，這樣就保留了這里的AUG。這些修飾改變了與512位AUG的5’ 緊鄰核苷酸，然而仍保留了良好的上下文。將GFP克隆到pM81-FSC-2中使其翻譯從512、 513,514或515位的AUG起始，這樣得到了源自構(gòu)建體pM81_FSC_l的pM81_FSC2_512， PM81-FSC2-513, pM81_FSC2_514 和 pM81_FSC2_515。這些基于 pM81 的質(zhì)粒是含有表達盒 的克隆載體，這些表達盒隨后被轉(zhuǎn)移到雙元載體中，產(chǎn)生在圖2和3所示的實驗中所用的 表達載體 FSC2-512，F(xiàn)SC2-513 和 FSC2-514。CPMV 的 wtRNA_2 基因組節(jié)段與 pM81_FSCl 和 PM81-FSC2載體之間的序列差異如表3所示。載體內(nèi)與wt CPMV序列相比發(fā)生改變的核苷 酸用大寫字母顯示。在轉(zhuǎn)移到pBINPLUS中(如上文關(guān)于pM81-FSC-l所概述的)后進行的農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的瞬時轉(zhuǎn)化顯示，當(dāng)沒有保持AUG161和下游AUG之間的框的連續(xù)性時，所得蛋白質(zhì)的水平 較低。從相對于AUG 161和512的+1和+2位翻譯的GFP量有顯著降低，而從+3位翻譯 (即從515翻譯，返回到對框)的效率則與從AUG 512的翻譯一樣高。為了證明這不是由于 513和(在較低的程度上)514位的AUG的上下文被弱化的結(jié)果，我們生成了 FSC2-515+，其 從+3位起始，但其上下文與FSC2-513 —樣差。從FSC2-515+的表達與從FSC2-512或515 起始的表達一樣高，這表明上下文不好(inferior context)不能解釋從FSC2-513和514 起始的表達的降低?？紤]到已知的翻譯逃離第一 AUG規(guī)則的機制并不知道需要保持框的連續(xù)性，從 經(jīng)缺失的基于RNA-2的載體進行高效翻譯需要依賴AUG161和下游AUG之間的框的連續(xù) 性這一點是讓人很感興趣的。為了理解這一現(xiàn)象并且希望解決它的辦法，我們生成了 一系列的突變體，它們的RNA-25’序列被修飾。將成對的互補寡核苷酸(見表2)用于 pM81-FSC2-512，513和514的定點誘變。突變除去了 AUG 115(u0RF的起始密碼子)、AUG 161(未改變uORF的氨基酸序列)或者將這兩個上游起始位點一起去除。通過用U162C寡 核苷酸(表2)誘變A115G突變體制造了雙突變。如上文pMSl-FSC-2構(gòu)建體的描述進行這些突變體轉(zhuǎn)錄本的瞬時表達。用考馬斯 染色的SDS-PAGE (圖2)或全葉片UV光成像(圖3)對這些突變體的GFP表達進行分析顯 示，161位的AUG缺如可使表達強烈增加。而且，單除去AUG 161或同時除去AUG 115和161 可減輕對AUG161和下游AUG之間框的連續(xù)性的依賴。對比地，僅除去AUG 115似乎會增強 這種依賴性并會一般性地抑制翻譯。總之，uORF似乎發(fā)揮下調(diào)從AUG 161起始的翻譯的功 能，其是普遍抑制性的并造成對框連續(xù)性的依賴。含有HbcAg顆粒的汁液的電子顯微照相。用于對如圖6所示的已組裝HbcAg顆粒進行電子顯微照相的汁液的制備如下。將 葉片組織在2體積Tris/NaCl緩沖液中提取，并在lOOkDa MWC0柱上更換為TE，而無濃縮。 通過與考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上的標(biāo)準(zhǔn)品比較判斷，HbcAg的最終濃度為大約0. 2mg/ ml。
1.2 結(jié)果(1)改變161位(AUG161)和512位(AUG)處起始位點的相對相位的影響為了實現(xiàn)這個目的，在AUG512(FSC2-512)的直接上游插入了額外的核苷酸，從而 將 AUG 移動到位置 513，514 和 515(FSC2-513，F(xiàn)SC2-514 和 FSC2-515)(圖 1)。通過熒光 (圖3)和考馬斯染色凝膠(圖2)判斷，使AUG512與AUG161異相(FSC2-513和FSC2-514) 導(dǎo)致了 GFP表達降低。而恢復(fù)相位(FSC2-515)可以將表達返回到自然狀況下(FSC2-512) 所見的水平。結(jié)論是，在存在AUG161的情況下，下游AUG當(dāng)與第161位的AUG在同一相時， 起始最有效。(2)除去第115位的起始位點(AUG115)同時改變第161位(AUG161)和第512位 (AUG512)的起始位點的相對相位當(dāng)GFP表達從AUG512驅(qū)動時，也就是當(dāng)該第二個AUG與AUG161同相時，除去 AUGl 15的影響很小或者沒有影響(見圖2和3中泳道10)。然而，當(dāng)?shù)诙€AUG與AUG161異 相時(513，514)，刪除AUG115導(dǎo)致GFP幾乎不表達(見圖2和3中泳道10)。結(jié)論AUG115 在一定程度上參與核糖體繞過AUG161和到達AGU512的能力。然而，這需要下游的AUG處 于正確的相位。(3)除去第161位起始位點(AUG161)的影響該突變的影響令人難以置信地劇烈，GFP的表達水平達到存在AUG161時的20_30 倍(見圖2和3的泳道01)。而且，AUG512處于哪個相位似乎不再重要，雖然當(dāng)不存在AUG161 時相位這個概念的意義也不大。此外，存在或不存在AUG115無關(guān)緊要(見圖2和3中的泳 道 11)。當(dāng)使用delRNA_2(圖1中的表達載體00 [FSC2-512])構(gòu)建體表達DsRed和HbcAg 時，在5天內(nèi)，經(jīng)滲透的葉塊(infiltrated patches)喪失了膨壓(turgorpressure)，并且 退綠(chlorotic)(變灰白)。到7天，組織變灰，并且完全死亡。當(dāng)使用HT(圖1中的表 達載體01[FSC2-512])時，組織在7天后仍然保持膨脹(turgid)，唯一的脅迫征象是表達 HbcAg的組織有輕微的退綠。當(dāng)2G12IgG的重鏈通過delRNA_2表達并且滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi) 時，7天后退綠明顯，而對于HT則沒有觀察到這個現(xiàn)象。當(dāng)使用HT表達異源蛋白質(zhì)時，盡管 獲得了比使用delRNA-2表達異源蛋白質(zhì)時更高水平的異源蛋白質(zhì)表達，在植物中見到的 壞死水平卻低得多。討論通過刪除AUG161可以從delRNA_2構(gòu)建體表達非常高水平的外來基因。目前，使 用GFP，我們估計水平為總可溶蛋白質(zhì)(TSP)的25-30%，或者每千克葉子大約1克表達蛋 白。這是一個極高的水平，并且我們使用的方法極其簡單。我們不再需要保持閱讀框的事 實意味著可以產(chǎn)生具有多接頭的使用者友好的載體。實施例22. 1 背景如實施例1所述，為了研究高效表達必需的CPMC RNA-25’非翻譯區(qū)(UTR)的必需 特征，本發(fā)明人考察了在主起始位點上游5’前導(dǎo)序列中發(fā)現(xiàn)的兩個AUG密碼子的作用。發(fā) 明人證明，刪除主翻譯起始位點(512)上游的一個合框的起始密碼子(161)可導(dǎo)致外來蛋 白質(zhì)積累大量增加。
使用該系統(tǒng)，發(fā)明人顯示，滲透后6天，包括一種全長IgG和一種自組裝病毒樣顆 粒在內(nèi)的若干無關(guān)蛋白質(zhì)的表達分別占總可提取蛋白質(zhì)的> 10%和20%。因此，該系統(tǒng)提 供了一種用于高水平表達的理想媒介，其不依賴轉(zhuǎn)錄本的病毒復(fù)制。這種新系統(tǒng)(以圖1中的表達載體01 [FSC-512]為例)被稱作“CPMV-HT”，代表 “超翻譯豇豆花葉病毒屬病毒蛋白表達系統(tǒng)”。HT-CPMV系統(tǒng)顯示蛋白質(zhì)水平急劇增加，因此是一種在植物內(nèi)快速高水平表達外 來蛋白質(zhì)的優(yōu)良方法。在過去25年，已經(jīng)開發(fā)出了越來越多系列的雙元載體用于植物轉(zhuǎn)化(Hellens et al. ,2000b ；Veluthambi et al. ,2003 ；Lee and Gelvin，2008)。迄今，這些發(fā)展的主要目 的聚焦于提高穩(wěn)定整合，例如通過擴展農(nóng)桿菌的宿主范圍(Hiei et al.，1994)，產(chǎn)生一系 列允許對選擇標(biāo)記、表達盒和融合蛋白進行選擇的載體(以PCAMBIA范圍的開放源代碼 雙兀載體(open source binaryvector)為例:http//www, cambia. org/daisy/bioforge leRacy/3725. html)，或者通過開發(fā)用于將無關(guān)DNA整合最小化和無標(biāo)記轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)(例如 pCLEAN ；Thole et al.，2007)。人們也已對雙元載體進行工程化改造使其以低拷貝數(shù)復(fù)制，以便降低同一轉(zhuǎn)基因 多次整合事件的頻率，因為這會導(dǎo)致基因沉默(Johansen andCarrington, 2001) 0然而，對于瞬時表達，并不嚴(yán)格需要保證高效整合到宿主核內(nèi)和存在用于植體 內(nèi)選擇(in planta selection)的標(biāo)記。而且，在農(nóng)桿菌滲透時，每個細(xì)胞都遇到大量 T-DNA分子，這些分子被認(rèn)為即使沒有基因組整合也能夠在核內(nèi)轉(zhuǎn)錄(transcriptionally competent in the nucleus)(Janssen and Gardner, 1989 ；Narasimhulu et al. ,1996)。 這提示，更高拷貝數(shù)的雙元質(zhì)?？赡苡幸嬗谒矔r表達。改良雙元載體的另一個領(lǐng)域是降低載體骨架的大小。pPZPOfajdukiewicz et al.，1994)和pGREEN(Helens et al. ,2000a)這兩個實例一直都在證明著較小質(zhì)粒的好處。 除了提高克隆程序和細(xì)菌轉(zhuǎn)化的效率之外，這些載體還為那些依賴于單個T-DNA上存在的 多個表達盒的表達系統(tǒng)提供了模板(Tzfira et al.，2005 ；Thole et al.，2007)。本實施例公開了這種載體的非顯而易見的改良，其允許在單個步驟內(nèi)完成克隆， 而不必將表達盒在克隆載體(例如pM81-FSC2)和表達載體(例如PBINPLUS)之間進行亞 克隆，方便了該載體實際使用。更具體地，這里的結(jié)果顯示，有可能大大降低PBINPLUS的大 小，而不會損害其在復(fù)制和T-DNA轉(zhuǎn)化方面的性能。而且，CPMV-HT系統(tǒng)的元件已經(jīng)已模塊 化的方式合并到所得的載體內(nèi)，使得多個蛋白質(zhì)可以從單個T-DNA表達。通過這些改良獲 得了一種多功能的高水平表達載體，便于高效地直接克隆外來基因。2. 2材料和方法pBD-FSC2-512-U 162C(HT)，含有被插入在 pBINPLUS PacI/AscI 位點內(nèi)的 FSC2-512-U162C 盒(見實施例 1) (van Engelen et al.，1995)。使用高保真聚合酶 PHUSI0N(New England Biolabs)和編碼用于再連接的獨特限制酶位點的寡核苷酸(表 4. 1)擴增該質(zhì)粒的基本節(jié)段(見下文)。T-DNA區(qū)的擴增使用與獨特Ahdl位點上游序列同 源的有義引物(pBD-LB-F)和包含Apal位點的反義引物(pBD-RB-Apal-R)。使用含有Apal 位點的有義引物(pBD-ColEI-Apal-F)和含有Spel位點的反義引物(pBD-TrfA-Spel-R)擴 增出了一個包含ColEI復(fù)制起點、NPTIII基因和TrfA座位的區(qū)域。使用含有Spel位點的有義引物(pBD-oriVSpel-F)和含有AhdI位點的反義引物(pBD-oriV-Ahdl-R)擴增了 RK2 復(fù)制起點(OriV)。純化后，根據(jù)它們末端編碼的獨特限制位點對這些產(chǎn)物進行消化，并混 合進行三點連接。這樣就產(chǎn)生了質(zhì)粒pEAQbeta，并通過測序確認(rèn)其連接部位。檢測到了 T-DNA的大約1. 2kb的一段缺失，其除去了 CPMV-GFP-HT盒的nos終止子的一部分。因此， 用引物 pMini > pMicroBIN-F2 和 pBD-RB-Apal-R 再擴增包含源自 pBD-FSC2-GFP_HT 的右 邊界的一部分終止子，并用引物PBD-ColEI-ApaI-F和pMini > pMicroBIN-R(表4. 1)再擴 增pEAQbeta骨架，包括右邊界。純化的產(chǎn)物用ApaI和FseI消化，并連接產(chǎn)生pEAQ(圖9)。用35SP19-PacI-F 和 35SP19-AscIR，或 35SP19-FseI-F和 35S-P19-FseI-R 作為引 物(表4. 1)從pBIN61-P19 (Voinnet et al.，2003)擴增兩側(cè)為35S啟動子和35S終止子 的 P19 基因。用引物 pBD-NPTII-Fsel-F 和 pBD-NPTII-Fsel-R(表 4. 1)從 pBD_FSC2_GFPHT 擴增兩側(cè)為nos啟動子和終止子的NPTII基因。A加尾(A-tailing)后，將擴增的盒連接 到pGEM-T easy (Promega)中。將用FseI從pGEM-T easy切出的P19盒連接到FseI消化 的pEAQ-GFP-HT中，得到pEAQexpress-GFP-HT。將用FseI切出的NPTII盒以兩個方向連接 到 FseI 消化的 pEAQ-GFP-HT 中，得到 pEAQselectK-GFP-HT 和 pEAQseIectK (rev)-GFP-HT。 又用PacI/AscI切離NPTII盒，并連接到pEAQselectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位點內(nèi)，給出 pEAQspecialK-GFP-HT。通過 QUICKCHANGE 方法(Stratagene)對 pGEM-T 中的 P19 進行定 點突變，用引物P19-R43W-F和P19-R43W-R將精氨酸43轉(zhuǎn)變成色氨酸殘基。用PacI/AscI 消化以釋放出突變體P19盒，并插入到pEAQseIectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位點內(nèi)，得到 pEAQspecialKm-GFP-HT。將編碼短多接頭的有義和反義鏈的寡核苷酸(表4.1)退火，在5’端留下NruI 位點的下游半段，在3’端留下與XhoI匹配的突出端(overhang)。退火的寡核苷酸與經(jīng) NruI/XhoI 消化的 pM81_FSC2-A115G_U162C(見上文)連接，得到 pM81-FSC2_P0W。通過利 用引物 P19- Δ NruI-F 和 Ρ19- Δ NruI-R 定點突變(QUICKCHANGE ；Stratagene)從 pGEM-T 中的P19盒中除去NruI位點，并重新插入到pEAQseIectK-GFP-HT的AsiSI/MluI位點 內(nèi)，得到 pEAQspecialK Δ NruI-GFP-HT，其在表達上與 pEAQspecialK-GFP-HT 相比沒有減 少(數(shù)據(jù)未顯示)。然后從PM81-FSC2-P0W釋放PacI/AscI片段，并插入到經(jīng)同樣消化的 pEAQspecialK Δ NruI-GFP-HT中，借此替代GFP HT表達盒，并產(chǎn)生pEAQ-HT。用一組4個引 物(表4. 1)以三種組合從pBD-FSC2-GFP-HT擴增GFP，用于插入到pEAQ-HT =GFP-AgeI-F 和 GFP-XhoI-R ；GFP-AgeI-F 和 GFP-XmaI-R ；以及 GFP-XmaI-F 和 GFP-XhoI-R0 純化的 PCR產(chǎn)物用其引物中設(shè)定的酶消化，并插入到適當(dāng)消化的pEAQ-HT中，得到pEAQ-HT_GFP， pEAQ-HT-GFPHis，和 pEAQ-HT-HisGFP。表4. 1.用于擴增和誘變的寡核苷酸。限制酶位點或其部分用小寫字母顯示，突變 用粗體下劃線標(biāo)記。
權(quán)利要求
一種源自二分體RNA病毒RNA 2基因組節(jié)段的表達增強子序列，其中所述RNA 2基因組節(jié)段中的目標(biāo)起始位點已突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的表達增強子序列，其中所述二分體RNA病毒是豇豆花葉病毒屬病
3.根據(jù)權(quán)利要求2的表達增強子序列，其中所述豇豆花葉病毒屬病毒是豇豆花葉病
4.一種分離的核酸，其由或基本上由根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的表達增強子序列組成。
5.一種用于提高源自二分體病毒RNA-2基因組節(jié)段的序列的表達或其翻譯增強活性 的方法，包括突變其中的目標(biāo)起始位點。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述二分體RNA病毒是豇豆花葉病毒屬病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述豇豆花葉病毒屬病毒是豇豆花葉病毒。
8.一種基因表達構(gòu)建體，其包括(a)根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的增強子序列；和(b)用于輔助將編碼目的蛋白的基因插入到基因表達系統(tǒng)的異源序列，其中該異源序 列位于增強子序列中突變的目標(biāo)起始位點的下游；和任選地(c)3，UTR。
9.一種表達盒，包括(i)啟動子，其可操作地連接于( )根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的增強子序列；(iii)期望表達的目的基因；(iv)終止子序列；和任選地(ν)位于所述終止子序列上游的3’ UTR0
10.一種基因表達系統(tǒng)，包括根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的增強子序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的基因表達系統(tǒng)，進一步包括編碼目的蛋白的基因，其中該編碼 目的蛋白的基因位于所述增強子序列的下游。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的基因表達系統(tǒng)，其中所述編碼目的蛋白的基因與啟動子和終止 子序列可操作地連接。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的基因表達系統(tǒng)，其中所述編碼目的蛋白的基因位于所述增強子 序列的下游和所述終止子序列的上游。
14.根據(jù)權(quán)利要求8-13任一項的基因表達系統(tǒng)，其包括或進一步包括3’UTR,所述 3，UTR任選地源自相同的二分體RNA病毒。
15.一種基因表達系統(tǒng)，其包括根據(jù)權(quán)利要求8或9的表達構(gòu)建體或表達盒。
16.一種用于在宿主生物體內(nèi)表達目的蛋白的方法，其使用根據(jù)權(quán)利要求10-15任一 項的基因表達系統(tǒng)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該宿主生物體是真核宿主，所述真核宿主任選地是 植物或昆蟲。
18.一種增強從與源自RNA-2的序列可操作地連接的編碼異源蛋白的可讀框(ORF)或 基因翻譯該異源蛋白的方法，包括突變該源自RNA-2的序列內(nèi)的目標(biāo)起始位點。
19.一種基因表達系統(tǒng)，其包括(a)第一基因構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括經(jīng)截短的二分體病毒基因組RNA-2，其攜帶至少一 個與啟動子或終止子序列可操作地連接的編碼目的異源蛋白的外來基因，其中該基因構(gòu)建 體包括位于外來基因上游的突變的目標(biāo)起始位點；和任選地(b)第二基因構(gòu)建體，其任選地整合在所述第一基因構(gòu)建體內(nèi)，包括與啟動子和終止子 序列可操作地連接的基因沉默抑制子。
20.一種在植物中表達蛋白質(zhì)的方法，包括如下步驟(a)向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入基因表達構(gòu)建體，其包括第一基因構(gòu)建體，該第一基因構(gòu)建體包 含經(jīng)截短的二分體病毒基因組RNA-2，其攜帶至少一個與啟動子或終止子序列可操作地連 接的編碼目的異源蛋白的外來基因，其中該基因構(gòu)建體包括位于所述外來基因上游的突變 的目標(biāo)起始位點；和任選地(b)向植物細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入第二基因構(gòu)建體，其任選地整合在所述第一基因構(gòu)建體內(nèi)，包括 與啟動子和終止子序列可操作地連接的基因沉默抑制子。
21.根據(jù)權(quán)利要求16-17任一項的方法，包括向宿主生物體內(nèi)引入該基因表達系統(tǒng)的 步驟。
22.—種宿主生物體，其通過根據(jù)權(quán)利要求20-21任一項的方法獲得或可通過根據(jù)權(quán) 利要求20-21任一項的方法獲得，其中所述編碼目的蛋白的基因以更高的水平表達。
23.用根據(jù)權(quán)利要求10-15和19中任一項的基因表達系統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染的宿主生物體。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23的宿主生物體，其中該宿主生物體是植物或植物細(xì)胞。
25.一種轉(zhuǎn)基因宿主生物體，其用根據(jù)權(quán)利要求10-15和19任一項的基因表達系統(tǒng)穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化。
26.—種產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法，包括使用根據(jù)權(quán)利要求22-24中任一項的宿主生物 體，和任選地收集已經(jīng)表達目的蛋白質(zhì)的組織并從該組織分離目的蛋白質(zhì)。
27.一種基因表達系統(tǒng)，其包括(a)啟動子；(b)位于所述啟動子下游的如表1所示的豇豆花葉病毒RNA-2基因組節(jié)段序列的核苷 酸1-507，其中第161位的AUG已如表2所示突變；(c)位于(b)中定義的序列下游的編碼目的蛋白質(zhì)的基因；(d)位于所述編碼目的蛋白質(zhì)的基因下游的如表1所示的豇豆花葉病毒RNA-2基因組 節(jié)段序列的核苷酸3302-3481 ；和(e)位于(d)中定義的序列下游的胭脂氨酸合酶終止子。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的基因表達系統(tǒng)的變體，其中該基因表達系統(tǒng)包括(a)啟動子；(b)位于所述啟動子下游的與表1所示豇豆花葉病毒RNA-2基因組節(jié)段序列的核苷酸 1-507具有至少70%同一性的表達增強子序列，其中第161位的AUG已突變；(c)位于(b)中定義的序列下游的編碼目的蛋白質(zhì)的基因；(d)位于所述編碼目的蛋白質(zhì)的基因下游的如表1所示的豇豆花葉病毒RNA-2基因組 節(jié)段序列的核苷酸3302-3481 ；和(e)位于(b)中定義的序列下游的胭脂氨酸合酶終止子。
29. 一種在植物中表達目的蛋白質(zhì)的方法，其使用根據(jù)權(quán)利要求27-28中任一項的基 因表達系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明是基于來自二分體RNA病毒RNA-2基因組節(jié)段的表達增強子序列，其中RNA-2基因組節(jié)段中的目標(biāo)起始位點被突變。刪除主RNA-2翻譯起始上游的合適起始密碼子能夠大大增加外來蛋白質(zhì)的積累，而無需病毒復(fù)制。還提供了方法、載體和系統(tǒng)，包括基于“超翻譯”豇豆花葉病毒(“CPMV-HT”)的蛋白表達系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/82GK101952446SQ200980105869
公開日2011年1月19日 申請日期2009年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日
發(fā)明者喬治·P·洛莫諾索夫, 弗蘭克·塞恩斯伯里 申請人:植物生物科學(xué)有限公司