本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體的說是一種兼具定向ta克隆，無背景粘性末端克隆和表達(dá)功能的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

分子克隆是研究基因結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)。分子克隆方法可分為兩類：依賴連接酶的克隆和不依賴連接酶的克隆。其中，依賴連接酶的克隆方法主要有三種，包括：平末端連接、粘性末端連接和ta克隆。近些年，各種不依賴連接酶的克隆策略也得到快速發(fā)展，比如：cpec、fastcloning、gateway、lic、oec、pipe、slic、slice、user和重組酶克隆等技術(shù)（yaos,hartdj,any.recentadvancesinuniversaltacloningmethodsforuseinfunctionstudies.proteinengdessel.2016;1-6.）。盡管不依賴連接酶的克隆方法有很多成功的應(yīng)用實例，但是仍然不能完全取代依賴連接酶的克隆方法。

作為一種依賴連接酶的克隆方法，粘性末端連接方法是目前應(yīng)用最為廣泛的分子克隆方法之一。但在某些情況下，由于無法獲取合適的限制性酶切位點，因此為粘性末端克隆帶來了不便。另外，由于產(chǎn)生粘性末端的酶切位點都具有回文結(jié)構(gòu)，經(jīng)酶切后的末端能與其自身互補(bǔ)，所以容易在后續(xù)的克隆步驟中產(chǎn)生兩個質(zhì)粒載體之間的連接和環(huán)化，從而產(chǎn)生假陽性。而ta克隆方法是利用某些dna聚合酶（如taq聚合酶）的末端轉(zhuǎn)移酶活性，在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）擴(kuò)增插入片段的過程中在產(chǎn)物的3'端額外加入一個堿基“a”。而ta克隆所使用的t載體的3'端有一個凸出的堿基“t”，剛好可以與上述插入片段的3'末端的堿基“a”互補(bǔ)配對，通過連接可以實現(xiàn)ta克隆。ta克隆是目前克隆pcr產(chǎn)物最快捷、簡便的方法之一。該方法無需選擇合適的酶切位點，甚至可用于克隆序列未知的dna片段。目前，t載體的制備方法常見的有兩種。一種方法是在質(zhì)粒載體的多克隆位點中引入特定的酶切位點，用某些內(nèi)切酶酶切能夠產(chǎn)生3'端具有單個凸出的堿基“t”的線性t載體。另一種方法是利用某些dna聚合酶（如taq酶）不依賴模板的末端轉(zhuǎn)移酶活性，將單個脫氧胸腺核苷酸（dttp）添加到線狀載體3'端（marchukd,drummm,saulinoa,collinsfs.constructionoft-vectors,arapidandgeneralsystemfordirectcloningofunmodifiedpcrproducts.nucleicacidsres.1991;19(5):1154.）。與第二種方法相比，第一種方法更穩(wěn)定、快捷、高效。另外，第二種方法在制備t載體時，會出現(xiàn)加尾效率較低和加尾過程中線性質(zhì)粒兩端的序列有時會被部分刪除等問題（shumans.novelapproachtomolecularcloningandpolynucleotidesynthesisusingvacciniadnatopoisomerase.jbiolchem.1994dec23;269(51):32678-32684.）。目前ta克隆主要存在的問題是克隆過程中片段可以隨機(jī)的以正反兩個方向插入到t載體中，這就造成了至少有一半的克隆外假陽性，從而增加了篩選的壓力。

盡管粘性末端克隆和ta克隆都有很多成功的例子，但是如何有效地解決粘性末端克隆過程中無法獲取合適的限制性酶切位點，不利于克隆的順利進(jìn)行。另外，由于酶切位點具有回文結(jié)構(gòu)，而導(dǎo)致的兩個質(zhì)粒載體之間的連接和環(huán)化，也是一個是亟待解決的問題。另外，實現(xiàn)定向ta克隆，減小后續(xù)篩選的工作量，也具有重要的意義，但是目前還沒有任何質(zhì)粒載體能夠同時解決上述兩個問題。既有克隆功能，又具有表達(dá)功能的載體具有顯著的優(yōu)勢。但是目前很多載體只適用于克隆，而實現(xiàn)目的基因的表達(dá)與純化則需要亞克隆到表達(dá)載體上。因此，既有克隆功能，又具有表達(dá)功能的載體具有顯著的優(yōu)勢。

現(xiàn)有的質(zhì)粒載體雖然已經(jīng)很多，但是普遍存在一些缺點，比如克隆效率不高，特別是過程中經(jīng)常會出現(xiàn)假陽性，從而增加了后續(xù)篩選的壓力。這些假陽性可能是由于載體的酶切不夠徹底，或者是兩個載體之間發(fā)生了收尾相連并形成環(huán)化。而ta克隆作為一種簡易的克隆方法，則存在克隆過程無法定向的問題（即只有一半的克隆的插入片段與載體的連接方式與預(yù)期相符）。另外，常用的t載體不能兼具克隆和表達(dá)功能。

綜上所述，一種不依賴限制性酶切位點、可避免質(zhì)粒載體之間的連接和環(huán)化、同時能夠用于實現(xiàn)定向ta克隆，并具有表達(dá)和純化功能的載體具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有廣泛的應(yīng)用前景、兼具定向ta克隆，無背景粘性末端克隆和表達(dá)功能的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種可用于定向ta克隆和無背景粘性末端克隆，并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體，載體包括啟動子和終止子，載體為閉合環(huán)狀雙鏈dna，含有兩個克隆位點區(qū)，每個克隆位點區(qū)含有一個ahdi位點和一個bsai位點。兩個ahdi位點分別能產(chǎn)生凸出“t”末端并引入avrii和ncoi識別位點一半序列；而這兩個bsai位點經(jīng)過酶切后可引入兩個互補(bǔ)對稱的粘性末端，其3’凸出堿基序列不互補(bǔ)，而且每個粘性末端的3’凸出堿基序列不會自身回文互補(bǔ)，可有效避免粘性末端克隆過程中載體片段的首尾相連，從而實現(xiàn)完全無背景的粘性末端克隆。在兩個克隆位點區(qū)之間為毒性蛋白標(biāo)記ccdb基因。

所述載體還包括卡納霉素抗性基因序列、pmb1復(fù)制子和c末端his-tag編碼序列。

所述啟動子為t7啟動子，終止子為t7終止子。

所述載體為seqidno:1中所示的堿基序列；載體中所示的dna功能區(qū)：特殊設(shè)計的克隆位點區(qū)的ahdi位點用于制備t載體，進(jìn)行ta克隆；bsai位點用于制備末端隨機(jī)的粘性末端載體，進(jìn)行粘性末端克隆；t7promoter和t7terminator使該質(zhì)粒具有蛋白表達(dá)功能；c末端his-tag區(qū)使得表達(dá)后的蛋白能被鎳柱純化；ccdb基因序列編碼毒性蛋白，作為克隆過程的負(fù)篩選標(biāo)記，確?？寺]有假陽性。

一種可用于定向ta克隆和無背景粘性末端克隆，并具有表達(dá)功能的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法：

1）以質(zhì)粒pet3a為模板，phis-for1和phis-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1，待用；phis-for1：5’-aaaactgcagcaccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctg-3’和phis-rev1：5’-gtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagggatatccggatatagttcctcctttc-3’；

2）以質(zhì)粒pet9a為模板，pet9-for1和pet9-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段2，待用；pet9-for1:5’-gaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactac-3’和pet9-rev1:5’-caaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgttt-3’；

3）以上述片段1和片段2混合物為模板，phis-for1和pet9-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1+2，待用；

4）以質(zhì)粒pet3a為模板，pt7-for2和pt7-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段3，待用；pt7-for2：5’-gttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgac-3’和pt7-rev2：5’-aaaactgcagcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggg-3’；

5）以上述片段1+2和片段3混合物為模板，phis-for1和pt7-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1+2+3，待用；

6）將步驟5）獲得pcr產(chǎn)物（即片段1+2+3）經(jīng)pcr純化后，同時用psti單酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠，回收酶切產(chǎn)物；

7）將步驟6）得到的酶切后的片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109菌株，再經(jīng)抗性篩選即得質(zhì)粒載體pany-orig。所述連接體系為含175ut4dna連接酶（takaraco.），1×連接buffer，約30ng酶切產(chǎn)物（步驟6）得到的片段。

8）以質(zhì)粒phiskan5為模板，ccdb-for2-middle和ccdb-rev2-middle為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段4，待用；ccdb-for2-middle：5’-gcctgtcgaccctgggtctggagaccggcttactaaaagccagataacagtatgcg-3’和ccdb-rev2-middle：5’-ccaggcctgaccataggtcgacgagagaccgactggctgtgtataagggagcctgac-3’；

9）以步驟8）所獲得的片段4為模板，ccdb-for2和ccdb-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段5，待用；ccdb-for2：5’-cgcgcatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctggagaccggc-3’和ccdb-rev2：5’-catctgcaggagctcggatccaggcctgaccataggtcgacgagagaccgactggc-3’；

10）將步驟9）獲得pcr產(chǎn)物（即片段5）和步驟7）獲得pany-orig同時用psti和ndei進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產(chǎn)物；

11）將步驟10）得到的酶切后的片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌db3.1菌株，再經(jīng)抗性篩選即得質(zhì)粒載體pany2。所述連接體系為含175ut4dna連接酶（takaraco.），1×連接buffer，約30ng酶切產(chǎn)物（步驟10）得到的兩個片段。

與現(xiàn)有的克隆和表達(dá)質(zhì)粒相比，本發(fā)明pany2具有以下顯著優(yōu)勢：

1）不同于以往的t載體，本發(fā)明制備的t載體可以實現(xiàn)定向ta克隆。由于質(zhì)粒載體中ahdi位點的獨特設(shè)計，使得酶切后在載體片段兩端各引入一個3’凸出一個“t”堿基的同時，分別引入一半的avrii和ncoi識別位點。在插入片段的末端設(shè)計另外一半的avrii和ncoi識別位點，這樣ta克隆過程中反向連接的產(chǎn)物將同時具有完整的avrii和ncoi識別位點，這樣可以通過酶切的方式剔除反向連接產(chǎn)物，從而實現(xiàn)定向ta克隆。

2）與常規(guī)粘性末端克隆載體不同的是，本克隆載體可以實現(xiàn)完全無背景的粘性末端克隆。本載體通過bsai酶切可引入兩個粘性末端，其3’凸出堿基序列不互補(bǔ)，而且每個粘性末端的3’凸出堿基序列自身也不回文互補(bǔ)，這樣可有效避免粘性末端克隆過程中載體片段的首尾相連，從而實現(xiàn)完全無背景的粘性末端克隆。

3）通常情況下，在載體的制備過程中，質(zhì)粒由于酶切不夠徹底等原因，會導(dǎo)致非重組轉(zhuǎn)化子的本底過高，產(chǎn)生假陽性。而在制備載體的過程中，雖然可以通過電泳和膠回收的方法幫助去除這些未經(jīng)酶切的質(zhì)粒，這樣不僅增加了工作量，而且效果往往不夠理想。而pany2在兩個克隆位點間隔區(qū)引入了毒蛋白基因ccdb，作為負(fù)篩選標(biāo)記。這樣，在載體制備過程中不需要膠回收等復(fù)雜步驟，就可以徹底清除前載體污染，實現(xiàn)零背景克隆。

4）通常情況下，大片段的克隆效率較低。而pany2的載體部分小于2kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于目前常見的質(zhì)粒載體，使得該載體在克隆的過程中效率顯著優(yōu)于現(xiàn)在的大部分克隆載體。

5）本質(zhì)粒載體既有克隆功能，又具有表達(dá)功能，這樣克隆后得到的重組質(zhì)粒不需要進(jìn)行亞克隆就能實現(xiàn)表達(dá)，因此具有一定的優(yōu)勢。另外，該質(zhì)粒載體具有c末端組氨酸標(biāo)簽his-tag，因此既可以對克隆的片段進(jìn)行表達(dá)，又可以方便地進(jìn)行蛋白質(zhì)純化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例提供的pany2質(zhì)粒圖譜。其中t7promotor：t7啟動子；t7terminator：t7終止子；histag：組氨酸尾巴；kana：卡那霉素抗性蛋白；pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；rbs：核糖體結(jié)合位點；ccdb：編碼ccdb毒蛋白的基因序列，ccdb蛋白通過干擾大腸桿菌的dna促旋酶，抑制大多數(shù)大腸桿菌（如jm109、dh5α、bl21等）的生長增殖，但是不抑制特殊大腸桿菌菌株（如db3.1）的生長繁殖；ahdi：ahdi酶切位點；bsai：bsai酶切位點。

圖2為本發(fā)明實施例提供的pany2的bsai酶切電泳圖（m：dnaladder；1：pany2酶切）。

圖3為本發(fā)明實施例提供的pany2的ahdi酶切電泳圖（m：dnaladder；1：pany2酶切）。

圖4為本發(fā)明實施例提供的定向ta克隆的過程示意圖。質(zhì)粒pany2的多克隆位點區(qū)含有兩個ahdi，經(jīng)過ahdi酶切后，在載體末端引入3’-t的同時還產(chǎn)生avrii和ncoi一半的識別序列；而用于pcr擴(kuò)增插入片段的引物序列中則含有avrii和ncoi的另外一半識別序列。如果連接方向與預(yù)期相反，則會產(chǎn)生新的avrii和ncoi酶切位點；而連接方向與預(yù)期相符時，則不會產(chǎn)生新的avrii和ncoi酶切位點。這樣，就可以通過avrii或ncoi酶切，剔除反向連接的克隆，從而達(dá)到定向ta克隆。

圖5為本發(fā)明實施例提供的pany2-ta-pflama雙酶切（ndei和psti雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1：pany2-ta-pflama雙酶切）。

圖6為本發(fā)明實施例提供的pany2-ta-pflama物理圖譜，其中pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；rbs：核糖體結(jié)合位點；t7promotor：t7啟動子；t7terminator：t7終止子；kana：卡那霉素抗性蛋白；histag：組氨酸尾巴；pflama（+）：正向連接的編碼凝結(jié)多糖水解酶基因序列。

圖7為本發(fā)明實施例提供的無背景粘性末端克隆的過程示意圖。a.質(zhì)粒pany2的多克隆位點區(qū)含有兩個bsai，經(jīng)過bsai酶切后，在線性載體的兩側(cè)引入可任意設(shè)計的粘性末端；而用于pcr擴(kuò)增插入片段的引物序列中也含有bsai識別位點，可以通過bsai產(chǎn)生可任意設(shè)計的粘性末端。由于插入片段和載體的粘性末端完全互補(bǔ)，所以通過連接可將插入片段連入載體中。在連接過程中加入bsai酶進(jìn)行酶切，可以避免原始質(zhì)粒的污染。b.由于可任意設(shè)計的粘性末端不是回文結(jié)構(gòu)，所以可以有效的避免載體自身環(huán)化或者兩個載體之間收尾互連，從而實現(xiàn)無背景粘性末端克隆。

圖8為本發(fā)明實施例提供的pany2-sticky-pflama雙酶切（ndei和psti雙酶切）電泳圖（m：dnaladder；1-4：pflama雙酶切）。

圖9為本發(fā)明實施例提供的pany2-sticky-pflama物理圖譜，其中pmb1replicon：大腸桿菌pmb1型復(fù)制子；rbs：核糖體結(jié)合位點；t7promotor：t7啟動子；t7terminator：t7終止子；kana：卡那霉素抗性蛋白；histag：組氨酸尾巴；pflama：編碼凝結(jié)多糖水解酶基因序列。

圖10為sds-page電泳檢測蛋白表達(dá)水平和純化效率圖。m：proteinladder；1：含pany2空質(zhì)粒的菌的粗提液；2：含pany2空質(zhì)粒菌裂解液的純化；3：含pet11-pflama質(zhì)粒菌的粗提液；4：含pet11-pflama質(zhì)粒菌裂解液的純化；5：含pany2-ta-pflama質(zhì)粒菌的粗提液；6：含pany2-ta-pflama質(zhì)粒菌裂解液的純化；7：含pany2-sticky-pflama質(zhì)粒菌的粗提液；8：含pany2-sticky-pflama質(zhì)粒菌裂解液的純化。

圖11為剛果紅法檢測pany2表達(dá)pflama的酶活性圖；1：含pany2質(zhì)粒的菌株表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化產(chǎn)物；2：含有pet11-pflama的菌株表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化產(chǎn)物；:3：含有pany2-ta-pflama的菌株表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化產(chǎn)物；4：含有pany2-sticky-pflama的菌株表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化產(chǎn)物。

圖12為dns法測定pany2表達(dá)pflama的酶活性圖，1：凝結(jié)多糖空白對照；2：含有pany2空質(zhì)粒的菌表達(dá)的蛋白分解凝結(jié)多糖；3：含有pet11-pflama的菌表達(dá)的蛋白分解凝結(jié)多糖；4：含有pany2-ta-pflama的菌表達(dá)的蛋白分解凝結(jié)多糖；5：含有pany2-sticky-pflama的菌表達(dá)的蛋白分解凝結(jié)多糖。

具體實施方式

下面結(jié)合說明書附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明。質(zhì)粒載體為閉合環(huán)狀的雙鏈dna，含有兩個多克隆位點區(qū)，在兩個多克隆位點區(qū)之間存在一個ccdb表達(dá)框，可在多數(shù)大腸桿菌菌株中組成型表達(dá)毒性蛋白ccdb，作為負(fù)篩選標(biāo)記?；谫|(zhì)粒載體的多克隆位點的設(shè)計，該質(zhì)?？捎糜谶M(jìn)行定向ta克隆和改進(jìn)的無背景粘性末端克隆。另外，本質(zhì)粒載體還可以直接用于蛋白表達(dá)和純化。各功能均得到驗證。本發(fā)明所涉及的質(zhì)粒載體因其更方便和高效，將在基因工程領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

本發(fā)明構(gòu)建新型的質(zhì)粒，同時兼具以下優(yōu)勢與特點：1）將avrii和ncoi酶切位點的部分序列設(shè)計到質(zhì)粒的ahdi和插入片段的引物中，這樣ta克隆后可通過avrii和ncoi酶切將連接方向與預(yù)期相反的克隆刪除，從而實現(xiàn)定向ta克?。?）本質(zhì)粒通過兩種策略實現(xiàn)無背景粘末端克?。嘿|(zhì)粒的多克隆位點之間插入了ccdb毒蛋白編碼基因，可以避免由于載體酶切不徹底造成的假陽性；通過bsai在載體和插入片段中分別引入非回文結(jié)構(gòu)的dna序列，克隆過程中，載體和插入片段粘性末端互補(bǔ)配對的同時，載體不能發(fā)生分子內(nèi)或分子間自連；3）該質(zhì)粒既具有無背景定向基因克隆的功能，又能通過iptg誘導(dǎo)實現(xiàn)蛋白蛋白表達(dá)。同時由于質(zhì)粒上具有組氨酸標(biāo)簽，所以還能利用鎳柱對表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化。在應(yīng)用實例中，本發(fā)明質(zhì)粒載體在定向ta克隆、無背景粘性末端克隆、蛋白表達(dá)和純化方面的功能得到了驗證。本發(fā)明質(zhì)粒載體既可以同時應(yīng)用兩種常用的克隆策略，而且可高效、方便地進(jìn)行蛋白表達(dá)和純化，從而節(jié)省了亞克隆步驟，因此本發(fā)明質(zhì)粒載體因其高效、便捷，預(yù)期將在生物科學(xué)的各個領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

實施例1:質(zhì)粒載體pany2的獲得

1）以質(zhì)粒pet3a為模板，phis-for1和phis-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1，待用；phis-for1：5’-aaaactgcagcaccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctg-3’和phis-rev1：5’-gtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcagggatatccggatatagttcctcctttc-3’。pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

2）以質(zhì)粒pet9a為模板，pet9-for1和pet9-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段2，待用；pet9-for1:5’-gaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactac-3’和pet9-rev1:5’-caaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgttt-3’；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

3）以上述片段1和片段2混合物為模板，phis-for1和pet9-rev1為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1+2，待用；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板各2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

4）以質(zhì)粒pet3a為模板，pt7-for2和pt7-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段3，待用；pt7-for2：5’-gttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgac-3’和pt7-rev2：5’-aaaactgcagcatatgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggg-3’；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

5）以上述片段1+2和片段3混合物為模板，phis-for1和pt7-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段1+2+3，待用；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板各2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，4min）×25，72℃最后延伸10min。

6）將步驟5）獲得pcr產(chǎn)物（即片段1+2+3）經(jīng)pcr純化后，同時用psti單酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產(chǎn)物。

7）將步驟6）得到的酶切后的片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接，而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109菌株，再經(jīng)抗性篩選即得質(zhì)粒載體pany-orig。

8）以質(zhì)粒phiskan5為模板，ccdb-for2-middle和ccdb-rev2-middle為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段4，待用；ccdb-for2-middle：5’-gcctgtcgaccctgggtctggagaccggcttactaaaagccagataacagtatgcg-3’和ccdb-rev2-middle：5’-ccaggcctgaccataggtcgacgagagaccgactggctgtgtataagggagcctgac-3’；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

9）以步驟8）所獲得的片段4為模板，ccdb-for2和ccdb-rev2為上下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物命名為片段5，待用；ccdb-for2：5’-cgcgcatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctggagaccggc-3’和ccdb-rev2：5’-catctgcaggagctcggatccaggcctgaccataggtcgacgagagaccgactggc-3’；pcr擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：20μl反應(yīng)體系中含10xpfubuffer2μl，引物各10μmol/l，2upfu酶，0.2mmol/ldntps，模板2ng左右，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr擴(kuò)增的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。

10）將步驟9）獲得pcr產(chǎn)物（即片段5）和步驟7）獲得pany-orig同時用psti和ndei進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠,回收酶切產(chǎn)物；

11）將步驟10）得到的酶切后的片段于連接體系內(nèi)在室溫下進(jìn)行連接。20μl連接體系為含175ut4dna連接酶（takaraco.），1×連接buffer（takaraco.），約30ng酶切產(chǎn)物（步驟3）片段）。而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌db3.1菌株，再經(jīng)抗性篩選即得質(zhì)粒載體pany2。經(jīng)kana抗性和雙酶切（ndei和psti）驗證篩選得到陽性菌落，陽性菌落液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)測序鑒定正確后命名為pany2。該質(zhì)粒具有序列表中序列1所示的核苷酸序列。

seqidno:1pany2(2664bp)：

caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctggagaccggcttactaaaagccagataacagtatgcgtatttgcgcgctgatttttgcggtataagaatatatactgatatgtatacccgaagtatgtcaaaaagaggtatgctatgaagcagcgtattacagtgacagttgacagcgacagctatcagttgctcaaggcatatatgatgtcaatatctccggtctggtaagcacaaccatgcagaatgaagcccgtcgtctgcgtgccgaacgctggaaagcggaaaatcaggaagggatggctgaggtcgcccggtttattgaaatgaacggctcttttgctgacgagaacaggggctggtgaaatgcagtttaaggtttacacctataaaagagagagccgttatcgtctgtttgtggatgtacagagtgatattattgacacgcccgggcgacggatggtgatccccctggccagtgcacgtctgctgtcagataaagtctcccgtgaactttacccggtggtgcatatcggggatgaaagctggcgcatgatgaccaccgatatggccagtgtgccggtctccgttatcggggaagaagtggctgatctcagccaccgcgaaaatgacatcaaaaacgccattaacctgatgttctggggaatataaatgtcaggctcccttatacacagccagtcggtctctcgtcgacctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag

實施例2:上述實例獲得pany2用于定向ta克隆的功能驗證

采用pany2進(jìn)行定向ta克隆的過程和原理如圖4所示。質(zhì)粒pany2的多克隆位點區(qū)含有兩個ahdi，經(jīng)過ahdi酶切后，在載體末端引入3’-t的同時還產(chǎn)生avrii和ncoi一半的識別序列；而用于pcr擴(kuò)增插入片段的引物序列中則含有avrii和ncoi的另外一半識別序列。如果連接方向與預(yù)期相反，則會產(chǎn)生新的avrii和ncoi酶切位點；而連接方向與預(yù)期相符時，則不會產(chǎn)生新的avrii和ncoi酶切位點。這樣，就可以通過avrii或ncoi酶切，剔除反向連接的克隆，從而達(dá)到定向ta克隆的目標(biāo)。

具體的克隆的步驟如下：

1）用ahdi酶切上述獲得質(zhì)粒pany2，酶切反應(yīng)體系如下：120μl酶切體系中包含10uahdi內(nèi)切酶（neb公司），1×buffer，4μgpany2質(zhì)粒dna。37℃酶切6小時后，經(jīng)過酶切后的大片段即是t載體，命名為pany2-t，不需膠回收。

2）以質(zhì)粒pet9d-pflama（ilaria,fiorilloa,angelaccios,florior,chiaralucer,vanderoostj,consalviv.crystalstructureofafamily16endoglucanasefromthehyperthermophilepyrococcusfuriosus--structuralbasisofsubstraterecognition.febsj.2009;276(4):1048-1058.）為模板，用pflama-for-ahdi（ggcatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacag）和pflama-rev-ahdi（aggaccactaacgaatgagtaaacccttacataatcc）引物進(jìn)行pcr。pcr反應(yīng)體系如下：20μl反應(yīng)體系中含10×pcrbuffer（takaraco.）2μl，2utaq酶，引物各10μmol/l，模板1ng，0.2mmol/ldntps，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。將pcr產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段。

3）將上述步驟2得到的片段與pany2-t（即t載體）進(jìn)行連接，連接體系為：20μl連接體系中含175ut4dna連接酶（takaraco.），1×連接buffer，5uavrii，5uncoi，30ngpcr和酶切產(chǎn)物。37℃反應(yīng)2小時。

將連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109菌株后，挑取經(jīng)kana抗性篩選得到的菌落，液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行ndei和psti雙酶切驗證（電泳圖如圖5所示）。隨機(jī)取陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，將測序鑒定ta連接成功的質(zhì)粒命名為pany2-ta-pflama（物理圖譜如圖6所示），該質(zhì)粒具有序列表中序列2核苷酸序列。隨機(jī)測序的結(jié)果表明，所有的陽性克隆均為正向連接，而且沒有假陽性克隆出現(xiàn)。所以，pany2可以有效的進(jìn)行t載體制備，并且用于定向ta克隆。

seqidno:2pany2-ta-pflama(2769bp)：

caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctggcatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggtcctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag

實施例3:對上述實例獲得pany2用于無背景粘性末端克隆的功能驗證

采用pany2進(jìn)行無背景粘性末端克隆的過程和原理如圖7-a所示。質(zhì)粒pany2的多克隆位點區(qū)含有兩個bsai，經(jīng)過bsai酶切后，在線性載體的兩側(cè)引入可任意設(shè)計的粘性末端；而用于pcr擴(kuò)增插入片段的引物序列中也含有bsai識別位點，可以通過bsai產(chǎn)生可任意設(shè)計的粘性末端。由于插入片段和載體的粘性末端完全互補(bǔ)，所以通過連接可將插入片段連入載體中。在連接過程中加入bsai酶進(jìn)行酶切，可以避免原始質(zhì)粒的污染。如圖7-b所示，由于可任意設(shè)計的粘性末端不是回文結(jié)構(gòu)，所以可以有效的避免載體自身環(huán)化或者兩個載體之間首尾互連，從而實現(xiàn)無背景粘性末端克隆。

其克隆過程的具體步驟為：

1）用bsai酶切上述獲得質(zhì)粒pany2，酶切反應(yīng)體系如下：120μl酶切體系中包含10ubsai內(nèi)切酶（neb公司），1×buffer，4μgpany2質(zhì)粒dna。37℃酶切1小時后，經(jīng)過酶切后的大片段即是粘性末端載體，不需膠回收。

2）以質(zhì)粒pet9d-pflama為模板，用pflama-for-bsai（gatcggtctcggtctatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacag）和pflama-rev-bsai（gtacggtctctgacgaccactaacgaatgagtaaacccttacataatcc）引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr反應(yīng)體系如下：20μl反應(yīng)體系中含10×pcrbuffer（takaraco.）2μl，2utaq酶，引物各10μmol/l，模板1ng，0.2mmol/ldntps，以滅菌的去離子水補(bǔ)齊；pcr的循環(huán)程序為：94℃預(yù)變性3min，（94℃，30s；63℃，30s；72℃，2min）×25，72℃最后延伸10min。將pcr產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收目的片段。

3）將上述步驟2得到的片段與步驟1得到的粘性末端載體進(jìn)行連接，連接體系為：20μl連接體系中含175ut4dna連接酶（takaraco.），1×連接buffer，30ngpcr和酶切產(chǎn)物。室溫連接16小時。將連接產(chǎn)物按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌jm109菌株后，挑取經(jīng)kana抗性篩選得到的菌落，液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行ndei和psti雙酶切驗證（電泳圖如圖8所示）。隨機(jī)取陽性克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序鑒定，將測序鑒定連接成功的質(zhì)粒命名為pany2-sticky-pflama（物理圖譜如圖9所示），該質(zhì)粒具有序列表中序列3核苷酸序列。隨機(jī)測序的結(jié)果表明，所有的陽性克隆均為陽性克隆，而且沒有假陽性克隆出現(xiàn)。所以，pany2可以有效的進(jìn)行無背景的粘性末端克隆。

seqidno:3pany2-sticky-pflama(2778bp)：

caccaccaccaccaccactaaggctgctaacaaagcccgaaaggaagctgagttggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggatatccctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagcttatcgatgataagctgtcaaacatgagaattcttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaactgcaatttattcatatcaggattatcaataccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatgaaggagaaaactcaccgaggcagttccataggatggcaagatcctggtatcggtctgcgattccgactcgtccaacatcaatacaacctattaatttcccctcgtcaaaaataaggttatcaagtgagaaatcaccatgagtgacgactgaatccggtgagaatggcaaaagtttgtgcatttctttccagacttgttcaacaggccagccattacgctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaaccgttattcattcgtgattgcgcctgagcgagacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggacaattacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgcaggaacactgccagcgcatcaacaatattttcacctgaatcaggatattcttctaatacctggaatgctgttttcccggggatcgcagtggtgagtaaccatgcgtcatcaggagtacggataaaatgcttgatggtcggaagaggcataaattccgtcagccagtttagtctgaccatctcatctgtaacatcattggcaacgctacctttgccatgtttcagaaacaactctggcgcatcgggcttcccatacaatcgatagattgtcgcacctgattgcccgacattatcgcgagcccatttatacccatataaatcagcatccatgttggaatttaatcgcggcctcgagcaagacgtttcccgttgaatatggctcataacaccccttgtattactgtttatgtaagcagacagttttattgttcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggcctttggtaccagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactatagggagacgacaacggtttccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacatatgactagtaggcctgtcgaccctgggtctatggtccctgaagtgatagaaatagatggaaaacagtggagacttatttggcacgatgagtttgaaggttccgaagtaaataaagaatactggacatttgagaagggaaatggaatagcttatggaatcccgggatgggggaatggagagcttgaatactacacggaaaacaacacctatattgtaaatggcacccttgtcattgaggccagaaaagaaataattactgatcctaacgaaggaacgtttctctacacttcatcaagacttaagactgaaggtaaggtagaatttagccctccagtagttgttgaggctagaataaagcttccaaaaggtaaaggtttatggcctgcattctggatgttggggagcaacataagggaagtaggctggccaaattgtggagaaatagacataatggagttccttggccatgagccacggacaattcacggaactgttcatggcccaggttactcgggaagtaaaggaattactagggcctatacactccctgaaggtgttccagactttacagaagacttccatgtatttggaatagtttggtatccggataaaataaagtggtacgttgatggaactttttatcatgaggttacaaaagaacaagtggaggctatgggctatgagtgggtcttcgataagcccttctatataatccttaatcttgcagtgggtggttattggccaggaaaccccgatgctacaactccatttccagcaaagatggtggtggattatgtaagggtttactcattcgttagtggtcgtcgacctatggtcaggcctggatccgagctcctgcag

實施例4:pany2用于蛋白表達(dá)和純化的功能驗證

1）將上述實施例2和3中所獲得的pany2-ta-pflama和pany2-sticky-pflama轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21（de3）感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)，提取凝結(jié)多糖水解酶pflama的粗酶液。作為對照，將質(zhì)粒pet11-pflama（pflama克隆于通用載體pet11）轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21（de3）并將空質(zhì)粒pany2轉(zhuǎn)化大腸桿菌db3.1，同樣進(jìn)行iptg誘導(dǎo)表達(dá)和粗提液的提取。

2）將含有步驟1）中所述的轉(zhuǎn)化四種質(zhì)粒的大腸桿菌工程菌用tb培養(yǎng)基培養(yǎng)，用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，并用hisgravitrapni-nta蛋白純化試劑盒（上海超研生物科技有限公司）進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物進(jìn)行sds-page電泳分析（如圖10所示）。結(jié)果表明，在蛋白表達(dá)水平和蛋白純化效率方面，pany2與pet11相似，甚至優(yōu)于pet11。值得注意的是，不同多克隆位點的選擇對蛋白表達(dá)量影響非常顯著。

3）將步驟2）獲得的四份純化后蛋白取10μl點在含有1％凝結(jié)多糖的lb平板上，剛果紅染色后觀察透明圈的產(chǎn)生情況，如圖11所示。結(jié)果表明，pany2可以有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，表達(dá)后的酶pflama能使得平板產(chǎn)生明顯透明圈。

4）將步驟2）得到的四份純化的蛋白以凝結(jié)多糖為底物進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)過程如下列方程所示：

通過dns法測定酶催化反應(yīng)的結(jié)果，如圖12所示。結(jié)果進(jìn)一步表明，pany2可以有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化，純化后的酶pflama能使得凝結(jié)多糖產(chǎn)生明顯的顏色變化。