專利名稱：廣宿主打孔質(zhì)粒載體、其構(gòu)建方法及在制備菌蛻中應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒載體，尤其涉及一種廣宿主打孔質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法， 本發(fā)明還涉及廣宿主打孔質(zhì)粒載體在制備支氣管敗血波氏桿菌菌蛻中的用途，屬于 基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
"Bacterial Ghost"(細菌菌蛻)是一種沒有細胞漿和核酸的空細菌體。將PhiX174 噬菌體E裂解基因在細菌中表達，該基因編碼蛋白在細菌細胞膜和胞壁上可形成穿 膜隧道，在滲透壓的作用下使菌體破裂，細菌胞內(nèi)細胞漿和核酸成分通過此隧道被 排出，形成一種空的細菌外殼，即為"Bacterial Ghost"。 bacterial ghost是由內(nèi)膜 (cytoplasmic membrane), 胞^炎間隙(periplasmic space)禾口夕卜月莫(outer membrane)纟且成， 因此細胞壁在很大程度上被完整保存下來。在有些菌株的外膜上還有一層S — layer， 也成為bacterial ghost的成分之一。Bacterial Ghost本身可作為一種很好的疫苗，因 為這種形式保留了和活菌一樣的細菌胞膜結(jié)構(gòu)和相關(guān)抗原蛋白，而外膜含有天然的 免疫細胞通過模式識別受體識別的高度保守結(jié)構(gòu)PAMP(pathogen-associated molecular patterns),例如脂多糖，肽聚糖，CPG， OmpA,菌毛等，能有效地被DC和 巨噬細胞所吞噬。目前，ghost通過靜脈、皮下、氣體等途徑免疫己經(jīng)在小鼠、兔子、 豬等動物模型中取得了良好的免疫保護效果。用A p/em"印"e"mom'ae ghosts氣體免 疫接種豬，誘導了針對Ap/wra;^wmomhe引起的胸膜肺炎的完全保護?；魜y菌 ghost(VCG)經(jīng)皮下注射小鼠誘導血清產(chǎn)生高水平的抗霍亂特異性IgG抗體。同時顯 示，針對VCG的抗體足以保護新生小鼠免遭霍亂弧菌的感染。另夕卜，Bacterial Ghost 還可以用作一種極好的遞送系統(tǒng)，通過在細菌裂解之前對細菌進行外膜的人工改 造，將外來抗原，核酸或藥物等其它成分錨定于胞膜的內(nèi)、外側(cè)，或充于胞漿周質(zhì)。 這樣制備的重組ghost擁有完好的，天然的細菌外膜結(jié)構(gòu)，能同時激發(fā)體液和細胞 免疫應答。其菌毛等表面黏附結(jié)構(gòu)，又使之能靶向黏附在特異性的組織，如胃腸道 和呼吸道的黏膜表面，進而較易被機體吞噬細胞，如PP結(jié)(Peyer， s Patches)的M
細胞所識別捕獲，故而可有效遞送疫苗抗原至黏膜表面和誘發(fā)相關(guān)黏膜免疫應答。 Eko等人將沙眼衣原體(C.加c/wmato)抗原在霍亂菌的內(nèi)膜表達，然后裂解制備的重 組ghost(VCG)有效地激發(fā)了生殖道黏膜的Thl型免疫應答，現(xiàn)在正在著手進入臨床 實驗。與傳統(tǒng)的原核系統(tǒng)表達蛋白相比，重組bacterial ghost有幾大優(yōu)勢(l)重組 蛋白被整合在一個具有高度免疫原性的環(huán)境中；(2)對蛋白的大小要求范圍寬泛，但 蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之間;(3)重組蛋白被直接表達后整合到細菌 的膜上，裂解后就能直接用于免疫動物，而不必要象以前制備免疫原時要先分離純 化重組蛋白；(4)整合在細胞壁的重組蛋白是以天然的構(gòu)象，所以保持了它原有的活 性形式。而一般基因重組的蛋白通過原核系統(tǒng)大都以包涵體的形式表達，只能通過 變性、復性的方法在一定程度上恢復蛋白活性。(5)ghost的制備相對簡單，可用發(fā) 酵技術(shù)獲得，而不需進行復雜的純化工作；可以凍干的形式貯存于室溫。
溶解基因E的表達可在人pL/pR-c1857或在lacPO-lacIq啟動阻遏系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄控 制下完成。 一些含有不同抗性標記、復制起始區(qū)和基因E表達控制的特異性溶解質(zhì) 粒已經(jīng)被構(gòu)建出來。ApR啟動子和溫敏阻遏物c1857在30。C以下能抑制基因E的 表達，高于30OC會導致阻遏物cI857熱滅活而誘導E基因表達。為了制備ghost， 細菌須在28。C條件下生長到對數(shù)生長期，然后升溫到42。C誘導其溶解。
E蛋白介導的溶解已經(jīng)成功地應用于各種大腸桿菌菌株、鼠傷寒沙門氏菌、腸 炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏桿菌、支氣管敗血博德特氏桿菌、幽門螺旋桿菌、霍亂 弧菌、胸膜肺炎放線桿菌、流感嗜血桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、綠膿 桿菌、惡臭假單胞菌等。范圍如此之大說明了只要E溶解盒被引入到適當?shù)妮d體中， E蛋白介導的溶解可能會在每個革蘭氏陰性菌中發(fā)生。
目前，國外在制備革蘭氏陰性菌的ghost菌蛻時使用的打孔質(zhì)粒載體大多來源 于目的菌株與大腸桿菌的穿梭質(zhì)粒載體，在此基礎上構(gòu)建的打孔質(zhì)粒載體一般只能 用于制備目的菌株或親緣關(guān)系較近菌種的ghost菌蛻，應用范圍相對比較狹窄。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種應用范圍相 對比較寬的廣宿主打孔質(zhì)粒載體。
本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的 一種廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E，溫敏調(diào)控基因c1857 (SEQIDN0.6)、噬菌
體溶菌基因E (SEQ ID NO. 5)和廣宿主質(zhì)粒pBBR4-MCS組成。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建上述廣宿主打孔質(zhì)粒載體 pBBR-E的方法。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
一種構(gòu)建廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的方法，包括
以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，以SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2為引物 進行PCR擴增，得到溶菌基因E;將溶菌基因E純化后用T4DNA連接酶與經(jīng)&oRI 和I雙酶切消化的pBV220載體相連接，得到打孔質(zhì)粒載體pBV-E;以打孔質(zhì) 粒載體pBV-E為模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4為引物進行PCR擴增，將 PCR擴增產(chǎn)物純化后用5azfl I和I雙酶切，然后與同樣雙酶切的廣宿主質(zhì)粒 pBBR4-MCS相連接，即得。
本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是利用所構(gòu)建的廣宿主打孔質(zhì)粒載體 pBBR-E應用于制備支氣管敗血波氏桿菌菌蛻。
本發(fā)明所要解決的再一個技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E在制備支氣管敗血波氏桿菌菌蛻中的應用，包 括將廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E電擊轉(zhuǎn)化到支氣管敗血波氏桿菌I相菌"A50-4" 菌株感受態(tài)細胞中；轉(zhuǎn)化后涂布Amp+的改良鮑姜氏瓊脂平板(10%脫纖綿羊血)， 轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR進行鑒定；將含有廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的支氣管敗血 波氏桿菌接種到改良鮑姜氏(50pg/mL氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，28r過夜震蕩 培養(yǎng)(220 r/min)，然后轉(zhuǎn)接于含50 y g/mL氨芐青霉素的改良鮑姜氏液體培養(yǎng)基 中，28t:震蕩培養(yǎng)至0D6。。nm達0.5左右；取出100ul培養(yǎng)物備用，將剩余培養(yǎng)物迅 速調(diào)高到42'C培養(yǎng)以誘導E基因表達，繼續(xù)培養(yǎng)5-7小時；取誘導前后的培養(yǎng)物各 100 u 1適當稀釋后涂鮑姜氏瓊脂平板進行活菌CFU檢測；溶菌結(jié)束后形成的ghost 菌蛻用PBS洗滌3次，凍干保存；
本發(fā)明打孔質(zhì)粒載體pBBR-E是基于廣宿主范圍的質(zhì)粒載體pBBR4-MCS的基礎 上構(gòu)建而成，該打孔質(zhì)粒載體可以在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中復制并表達溶菌基因E， 從而制備相應菌株的ghost菌蛻。
本發(fā)明打孔質(zhì)粒載體pBBR-E可應用于制備支氣管敗血波氏桿菌Ghost菌蛻， 由于本發(fā)明打孔質(zhì)粒載體PBBR-E是基于廣宿主范圍的質(zhì)粒載體pBBR4-MCS構(gòu)建而 成的，由于后者是來源于支氣管敗血波氏桿菌，所以在制備氣管敗血波氏桿菌Ghost菌蛻時裂解效率較高，可高達99. 9997%，比國外高出了約4個數(shù)量級。


圖1 本發(fā)明廣宿主打孔質(zhì)粒載體pB服-E的構(gòu)建示意圖2支氣管敗血波氏桿菌Ghost (菌蛻)的透射電鏡觀察結(jié)果。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述 而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本 領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方 案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
試驗材料
支氣管敗血波氏桿菌I相菌"A50-4"菌株為本研究室自藏(該菌株也可從普 通生物試劑公司購買得到)，噬菌體PhiX174購于Proraega (北京)生物技術(shù)有限公 司。質(zhì)粒pBV220的構(gòu)建過程可按照以下文獻構(gòu)建張智清，姚立紅，侯云德，含 PrPl啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用，病毒學報，1990， 6 (2)， 111 一116。
廣宿主質(zhì)粒pBBR4-MCS可按照以下文獻構(gòu)建得到Kovach ME et al. 〃pBBRlMCS: A broad-host-range cloning vector〃， Biotechniques 16:800-802(1994)。
實施例1廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的構(gòu)建 1.1噬菌體PhiX174溶菌基因E的克隆
根據(jù)GenBank中噬菌體PhiX174溶菌基因E的編碼序列設計引物 Lysis E-U: 5'- AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG -3' (SEQ ID NO. 1) Lysis E-L: 5'- AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG -3， (SEQ ID NO.1) 上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點fcoR I和Ss/bH I，由上海生工 合成。以噬菌體PhiX174雙鏈DNA為模板擴增溶菌基因E: PCR擴增反應體系為50 uL，其中MgS(X2 mM，上、下游引物各1 u M， dNTP 200 u M， 10x Tsg buffer, 7a,DNA聚合酶2 U(TaKaRa)，模板DNA10 ng。 PCR反應程序為:95°C預變性5 min，94°C 30 s， 59°C 30 s， 72°C 30 s， 30個循環(huán)，72°C 5 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電 泳后用膠回收試劑盒回收，然后用&oR I和^jthH I進行酶切，用膠回收試劑盒回 收。
1. 2打孔質(zhì)粒載體pBV-E的構(gòu)建
將純化的溶菌基因E用T4 DNA連接酶(TaKaRa)與經(jīng)￡coR I和As/hH I雙酶切 消化的pBV220載體相連接，16。C過夜連接并熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞， 經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，命名為 pBV-E，對克隆的溶菌基因E進行測序鑒定。
1. 3打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的構(gòu)建
根據(jù)pBV220質(zhì)粒載體上溫敏調(diào)控基因cI857的序列設計引物cI-U，根據(jù)溶菌 基因E的序列設計引物E-L，序列如下
cl-U: 5， - GGGGGGATCCTCAGCCAAACGTCTC -3， ( SEQ ID NO. 3) E-L: 5， - ACTGTTGAGCTCTCACTCCTTCCGCA -3， ( SEQ ID NO.4) 上、下游引物5'端分別引入了限制性酶切位點ifef I和5"sc I，由上海生工合 成。以打孔質(zhì)粒載體pBV-E為模板，cI-U和E-L為引物進行PCR擴增，所得PCR產(chǎn) 物包括溫敏調(diào)控基因cI857以及溶菌基因E，命名為cI+E。 PCR擴增反應體系為 50 uL，其中MgS04 2 mM，上、下游引物各1 y M， dNTP 200 y M， 10x buffer， LA n^ DNA聚合酶2 U (TaKaRa)，模板DNAIO ng。 PCR反應程序為95°C預變 性5 min， 94°C 30 s, 59°C lmin， 72°C 1. 5min， 30個循環(huán)，72°C 10 min。 PCR 產(chǎn)物cI+E純化后用SazH I和5"ac I雙酶切，然后與同樣雙酶切的廣宿主質(zhì)粒 pBBR4-MCS相連接，熱激轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TGI感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR鑒定為陽性 的克隆進行增菌并利用堿裂解法小量提取質(zhì)粒，命名為pBBR-E，對克隆的溫敏調(diào)控 基因cI857以及溶菌基因E進行測序鑒定。
實施例2支氣管敗血波氏桿菌ghost的制備
將廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E電擊轉(zhuǎn)化到支氣管敗血波氏桿菌I相菌"A50-4" 菌株感受態(tài)細胞中，電擊感受態(tài)的制備參照Sambrook等的方法(分子克隆實驗指 南)，電穿孔儀(Micro—pulser， Bio-Rad, USA)的電擊參數(shù)為12.5 kV/cm、 200
Q、 25uf、 5. 0ms，轉(zhuǎn)化后涂布A即+的改良鮑姜氏瓊脂平板(10%脫纖綿羊血)， 轉(zhuǎn)化子通過菌落PCR進行鑒定。將含有廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的支氣管敗血 波氏桿菌接種到改良鮑姜氏(50ug/mL氨芐青霉素)液體培養(yǎng)基中，28。C過夜震蕩 培養(yǎng)(220 r/min)，然后轉(zhuǎn)接1-2 mL于50mL含50u g/mL氨芐青霉素的改良鮑姜 氏液體培養(yǎng)基中，28t:震蕩培養(yǎng)至0D6i達0.5左右。取出lOOul培養(yǎng)物備用，將 剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42"C培養(yǎng)以誘導E基因表達，繼續(xù)培養(yǎng)5-7小時。取誘導前 后的培養(yǎng)物各100 u 1適當稀釋后涂鮑姜氏瓊脂平板進行活菌CFU檢測。溶菌結(jié)束 后形成的ghost菌蛻用PBS洗滌3次，凍干保存，并對凍干后的菌蛻進行活菌CFU 檢測。
檢測結(jié)果溶菌前后的培養(yǎng)物從2.6xl()9下降到6.8xl03(CFU/ml)，溶菌滅活效 率達99. 9997%。
試驗例l 支氣管敗血波氏桿菌Ghost (菌蛻)的透射電鏡觀察
將實施例2中42°。中誘導培養(yǎng)5-7小時的菌液4 000 g離心10min，以2. 5 % 戌二醛固定細菌，置4 r下2h， 0.01mo1/ L PBS洗滌3次，離心后經(jīng)四氧化鋨 再固定、乙醇逐級脫水、包埋劑包埋等步驟處理后進行電鏡觀察。結(jié)果見圖2。
序列表
SEQUENCE LISTING 〈110〉中國農(nóng)業(yè)科學研究院哈爾濱獸醫(yī)研究所 <120〉廣宿主打孔質(zhì)粒載體、其構(gòu)建方法及在制備菌蛻中應用 〈130〉 P658 〈160> 6
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
〈213〉 phage E
〈400> 1
agggaattca tggtacgctg gactttgtgg 30
〈210> 2
<211> 27
<212> DNA
〈213〉 phage E
〈400〉 2
aggggatccg agctctcact ccttccg 27
〈210〉 3
<211〉 25
<212〉 DNA
<213> phage E
<400> 3
ggggggatcc tcagccaaac gtctc 25
〈210〉 4
<211> 26
〈212〉 DNA
<213> phage E
<400> 4
actgttgagc tctcactcct tccgca 26
<210> 5
<211> 276
〈212〉 DNA
〈213> phage E
<400> 5
atggtacgctggactttgtgggataccctcgctttcctgctcctgttgagtttattgctg60
ccgtcattgcttattatgt.tcatcccgtca acattcaaacggcctgtctcatcatggaag120
gcgctgaattt3Cgg3333Cattattaatggcgtcgagcgtccggttaaagccgctgaat180
t.gttcgcgtttacctt.gcgtgtacgcgcaggasacactgacgttcttactgacgcagaag240
犯aacgtgcgtcaaaemttacgtgcgg犯ggagtga276
〈210〉 6
<211〉 1146
<212〉 DNA 〈213〉
〈400〉 6
tcagccaaac gtct.cttcag gccactgact agcgataact ttccccacaa cggemcaact 60 ctcattgcat gggatcattg ggtactgtgg gtttagtggt tgta朋aaca cct.gaccgct 120
9 atccctgatc3gtttcttgaaggtaaactc3tC3CCCCC3agtctggctatgcagsaatc180
acct.ggctcaacagcctgctcagggtcaacgagaatt.aacgaaagcUgg240
Cttgg3gCCtgttggtgcggtcatgg朋ttaccttcaacctcaagccagaatgcagaatc300
actggcttttttggttgtgcttacccatctctccgcatcacctttggtaaaggttctaag360
cttaggtgagaacatccctgcctgaacatggggtactcatactcacttct420
aagtgacggctgC3t3Ct犯ccgcttcatacatctcgtagatttctctggcgattgaagg480
gctaaattcttc犯cgcta3ctttgagaatttttgtaagc犯tgcggc.gttat犯gc3tt540
t犯tgcattg3tgCC3tt犯ataaagcaccaacgcctgactgccccatccccatcttgtc600
tgcgacagattcctgggataagccaagttcatttttctttttgcttt犯g660
gCg3CgtgCgtcctcaagctgctcttgtgttaatggtttcttttttgtgctcatacgtta720
aatctatcaccgcaagggatceiccgtgcgtgttgactattttaxxtctgg780
ggttgcatgtttgtatggaacaacgcataaccctgaaaga840
ttatgcaat.gcgctttgggcagct犯agatctctcacctaccaaacaatg■
cccccctgcaa^aataaattcatataaaaaacatacagataaccatctg960
ttatctctggcggtgttgacctggcggtgat,actgagcac3tcagcagg31020
cacactgaccaccstgaaggtgacgctcttaa犯attaaggggC3gCatt1080
ggctttggggtgtgtgatacgaaacgaagcattggttaaaaattaaggag1140
gaattc114權(quán)利要求
1、一種廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E，其特征在于由溫敏調(diào)控基因cI857、噬菌體溶菌基因E和廣宿主質(zhì)粒pBBR4-MCS組成。
2、 一種構(gòu)建權(quán)利要求1的廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的方法，包括以噬 菌體PhiX174雙鏈DNA為模板，以SEQ ID NO. 1禾n SEQ ID NO. 2為引物進行PCR擴 增，得到溶菌基因E;將溶菌基因E純化后用T4 DNA連接酶與經(jīng)AcoR I和^mH I 雙酶切消化的pBV220載體相連接，得到打孔質(zhì)粒載體pBV-E;以打孔質(zhì)粒載體pBV-E 為模板，以SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4為引物進行PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物純 化后用I和fee I雙酶切，然后與同樣雙酶切的廣宿主質(zhì)粒pBBR4-MCS相連 接，即得。
3、權(quán)利要求1的廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E在制備支氣管敗血波氏桿菌菌蛻 中的應用，包括將廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E電擊轉(zhuǎn)化到支氣管敗血波氏桿菌 I相菌"A50-4"菌株感受態(tài)細胞中；轉(zhuǎn)化后涂布Amp+的改良鮑姜氏瓊脂平板，轉(zhuǎn) 化子通過菌落PCR進行鑒定；將含有廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E的支氣管敗血波 氏桿菌接種到改良鮑姜氏液體培養(yǎng)基中，28"C過夜震蕩培養(yǎng)，然后轉(zhuǎn)接于含 50y g/mL氨芐青霉素的改良鮑姜氏液體培養(yǎng)基中，28。C震蕩培養(yǎng)至006。。。 達0. 5左 右；取出100ul培養(yǎng)物備用，將剩余培養(yǎng)物迅速調(diào)高到42。C培養(yǎng)以誘導E基因表 達，繼續(xù)培養(yǎng)5-7小時；取誘導前后的培養(yǎng)物各100ul適當稀釋后涂鮑姜氏瓊脂 平板進行活菌CFU檢測；溶菌結(jié)束后形成的ghost菌蛻用PBS洗滌3次，凍干保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E及其構(gòu)建方法，本發(fā)明還公開了該廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E在制備支氣管敗血波氏桿菌菌蛻中的用途，屬于基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明廣宿主打孔質(zhì)粒載體pBBR-E由溫敏調(diào)控基因cI857、噬菌體溶菌基因E和廣宿主質(zhì)粒pBBR4-MCS組成。本發(fā)明構(gòu)建的打孔質(zhì)粒載體pBBR-E是基于廣宿主范圍的質(zhì)粒載體pBBR4-MCS的基礎上構(gòu)建而成，可以在大多數(shù)革蘭氏陰性菌中復制并高效表達溶菌基因E，在制備氣管敗血波氏桿菌Ghost菌蛻時裂解效率較高，可高達99.9997％，比現(xiàn)有技術(shù)高出了約4個數(shù)量級。
文檔編號C12N15/63GK101182536SQ20071019375
公開日2008年5月21日 申請日期2007年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月26日
發(fā)明者劉思國, 劉惠芳, 常月紅, 王春來 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所