專利名稱：一種基于microRNA結構的肝細胞選擇性多靶點干擾質粒載體的構建方法及其功能驗證的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及肝細胞選擇性多基因靶點干擾的質粒載體pLIVE-(shLucl55mi,-shLuc 155mir-shEGFP 13lmir-shEGFP425mir)構建方法及其應用，屬于分子生物學領域。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)是在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的轉錄后基因沉默現(xiàn)象。RNAi現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于1998年Fire等對秀麗隱桿線蟲的研究， 此后陸續(xù)證實在真菌、果蠅、擬南芥及哺乳動物細胞中也存在RNAi。目前，RNAi技術已經在功能基因組學研究、微生物學研究、基因治療和信號轉導等廣泛的領域里取得了令人矚目的進展，使其在醫(yī)學領域的應用有著廣闊的前景。病毒基因、人工轉入基因或轉座子等外源性基因進入到宿主細胞基因組內并進行轉錄時，通常會產生一些長的雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)。宿主對這些dsRNA 產生應答，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小干擾 RNA (short interfering RNA，siRNA)，約 21_23bp。siRNA 雙鏈在細胞內 RNA 解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，進一步反義鏈和胞內的一些酶結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。荷載有反義 RNA 鏈的 RISC 與胞內同源 mRNA 的同源區(qū)進行序列特異性的結合，因RISC具有核酸酶的功能，在結合部位開始切割mRNA， 導致mRNA斷裂降解，從而抑制宿主細胞基因的表達。siRNA制備通常可以分為體外化學合成和體內載體表達有兩種方法。體外化學合成的siRNA可以直接用于導入細胞抑制目的基因的表達，但化學合成的siRNA不穩(wěn)定，容易被RNase降解，且siRNA合成價格較高，操作要求嚴格，因此其廣泛應用受到限制。另一種方法是通過載體表達短發(fā)卡結構的RNA (short-hairpin RNA, shRNA)，所表達的shRNA在體內被Dicer酶剪切成siRNA從而發(fā)揮作用。相對來說，DNA載體在體內作用更穩(wěn)定，且可以通過特定的抗藥性篩選得到shRNA表達DNA整合于細胞基因組的穩(wěn)定干擾細胞株，便于進一步研究特定基因的功能。質粒DNA載體按照表達所使用的啟動子類型和shRNA的結構可以分為三類。第一類是由廣泛表達與各個細胞的RNA聚合酶Pol III啟動子啟動shRNA發(fā)卡結構的表達，通過多個堿基T來終止轉錄。第二類是由RNA聚合酶Pol II啟動子啟動shRNA發(fā)卡結構的表達，通過Poly (A)序列來終止。特定的Pol II啟動子具有細胞/組織特異性，因此可以干擾特定類型細胞中的目的基因，而對其他細胞中的靶基因不起作用。第三類由RNA聚合酶Pol II啟動子，啟動基于microRNA結構的shRNA表達。相對于前兩種shRNA表達質粒，這種方法能更好的模擬體內microRNA作用的過程，避免由于產生過多shRNA阻斷體內microRNA 的傳遞通路造成的毒性損傷。目前對此研究較多的是利用microRNA155和microRNA30的結構，將所設計的小RNA干擾序列插入microRNA骨架結構，在體內經Dicer酶切割、解旋酶解開雙鏈，再結合到RISC復合物中抑制目標基因mRNA的表達。RNAi現(xiàn)象具有高度的特異性，只有與shRNA序列具有高度匹配的mRNA才能被降解，一個shRNA只能針對一個靶基因進行沉默，而且針對靶基因mRNA不同位點的shRNA干擾效率也不一樣。為了確保RNAi的效率，或者是需要同時抑制多個靶基因時，多靶點RNA干擾載體的應用就顯得非常重要。目前對于多靶點shRNA表達載體的構建已有一些文獻報道，例如中國專利號 CN101245352A公開的技術方案是以pSilencer2. 0-U6或pSilencer3. O-Hl為基礎，構建出能夠同時表達多個shRNA的質粒載體pSilencer-U6/Hl-(shRNA)n，但這種多靶點shRNA 表達載體不具有細胞/組織特異性表達的特點，且一個載體中含有多個U6/H1啟動子。 瞬時的過量表達shRNA容易導致細胞內microRNA通路的阻斷而引起細胞毒性作用。亦有人采用microRNA的結構構建多靶點shRNA表達載體(Hyun Jung Junn，Dai-Wu Seol et al. Effective knockdown of multiple target genes by expression the single transcript harbouring multi—cistronic shRNAs. Biochemical and Biophysical Research Communications 396 Q010) 861-865)，但這種載體采用了 CMV 啟動子，該啟動子在多種細胞中均能啟動shRNA的轉錄，抑制靶基因的表達，不具有細胞/組織特異性，且易甲基化而失活，導致干擾效率降低。因此，我們設計發(fā)明了一種基于microRNA結構的肝細胞選擇性多靶點干擾的質粒載體。該載體能夠選擇性的高效抑制肝細胞中的單個/多個靶基因的表達，而對其他細胞不起作用。該載體及其構建方法可以應用于肝細胞基因的功能研究和肝臟疾病基因治療藥物的研發(fā)，同時對于其他細胞/組織特異性干擾載體的構建具有重要的借鑒和參考價值。

發(fā)明內容
發(fā)明目的本發(fā)明的第一個目的是提供一種基于microRNA結構的肝細胞選擇性多靶點干擾的質粒載體 pLIVE-(shLucl55mir-shLuc Issmir-ShEGFPisimir-ShEGFPdZ^lir)。本發(fā)明的第二個目的是提供所述肝細胞選擇性多靶點干擾質粒載體的構建方法。本發(fā)明的第三個目的是說明所述肝細胞選擇性多靶點干擾質粒載體在干擾 Luciferase和EGFP報告基因中的驗證應用。在本發(fā)明的第一個方面，本發(fā)明提供一種基于microRNA結構的肝細胞選擇性多靶點干擾質粒載體的構建方法，所述質粒載體由具有肝細胞選擇性的甲胎蛋白增強子 / SSSin^J^ (AFP enhancer/albumin promoter) 3 (Multiple Cloning Sites,MCS)、兩個內含子區(qū)(intron)、多個靶基因的基于microRNA結構的短發(fā)卡RNA轉錄單位(microRNA30-based shRNA, shRNAmir)和質粒序列組成，該載體的建立方法是在質粒的內含子區(qū)域內，通過同尾酶結構的設計，串聯(lián)多個相同或者不同的針對靶基因(例如，熒光素酶基因(Luciferase)和綠色熒光蛋白基因(EGFP)) WshRNAmi,轉錄單位，因而可以同時選擇性的高效抑制肝細胞內靶基因(例如Luciferase和EGFP)的表達。在一個實施方案中，所述質粒載體采用具體肝細胞選擇性的啟動子，具體地為甲胎蛋白增強子/白蛋白啟動子。在一個實施方案中，所述甲胎蛋白增強子/白蛋白啟動子的序列為GATCTTTTTGATGGCAGAGTTCAGTTTACCGGGTCACATTGTACCTGGGAAGATTCAAGGATTTATGGA AAAAGTCAACAACAGGAGTCAGAGCAGCCGGAAAAGCATGGACTCTGTACTTAGGACTGCGCTTTGAGCAATGGCACAGCAAGCTTTAACCCTGTTTGCAGTCAGCACACAAACTGTGGTTCAAAGCTCCACTTTATCTCTTCTTGTGGAATTC AGATATCAGATCAGTTTAAACCTTGCGGCCGCACTAGTGCTCAAATGGGAGACAAAGAGATTAAGCTCTTATGTAAA ATTTGCTGTTTTACATAACTTTAATGAATGGACAAAGTCTTGTGCATGGGGGTGGGGGTGGGGTTAGAGGGGAACAG CTCCAGATGGCAAACATACGCAAGGGATTTAGTCAAACAACTTTTTGGCAAAGATGGTATGATTTTGTAATGGGGTA GGAACCAATGAAATGCGAGGTAAGTATGGTTAATAATCTACAGTTATTGGTTAAAGAAGTATATTAGAGCGAGTCTT TCTGCACACAGATCACCTTCCTATCAACCCCACTAGCCTCTGGCAAA(SEQ ID NO 5)在一個實施方案中，本發(fā)明所采用的質粒載體是pLIVE質粒載體。在一個實施方案中，所述質粒的內含子區(qū)域是質粒的第二個內含子區(qū)域。在一個實施方案中，所述 ShRNAmir 轉錄單位的序列選自 SEQ ID NO :1,SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3和/或SEQ ID NO: 4。在一個實施方案中，所述同尾酶可以是)(ba I和Spe I。在一個實施方案中，申請人將包含構建的 PLivE-(ShLucissmir-ShLucissmir-ShEGFPisimir-ShEGFPAZ^lir)載體的大腸桿菌 (Escherichia coli)宿主菌株于2011年8月沈日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)， 保藏號為 CGMCC No. 5181。本發(fā)明方法的一個優(yōu)選技術方案是l.pLIVE質粒載體的改造(1)去除)(ba I、Spe I限制性內切酶位點通過5’突出末端補平再自連的方法， 將pLIVE質粒中的)(ba I (2695), Spe I (264)兩個限制性內切酶位點去除。(2)在化仕011 2中引入新的Xba I和Spe I位點利用載體中已有的Xho 1(956) 和Cla 1(1172)位點，雙酶切pLIVE質粒形成線性質粒，同時，通過PCR的方法，擴增Bio I 和Cla I之間的質粒序列，并在下游引物的5’端加上)(ba I和Spe I位點，將PCR產物經 Xho I和Cla I雙酶切后，與線性的pLIVE質粒相連接，即可得到在Citron 2中引入新的 Xba I 和 Spe I 位點的 pLIVE 質粒(pLIVE*)。2.基于microRNA結構的shRNAmi,干擾序列的設計通過軟件分析選擇針對靶基因的干擾序列，合成97nt的基于microRNA30結構的干擾序列寡聚核苷酸單鏈。針對Luciferase 基因的 97nt DNA Oligo (shLucl55mir)設計如下
權利要求
1.一種基于microRNA結構的肝細胞選擇性多靶點干擾質粒載體的構建方法，所述質粒載體由具有肝細胞選擇性的甲胎蛋白增強子/白蛋白啟動子、多克隆位點區(qū)、兩個內含子區(qū)、多個靶基因的基于microRNA結構的短發(fā)卡RNA轉錄單位和質粒序列組成，所述載體的建立方法是在質粒的內含子區(qū)域內，通過同尾酶結構的設計，串聯(lián)多個相同或者不同的針對靶基因的shRNA*轉錄單位，因而可以同時選擇性的高效抑制肝細胞內靶基因的表達。
2.權利要求1所述的方法，其中所述質粒載體采用甲胎蛋白增強子/白蛋白啟動子。
3.權利要求1所述的方法，其中所述質粒載體是pLIVE質粒載體。
4.權利要求1所述的方法，其中所述質粒的內含子區(qū)域是質粒的第二個內含子區(qū)域。
5.權利要求1所述的方法，其中所述ShRNAmi,轉錄單位的序列是SEQID N0:1,SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3 禾口 / 或 SEQ ID NO :4。
6.權利要求1所述的方法，其中所述同尾酶可以是)(baI和Spe I。
7.質粒載體，采用權利要求1-6中任一項的方法所構建。
8.權利要求7所述的質粒載體，所述質粒載體為pLIVE-shLuC155mi,、 pLIVE-(shLucl55mir-shLucl55mir),或 pLIVE-(shLucl55mir-shLucl55mir-shEGFP131mir-shEGF P425mir)(保藏號為 CGMCC No. 5181)。
9.權利要求7或8的質粒載體靶向肝細胞干擾靶基因的應用。
10.權利要求9的應用，其中所述靶基因是Luciferase或EGFP報告基因。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基于microRNA結構的能實現(xiàn)肝細胞選擇性多靶點干擾的質粒載體pLIVE-(shLuc155mir-shLuc155mir-shEGFP131mir-shEGFP425mir)的構建方法及其功能驗證。所述質粒載體由具有肝細胞選擇性的甲胎蛋白增強子/白蛋白啟動子(AFP enhancer/albumin promoter)、多克隆位點區(qū)(Multiple Cloning Sites，MCS)、兩個內含子區(qū)(intron)、多個靶基因的基于microRNA結構的短發(fā)卡RNA轉錄單位(microRNA30-based shRNA，shRNAmir)和質粒序列組成。在第二個內含子(intron 2)區(qū)域內，通過同尾酶結構的設計，串聯(lián)多個相同或者不同的針對熒光素酶基因(Luciferase)和綠色熒光蛋白基因(EGFP)的shRNAmir轉錄單位，同時選擇性的高效抑制肝細胞內Luciferase和EGFP的表達。該載體及其構建方法可以應用于肝細胞基因的功能研究和肝臟疾病基因治療藥物的研發(fā)，同時對于其他細胞/組織特異性干擾載體的構建具有重要的借鑒和參考價值。
文檔編號C12N15/66GK102433352SQ201110363118
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者孫汭, 田志剛, 耿建林, 魏海明 申請人:中國科學技術大學