專利名稱：一種質粒型腺病毒載體pAd-IGF2及其構建方法和應用的制作方法
一種質粒型腺病毒載體pAd-1GF2及其構建方法和應用技術領域
本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種質粒型腺病毒載體pAd-1GF2及其構建方法和應用，該質粒型腺病毒載體腺病毒載體的構建以及在改造種子細胞和牛IGF2 功能鑒定的應用。
背景技術：
AdEasyTM系統(tǒng)是由T.C.He等(1998)構建的用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)的一個快捷系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中，只需二步即可產生重組腺病毒:先將表達盒裝入轉移載體，然后再通過同源重組插入腺病毒基因組。將外源基因插入腺病毒的最有效途徑是通過同源重組，原因是:1)、腺病毒DNA是大型的線性分子，含有幾乎所有的內切酶切位點；2)、基因組過大(36kb),難于操作。
在AdEasyTM載體系統(tǒng)中，含有大部分腺病毒基因組的載體為超螺旋質粒，而不是線性DNA，同源重組則在大腸桿菌進行。相對于傳統(tǒng)系統(tǒng)而言，這兩點改進使病毒DNA操作更容易，同時由于利用了大腸桿菌的高效率同源重組特性而使重組載體的篩選更為簡單。 在本系統(tǒng)中，首先將基因cDNA插入一個轉移載體，將得到的質粒用PmeI線性化，然后在大腸桿菌BJ5183中與病毒DNA質粒pAdEasy-Ι進行同源重組。pAdEasy-Ι缺失了 El和E3 區(qū)，其El區(qū)功能將在293A細胞中得到互補。重組子通過卡那霉素篩選，用內切酶進行鑒定分析。最后將得到的重組腺病毒用PacI線性化，暴露其反向末端重復序列(ITR，Iaverted Termined Repeats),轉染293A細胞后產生重組病毒顆粒。
同源重組在線性化的轉移載體和完整的超螺旋腺病毒質粒之間進行。應用完整的腺病毒質粒而不用內切酶進行線性化，對于產生重組腺病毒至關重要。轉移載體中的卡那霉素抗性基因則可用來篩選重組子。由于線性化的轉移載體產生卡那霉素抗性克隆的背景較低，因此該同源重組系統(tǒng)有較高的信噪比。大腸桿菌BJ5183有recA活性，但同時缺失介導細菌重組的其它酶，具有高效的轉化和重 組能力。一旦重組子經(jīng)確定，則可轉入普通的無 reCA、endA活性的細菌株如DH5a等進行擴增。由于缺乏recA活性，DH5 a不能用于腺病毒的同源重組。
與傳統(tǒng)系統(tǒng)相比，AdEasyTM系統(tǒng)中篩選和純化腺病毒所需的時間大大縮短了?？寺『秃Y選約需I 3周，重組后需驗證重組病毒質粒是否含有目的基因。重組子在DH5 α中擴增后轉入哺乳動物細胞293Α，最后將293Α細胞中產生的重組病毒顆粒進行純化和滴定。 最終得到的重組腺病毒只能在提供El區(qū)功能的293Α細胞中進行增殖。
一般來說，用傳統(tǒng)方法產生重組腺病毒并不需要大量工作，每天只需I小時進行細胞傳代和觀察空斑形成。但由于病毒空斑形成速度慢，整個過程就需要很長時間。而 AdEasyTM載體系統(tǒng)用大腸桿菌產生重組病毒，大大縮短了所需時間。
Laere等(2003)研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因內含子3的3072位點的一單堿基突變 (G-A)正好位于高度保守的調控區(qū)域，影響豬骨胳中IGF2的表達，并且對出生后的肌肉形成起重要作用；這一突變的單核苷酸與瘦肉率存在相關性，可增加的瘦肉量。這一變異位點的發(fā)現(xiàn)引起眾多學者的重視(Jungedus et al.2004 !Braunschweig et al.2004 ；Estelle et al.2005)。鼠的纖維原細胞體外實驗結果表明，在IGFs信號通路中，1GF2的高表達可以刺激下游蛋白激酶B(Akt)絲氨酸(Ser)和IGF-1R跨膜蘇氨酸(Tyr)的磷酸化，從而促進成肌因子(MyoD)家族的基因表達，使單核成肌細胞融合成多核肌管，最終形成肌肉;而當IGF2水平較低或抑制時，則阻礙肌肉生成(Wilson et al.2003)。IGFs系統(tǒng)由一組配體、受體和結合蛋白組成。配體包括胰島素、IGF-1和2，IGF-1和2可促進細胞的有絲分裂和分化，抑制細胞凋亡，刺激DNA合成和細胞復制，誘導GO期靜止狀態(tài)的細胞進入Gl期，推動細胞依次經(jīng)歷細胞周期的各個時期(Laviola et al.2007)。相應受體為胰島素受體、胰島素樣生長因子I受體(IGF-1R)和胰島素樣生長因子2受體(IGF-2R)，其中，IGF-1R可分別與IGF-1和IGF-2結合，但與IGFl的親和力大于IGF-2，而IGF-2R則與IGF-2的親和力高于IGF-1。結合蛋白共6種，即胰島素樣生長因子結合蛋白1 6 (IGFBPf 6)，其可為位于細胞外和細胞外周間隙的IGFs提供特異結合位點并調節(jié)IGFs和相應受體之間的相互作用。IGFs系統(tǒng)對胚胎、神經(jīng)、骨骼肌和骨骼的發(fā)育、細胞增殖和轉化等具有極其重要的作用(Russoet al.2005 ；Yamaguchi et al.2006),肌肉的生長發(fā)育與IGFs系統(tǒng)基因的時空特異性表達密切相關(Tilley et al.2007 ;唐中林等2008)。顧以韌等(2009)采用熒光定量PCR技術，檢測了長白豬和梅山豬的背最長肌組織中IGFl和2、IGF-1R和2R、胰島素樣生長因子結合蛋白3和5(IGFBP3和5)基因mRNA豐度在初生(O月齡)、1、2、3、4和5月齡間的表達變化并分析品種間和不同月齡間基因表達的差異及其對肌肉生長發(fā)育的影響。結果表明:兩豬種出生后IGFl mRNA表達量均表現(xiàn)為逐漸上調，而IGF2則恰好相反，表現(xiàn)為逐漸下調。這與IGF2主要在胚胎期發(fā)揮作用，而IGFl則主要在動物個體出生后才發(fā)揮促進細胞增殖和個體發(fā)育功能的特點相符。IGFRs mRNA與IGFs mRNA表達的發(fā)育性變化模式并不相似，提示背最長肌組織中IGFRs mRNA的表達可能沒有受到組織局部產生的IGFs調節(jié)。長白豬的IGF-1R、IGF-2R和IGFBP_3mRNA表達量均在2月齡時達到最高峰，提示2月齡可能是長白豬IGFs系統(tǒng)發(fā)揮作用最為明顯的生長發(fā)育階段。在豬生長發(fā)育過程中胰島素樣生長因子系統(tǒng)基因表達的發(fā)育性變化模式和品種差異，為深入研究IGFs系統(tǒng)基因的相互調控機制提供了基礎數(shù) 據(jù)。綜上所述，在哺乳動物中，IGF2主要影響肌肉生長(IGF2基因內含子中的QTN位點可以提高豬肉產量提高了 3 4%)、心臟增大和脂肪沉積。通過秦川牛IGF2基因腺病毒載體的構建能夠為秦川牛肉質性能、生長性能的標記輔助選擇和新的優(yōu)良品種的育種提供重要的研究資料，最終為轉基因動物的研究及秦川牛生長發(fā)育和牛肉品質的改善提供理論依據(jù)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開了一種質粒型腺病毒載體pAd-1GF2。本發(fā)明的第二個目的在于公開了上述質粒型腺病毒載體pAd_IGF2的制備方法。本發(fā)明的第三個目的在于公開了上述質粒型腺病毒載體pAd_IGF2的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:一種質粒型腺病毒載體pAd_IGF2，其中，所述質粒型腺病毒載體pAd_IGF2含有如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的秦川牛IGF2基因。
上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_IGF2，其中，所述質粒型腺病毒載體 pAd-1GF2是由秦川牛IGF2基因通過AdEasyTM系統(tǒng)構建所得。
上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_IGF2，其中，所述質粒型腺病毒載體 pAd-1GF2中的IGF2基因連接于穿梭質粒CMV啟動子之下。
上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_IGF2，其中，所述質粒型腺病毒載體 pAd-1GF2中的IGF2基因起始密碼子前含有Kozak序列；其中Kozak序列為GCCCACC。
上述技術方案所述的質粒型腺病毒載體pAd_IGF2，其中，所述質粒型腺病毒載體 pAd-1GF2中的IGF2基因起始密碼子后含有6個His標簽序列。
構建上述技術方案中任一技術方案所述質粒型腺病毒載體pAd_IGF2的方法，所述方法包括如下步驟:
(I)、將PCR擴增的IGF2基因片段連接到pGM_T載體，重組質粒pGM_T_IGF2和穿梭質粒pAdTrack-CMV分別經(jīng)Kpn I和HindIII雙酶切，將IGF2基因片段和pAdTrack_CMV 載體片段利用T4DNALigase進行酶連反應，酶連產物轉化E.col i DH5 α感受態(tài)細菌，得到 pAdTrack-CMV-1GF2 重組質粒；
(2)、限制性內切酶Pme I線性化pAdTrack-CMV_IGF2重組穿梭質粒，用線性化 pAdTrack-CMV-1GF2重組穿梭質粒轉化含有pAdEasy-Ι質粒E.col i BJ5183感受態(tài)細菌， 利用E.coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統(tǒng)，在細菌中完成pAdTrack-CMV_IGF2 和pAdEasy-Ι的同源重組，獲得同源重組成功的攜帶IGF2基因的重組腺病毒質粒 pAd-1GF2。
上述 技術方案中所述的方法，其中，所述方法還包括將重組腺病毒質粒pAd_IGF2 用脂質體LIP0FECTAMINE2000轉染后，在293A細胞中進行病毒包裝。
上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體，作為秦川牛IGF2基因功能鑒定的應用。
上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體，作為細胞改造的應用。
上述技術方案中任一技術方案所述的質粒型腺病毒載體，作為肌肉生長發(fā)育調控的應用。
具體的:
PCR擴增IGF2后和pAdTrack-CMV穿梭質粒經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切，凝膠回收試劑盒回收IGF2基因片段和pAdTrack-CMV載體片段，回收的載體片段和目的基因片段T4DNA Ligase進行酶連反應。酶連產物轉化E.coli DH5 α感受態(tài)細胞，純化試劑盒抽提pAdTrack-CMV-1GF2重組穿梭質粒，Kpn I和Hind III雙酶切鑒定證明獲得正確的 pAdTrackCMV-1GF2 重組質粒。
限制性內切酶Pme I線性化pAdTrack-CMV_IGF2重組穿梭質粒，凝膠回收試劑盒回收線性化pAdTrack-CMV_IGF2重組穿梭質粒，轉化含有pAdEasy-Ι質粒E.coli BJ5183感受態(tài)細胞，利用E.coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統(tǒng)，在細菌中 pAdTrack-CMV-1GF2和pAdEasy-Ι同源重組獲得攜帶IGF2基因的重組腺病毒質粒，將同源重組成功的重組腺病毒質粒命名為pAd-1GF2。試劑盒抽提同源重組質粒，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，選擇比pAdEasy-Ι大的重組腺病毒質粒，Pac I酶切。酶切產物通過0.7%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結果與理論上同源重組質粒多克隆位點圖譜吻合。pAd-1GF2重組腺病毒質粒轉化E.coli DH5a感受態(tài)細胞，大量抽提質粒備用。pAd_IGF2重組腺病毒質粒用Pac I線性化暴露反向的末端重復序列，采用脂質體轉染包裝細胞(293A cells)進行病毒包裝。轉染24h后熒光顯微鏡直接觀察，可見穿梭質粒帶有的綠色熒光蛋白(GFP)基因表達。重組病毒上清液感染293A細胞擴增重組腺病毒，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因的表達。將重組腺病毒質粒pAd_IGF2感染牛原代肌肉細胞，檢測過表達IGF2基因對牛肌肉細胞增殖分化和肌肉發(fā)育相關基因的表達模式的影響，是本發(fā)明質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為秦川牛IGF2基因功能鑒定的應用。牛IGF2基因的重組腺病毒質粒pAd_IGF2，可用于感染牛肌肉細胞，牛脂肪細胞，293細胞，C2C12細胞，3T3L細胞等細胞系，檢測其對相應細胞結構和功能的影響，是本發(fā)明質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為細胞改造的應用。

將重組腺病毒質粒pAd_IGF2感染鼠C2C12細胞系，經(jīng)過實時定量PCR和Westernbloting檢測過表達IGF2基因對肌肉細胞增殖分化和肌肉發(fā)育標志基因(MyoD、MyoG、MEF-2D、Pax7、MHC)在牛肌肉細胞中的差異表達情況，是本發(fā)明質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為肌肉生長發(fā)育調控的應用。本發(fā)明具有以下有益效果:1、本發(fā)明構建了能夠表達秦川牛IGF2基因的重組腺病毒載體，本發(fā)明所構建的載體，轉染原代培養(yǎng)的秦川牛肌肉細胞后，可獲得IGF2 mRNA的高效表達，為IGF2基因功能鑒定和改造細胞，調控代謝和生長發(fā)育奠定了基礎。


:1、圖1為PCR擴增的秦川牛IGF2基因；2、圖2為秦川牛pGM-T-1GF2重組質粒Kpn I和Hind III雙酶切鑒定；3、圖3為pAdTrack-CMV_IGF2重組質粒雙酶切鑒定；4、圖4為pAd_IGF2重組腺病毒質粒pac I酶切鑒定；5、圖5為pAd_IGF2質粒轉染293A細胞5d ;6、圖 6 為 pAd-1GF2 質粒轉染 293A 細胞 IOd ；7、圖7為pAd_IGF2質粒感染秦川牛原代肌肉細胞4d。
具體實施方式
:為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發(fā)明質粒型腺病毒載體pAd-1GF2及其構建方法作進一步的說明。本發(fā)明利用質粒的體外酶切及連接技術，應用pAdEasy-Ι系統(tǒng)，將線性化的穿梭質粒轉化含有pAdEasy-Ι質粒的E.coli BJ5183感受態(tài)細胞進行同源重組,所得重組腺病毒質?？梢酝ㄟ^卡那霉素篩選出，并通過質粒大小和限制性內切酶分析鑒定。最后，Pac I酶切后的重組腺病毒質粒轉染293A細胞包裝產生重組腺病毒。實施例1:DAd-1GF2重組腺病毒質粒的構建:一、材料和方法:
1.1、儀器:
超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、基因擴增儀、PTC-200單槽梯度基因擴增儀、Heraeus冷凍高速離心機(德國)、Bio-Rad凝膠成像分析儀(USA)、C02培養(yǎng)箱、HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱)4 611(10忖移液器、0￥￥111型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一)、DYY-1II3IA和DYY-1II 28D 電泳槽(北京六一)、制冰儀、MDF-382E超低溫冰箱(日本三洋)、Eppend0rf臺式高速離心機、Sartorious電子天平(德國)、常規(guī)冰箱等。
1.2、主要生化試劑和試劑盒:
Long Taq 聚合酶、PrimeSTAR DNA 聚合酶、DNA 限制性內切酶(Hind III,Pac 1、 Pme 1、Kpn I和Hind III等)、膠原蛋白、胰蛋白酶、DNA Marker、DNA連接酶、Trizol、反轉錄試劑盒、表達載體(pAdTrack-CMV、pAdEasy-Ι)、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、 胎牛血清、細胞培養(yǎng)基等。
1.3、培養(yǎng)基和抗性:
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨，酵母粉，NaCl，瓊脂粉；
抗性:氨芐青霉素，卡納霉素等。
1.4、普通試劑:
肝素鈉，Tris, EDTA, NaCl, NaOH，無水乙醇，醋酸鈉，十二烷基磺酸鈉(SDS)，抗生素，溴化乙錠(EB)，溴酚藍，二甲基苯菁FF ，乙酸，蔗糖，去離子甲酰胺，硝酸，鹽酸，硝酸銀， 無水碳酸鈉，硫代硫酸鈉，甲醒，硼酸，瓊脂糖，KCl,Na2HPO4,KH2PO4,Tris飽和酚(pH = 8.0)， 氯仿，異戊醇，甘油，石蠟油。
1.5、秦川牛IGF2基因PCR引 物的設計(引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成):
本研究參照GenBank公布的IGF2 mRNA序列(NM_174087.3)，設計引物:
上游引物:5，>CGGggtaccGCCCACCATGATGcatcatcatcatcatcacGGGATCACAGCAGGAAA G〈3，；
下游引物:5，>CCCaagcttTTAAGGTAATATTTCTTTTTCATTGC〈3，，
其中Kpn I，Hind III分別為上下游的酶切位點。
1.6、PCR擴增秦川牛的IGF2基因片段:
(I)、PCR總反應體系為50 μ L，見表1:
表I本發(fā)明的PCR反應體系
權利要求
1.一種質粒型腺病毒載體pAd-1GF2,其特征在于:所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2含有如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列的秦川牛IGF2基因。
2.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2，其特征在于:所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2是由秦川牛IGF2基因通過AdEasyTM系統(tǒng)構建所得。
3.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2，其特征在于:所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2中的IGF2基因連接于穿梭質粒CMV啟動子之下。
4.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2，其特征在于:所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2中的IGF2基因起始密碼子前含有Kozak序列。
5.如權利要求1所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2，其特征在于:所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2中的IGF2基因起始密碼子后含有6個His標簽序列。
6.構建權利要求1至6中任一權利要求所述質粒型腺病毒載體pAd-1GF2的方法，所述方法包括如下步驟: (1)、將PCR擴增的IGF2基因片段連接到pGM-T載體，重組質粒pGM_T_IGF2和穿梭質粒pAdTrack-CMV分別經(jīng)Kpn I和HindIII雙酶切，將IGF2基因片段和pAdTrack-CMV載體片段利用T4DNALigase進行酶連反應，酶連產物轉化E.coli DH5 α感受態(tài)細菌，得到pAdTrack-CMV-1GF2 重組質粒； (2)、限制性內切酶PmeI線性化pAdTrack-CMV-1GF2重組穿梭質粒，用線性化pAdTrack-CMV-1GF2重組穿梭質 粒轉化含有pAdEasy-1質粒E.coli BJ5183感受態(tài)細菌，利用E.coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統(tǒng)，在細菌中完成pAdTrack-CMV-1GF2和pAdEasy-Ι的同源重組，獲得同源重組成功的攜帶IGF2基因的重組腺病毒質粒pAd_IGF2。
7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法還包括將重組腺病毒質粒pAd-1GF2用脂質體LIPOFECTAM INE2000轉染后，在293A細胞中進行病毒包裝。
8.權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為秦川牛IGF2基因功能鑒定的應用。
9.如權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為細胞改造的應用。
10.如權利要求1至5中任一權利要求所述的質粒型腺病毒載體pAd-1GF2作為肌肉生長發(fā)育調控的應用。
全文摘要
本發(fā)明一種質粒型腺病毒載體pAd-IGF2及其構建方法和應用，屬于基因工程技術領域。所述質粒型腺病毒載體pAd-IGF2的構建方法包括(1)將秦川牛IGF2基因插入pAdTrack-CMV腺病毒穿梭質粒的CMV啟動子之下，構建重組穿梭質粒pAdTrack-CMV-IGF2；(2)Pme Ⅰ線性化后轉化含有pAdEasy-l質粒的E.col iBJ5183感受態(tài)細胞，利用E.coli BJ5183內Cre重組酶高效的同源重組系統(tǒng)，在細菌中完成pAdTrack-CMV-IGF2和pAdEasy-1的同源重組；將正確的重組腺病毒質粒命名為pAd-IGF2；(3)pAd-IGF2經(jīng)Pac Ⅰ酶切線性化后，脂質體轉染293A細胞和秦川牛原代肌肉細胞，產生并獲得重組病毒顆粒。本發(fā)明的質粒型腺病毒載體pAd-IGF2具有可應用于秦川牛IGF2基因功能研究、鑒定和對種子細胞進行改造，調控肌肉生長發(fā)育相關基因的代謝。
文檔編號C12N15/861GK103205462SQ20121052534
公開日2013年7月17日 申請日期2012年12月9日 優(yōu)先權日2012年12月9日
發(fā)明者陳宏 , 黃永震, 孫雨佳, 展召陽, 李密杰, 藍賢勇, 雷初朝 申請人:西北農林科技大學