專利名稱：一種dna甲基化檢測試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種DNA甲基化檢測試劑盒，并涉及一種使用該種試劑盒檢測DNA甲基化的方法。
背景技術(shù)：
目前存在的幾種甲基化檢測方法，如甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，甲基化敏感單核苷酸引物延伸，DNA測序等存在一些局限性甲基化的信息不完整、檢測的通量低、準(zhǔn)確性低等。2004年英國曼徹斯特大學(xué)的兩位科學(xué)家安德烈 海姆(Andre Geim)和康斯坦丁 ·諾沃肖羅夫(Konstantin Novoselov)首次制備出是一種新型的二維碳納米材料-石墨烯，并獲2010年的諾貝爾物理學(xué)獎，受到了全世界研究人員的關(guān)注。石墨烯氧化物是石墨烯的氧化物，其制備簡單，成本也比較低，對單鏈DNA有較強的吸附能力(N. Varghese, U. Mogera, A. Govindaraj, et al. Chem Phys Chem2009, 10, 206 -210;Z. Liu, J. T. Robinson, X. Sun, H. Dai, J. Am. Chem. Soc. 2008，130，10876 - 10877.)，單鏈DNA吸附到石墨烯氧化物上，雙鏈DNA從石墨烯氧化物上脫落。生物芯片是一種高通量的工具，利用石墨烯氧化物的特性， 把生物芯片與石墨烯氧化物相結(jié)合，發(fā)展一種高通量、低成本、準(zhǔn)確、快速的DNA甲基化檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服一些檢測方法的缺陷，研制一種DNA甲基化檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明所述DNA甲基化的檢測試劑盒，包括以下成分(I)反應(yīng)液A:0. 3mg/ml的石墨烯氧化物溶液(2)反應(yīng)液的EDCI (1-(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽)(3)反應(yīng)液C:L0mM suIfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)。本發(fā)明的還提供了一種DNA甲基化檢測試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其主要步驟包括I)制備具有石墨烯氧化物點陣的玻片，具體是將Iml反應(yīng)液A點在氨基修飾的玻片上,干燥后,用超純水沖洗，加入Iml反應(yīng)液B和反應(yīng)液C后在37°C下保存60min ；2)待測DNA樣本的制備從組織或血液中提取基因組DNA，以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，通過PCR擴增，制備待檢測的DNA樣本；3)檢測探針吸附到具有石墨烯氧化物點陣的玻片合成具有淬滅石墨烯氧化物檢測熒光物質(zhì)標(biāo)記的DNA甲基化檢測探針在雜交盒中和I)制備的玻片進(jìn)行物理吸附12h，用PBS洗去多余的探針，掃描記錄玻片上石墨烯氧化物點陣的熒光強度；4)DNA甲基化檢測在3)中加入2)中制備的DNA樣本，在37°C下雜交60min，PBS沖洗后進(jìn)行掃描，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值來檢測DNA甲基化。本發(fā)明所述淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的物質(zhì)為AuNP或其他能淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的金屬顆粒。本發(fā)明中，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值接近為0，加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度與未吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度接近1，證明檢測到DNA甲基化。本發(fā)明具有以下優(yōu)點1.本發(fā)明把石墨烯氧化物和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合，能高通量、低成本、準(zhǔn)確、快速對DNA甲基化進(jìn)行大規(guī)模檢測。 2.本發(fā)明充分運用單鏈DNA能吸附到石墨烯氧化物，雙鏈DNA脫離石墨烯氧化物的特性進(jìn)行DNA甲基化檢測，具有較高的檢測特異性，實施簡單而且有效。


圖1是本發(fā)明的流程示意圖。圖2a) AuNP標(biāo)記的DNA吸附到石墨烯氧化物后的熒光圖，b)加入DNA甲基化樣本后熒光圖。
具體實施例方式下列實例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)該當(dāng)作本發(fā)明的限制。實施例1 :按照下列配方制作一種DNA甲基化的檢測試劑盒(I)反應(yīng)液A:0. 3mg/ml的石墨烯氧化物溶液。(2)反應(yīng)液 B: O. 5mM 的 EDCI。(3)反應(yīng)液 C:1. OmM suIf0-NHSo實施例2 檢測流程如圖1。1. DNA甲基化樣本的制備從組織或血液中提取基因組DNA，以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶(C)轉(zhuǎn)化為尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶則不變。具體步驟如下(1)取適量胃癌組織放入離心管，加入50 μ I 10%303和50(^1 TE，用剪刀剪碎；
(2)在12000rpm離心5min ； (3)去除上清后加入2. 5 μ I RNase酶和500 μ I TE，37°C水浴60min ； (4)在離心管中加入9 μ I蛋白酶K，50°C水浴過夜；(5)加入等體積的飽和酚，混勻IOmin,在IlOOOrpm離心5min后混合液分相，把上清液放置于另一離心管，重復(fù)該步驟4次；(6)在離心管中加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，混勻后在_20°C放置30min ； (7) 12000rpm離心20min，迅速去除溶液；(8)用70%乙醇洗滌沉淀，去除溶液；(9)室溫干燥IOmin后加入100 μ I滅菌水溶解；(10)用紫外分光光度計測定OD值后，-20°C保存。取Hyg基因組DNA,加入5. 5 μ 13M NaOH，用水補齊至55 μ 1，37°C水浴30min變性，在變性的DNA中加入520 μ I新配制的3mol/l亞硫酸氫鈉(pH5. O)和30 μ 10. 5mmol/L的對苯二酌·，混合后離心，用200 μ I石臘油封層，50°C保持16_18h,去除石臘油，在Wizard DNA Clean-Up System純化后的DNA中加入NaOH，終濃度為O. 3mol/l，然后室溫放置5min。加入1/10體積的3M乙酸鈉和2倍體積的乙醇，_20°C放置4小時，在4°C用12000rpm離心30min沉淀DNA。吹干后用雙蒸水溶解，_20°C保存。待檢測的基因P16的擴增引物IF5’-AAAGAGGAGGGGTTGGTTGGTTATTA-3，(SEQ ID NO. 1)，IR:5，-TACCTAATTCCAATTCCCCTACAAACT_3，(SEQ ID NO. 2)，引物不包含CpG位點。PCR反應(yīng)體系50 μ 1，其中含3 μ IlOX的緩沖液，1. 8mmol/lMg2+，200 μ mol/I dNTPs，每條引物各10ρπιο1，2μ I模板DNA，2U Taq DNA聚合酶。在PCR上進(jìn)行擴增，PCR的反應(yīng)條件為95°C，5min ;94°C，Imin變性，62°C，Imin退火，72°C，30sec延伸，共35個循環(huán)；721，71^11終止延伸，41保存。2.制備具有石墨烯氧化物點陣的玻片。Iml反應(yīng)液A點在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗，加入Iml反應(yīng)液B和反應(yīng)液C后在37°C下60min。3.石墨烯氧化物對單鏈DNA有較強的吸附作用，根據(jù)待測的基因設(shè)計檢測用的 DNA 甲基化探針 5’ -ATCGACCTCCGACCGTAAC-3’ (SEQ ID NO. 3)，合成具有 I μ I 濃度為IOOpmol的AuNP顆粒標(biāo)記的探針后在雜交盒中和I)制備的玻片進(jìn)行物理吸附12h，AuNP能淬滅石墨烯氧化物發(fā)出的特定熒光，用PBS洗去多余的探針，在532nm波長下掃描記錄玻片上石墨烯氧化物點陣的熒光強度(圖2a)。4. DNA甲基化檢測在3)中加入2)中制備的DNA甲基化樣本，在37°C下雜交60min后，PBS沖洗后在532nm波長下進(jìn)行掃描(圖2b)，DNA甲基化樣本與石墨烯氧化物上吸附的單鏈DNA結(jié)合后，形成雙鏈DNA，雙鏈DNA容易脫離石墨烯氧化物的吸附，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值接近為0，加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度與未吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度接近1，證明檢測到DNA甲基化。實施例31. DNA甲基化樣本的制備(I)取適量直腸癌組織放入離心管,加入50 μ 110%SDS和500 μ I TE，用剪刀剪碎；(2)在12000rpm離心5min ； (3)去除上清后加入2. 5 μ I RNase酶和500 μ I TE，37°C^KS60min;(4)在離心管中加入9 μ I蛋白酶K，50°C水浴過夜；(5)加入等體積的飽和酹，混勻IOmin,在IlOOOrpm離心5min后混合液分相,把上清液放置于另一離心管，重復(fù)該步驟4次；(6)在離心管中加入2倍體積預(yù)冷的乙醇，混勻后在_20°C放置30min ； (7) 12000rpm離心20min，迅速去除溶液；(8)用70%乙醇洗滌沉淀，去除溶液；(9)室溫干燥IOmin后加入100 μ I滅菌水溶解；(10)用紫外分光光度計測定OD值后，_20°C保存。取1_3μ g基因組DNA，加入5. 5μ 13M NaOH，用水補齊至55 μ 1，DNA中加入520 μ I新配制的3mol/l亞硫酸氫鈉(pH5. O)和30 μ 10. 5mmol/L的對苯二酹,混合后離心,用200 μ I石臘油封層，50°C保持16_18h,去除石臘油，在Wizard DNA Clean-Up System純化后的DNA中加入NaOH，終濃度為O. 3mol/l，然后室溫放置5min。加入1/10體積的3M乙酸鈉和2倍體積的乙醇，_20°C放置4小時，在4°C用12000rpm離心30min沉淀DNA。吹干后用雙蒸水溶解，-20°C保存。待檢測的基因 hMLHl 的引物 IF5’-TTTTTTAGGAGTGAAGGA GG-3’ (SEQ IDNO. 4)， IR:5’-ATAAAACCCTATACCTAATCTATC-3’ (SEQ ID NO. 5)，PCR 反應(yīng)體系 50 μ 1，其中含 3 μ IlOX 的緩沖液，1. 8mmol/l Mg2+，200 μ mol/1 dNTPs，每條引物各 lOpmol，2 μ I 模板DNA，2UTaq DNA聚合酶。在PCR上進(jìn)行擴增，PCR的反應(yīng)條件為95°C，3min ；94°C，IOsec變性，54°C IOsec退火，72°C，15sec延伸，共35個循環(huán)；72°C，IOmin終止延伸，IOC保存。2.制備具有石墨烯氧化物點陣的玻片。Iml反應(yīng)液A點在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗，加入Iml反應(yīng)液B和反應(yīng)液C后在37°C下60min。3.石墨烯氧化物對單鏈DNA有較強的吸附作用，根據(jù)待測的基因hMLHl設(shè)計檢測用的 DNA 甲基化探針 5’-GATGAGGCGGCGATAGATTA-3’ (SEQ ID NO. 6)，合成 hMLHl 具有 I μ I濃度為IOOpmol的AuNP顆粒標(biāo)記的探針后在雜交盒中和I)制備的玻片進(jìn)行物理吸附12h，AuNP能淬滅石墨烯氧化物發(fā)出的特定熒光，用PBS洗去多余的探針，在532nm波長下掃描記錄玻片上石墨烯氧化物點陣的熒光強度，其檢測結(jié)果類似圖2a。

4. DNA甲基化檢測在3)中加入2)中制備的DNA甲基化樣本，在37°C下雜交60min后，PBS沖洗后在532nm波長下進(jìn)行掃描，其檢測結(jié)果類似圖2b，DNA甲基化樣本與石墨烯氧化物上吸附的單鏈DNA結(jié)合后，形成雙鏈DNA，雙鏈DNA容易脫離石墨烯氧化物的吸附，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值接近為0，加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度與未吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度接近1，證明檢測到DNA甲基化。序列表
權(quán)利要求
1.一種DNA甲基化檢測試劑盒，其特征在于包括以下成分(O反應(yīng)液A: O. 3 mg/ml的石墨烯氧化物溶液(2)反應(yīng)液B:0. 5 mM 的 EDCI(3)反應(yīng)液C:1. O mM suIfo-NHSο
2.—種DNA甲基化檢測試劑盒檢測DNA甲基化的方法，其特征在于包括以下步驟1)制備具有石墨烯氧化物點陣的玻片；2)待測DNA樣本的制備從組織或血液中提取基因組DNA，以亞硫酸氫鹽處理的基因組DNA,通過PCR擴增，制備待檢測的DNA樣本；3)檢測探針吸附到具有石墨烯氧化物點陣的玻片合成具有淬滅石墨烯氧化物檢測熒光物質(zhì)標(biāo)記的DNA甲基化檢測探針在雜交盒中和I)制備的玻片進(jìn)行物理吸附12 h，用PBS洗去多余的探針，掃描記錄玻片上石墨烯氧化物點陣的熒光強度；4)DNA甲基化檢測在3)中加入2)中制備的DNA樣本，在37° C下雜交60 min, PBS沖洗后進(jìn)行掃描，吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值來檢測DNA甲基化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，步驟I)是將Iml反應(yīng)液A點在氨基修飾的玻片上，干燥后，用超純水沖洗，加入I ml反應(yīng)液B和反應(yīng)液C后在37° C下保存60 min。
4.根據(jù)權(quán)利2中所述的檢測方法，其特征在于淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的物質(zhì)為AuNP或其他能淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的金屬顆粒。
5.根據(jù)權(quán)利2所述的檢測方法，其特征在于吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度與加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度的比值接近為O，加入DNA甲基化樣本時的石墨烯氧化物熒光強度與未吸附AuNP標(biāo)記的探針時的石墨烯氧化物的熒光強度接近1，證明檢測到DNA甲基化。
全文摘要
本發(fā)明公布一種DNA甲基化檢測試劑盒及其檢測方法，該試劑盒通過制備具有石墨烯氧化物的玻片，根據(jù)特定基因序列設(shè)計甲基化檢測探針，合成具有AuNP或者其他能淬滅石墨烯氧化物檢測熒光的物質(zhì)標(biāo)記的單鏈DNA，并物理吸附到帶有石墨烯氧化物點陣的玻片上，運用石墨烯氧化物吸附單鏈DNA，雙鏈DNA脫離石墨烯氧化物的特性，實現(xiàn)高通量、低成本、準(zhǔn)確、快速地對DNA甲基化的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK103031375SQ20121052464
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者高力, 周陽, 陳克平, 張春霞, 陳亮, 連超群 申請人:江蘇大學(xué)