專利名稱：一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法
一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于抗病毒研究領(lǐng)域，特別涉及到一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法。
背景技術(shù)：
凡納濱對蝦因其生長快、抗病力強(qiáng)、適鹽性廣、肉味鮮美而被引入我國大量養(yǎng)殖， 目前我國的對蝦養(yǎng)殖品種中80%都為凡納濱對蝦,然而,對蝦在大量養(yǎng)殖過程中，也伴隨著病毒性疫病的大量繁殖與傳播，病毒性疫病的的爆發(fā)仍是目前阻滯對蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的最大障礙，其中對奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)是對奸養(yǎng)殖業(yè)危害最為嚴(yán)重的病原之一。TSV病毒是單鏈RNA病毒，主要感染靶器官為甲殼上皮(附肢、鰓、胃、食道、后腸)、結(jié)締組織等，引起對蝦病蝦不攝食，消化道內(nèi)無食物；游泳無力，反應(yīng)遲鈍，甲殼變軟， 蝦體發(fā)紅，尤其是尾扇變紅，幼蝦(O. 05-5克)發(fā)病嚴(yán)重，死亡率高達(dá)80%，而幸存者甲殼有黑斑，即蝦殼角質(zhì)有黑化病灶。近年來，該病毒在我國沿海對蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)大面積流行，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。鑒于凡納濱對蝦在我國具有重要的經(jīng)濟(jì)地位，有必要對其病害防治方法和致病機(jī)理進(jìn)行深入研究，但是TSV病毒屬于RNA，不易保存和純化，因此，建立一個(gè)相對于TSV病毒分離、鑒定和保存的完整的方法對于研究對蝦RNA病毒的防治是必不可少的。
目前，只查到關(guān)于對蝦白斑綜合癥病毒感染模型建立的公開文獻(xiàn)，而關(guān)于對蝦桃拉病毒(TSV)感染模型的建立，尚未見報(bào)道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，通過本發(fā)明的方法建立的對蝦TSV病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA病毒致病力比較強(qiáng)，感染效果比較明顯；鑒定方法比較簡單，判斷標(biāo)準(zhǔn)明晰，不僅適用于RNA病毒的抗病選育研究，還可以用于TSV致病機(jī)理的研究。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，包括以下步驟(1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋， 用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾，每尾注射 1(Γ 2μ L，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)， 將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中；(2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3';擴(kuò)增產(chǎn)物在250bp Marker附近出現(xiàn)一條亮帶,說明該奸可能被桃拉病毒感染,再通過純化、克隆和測序確定該序列為桃拉病毒序列，即該蝦為桃拉病毒感染陽性對蝦。
(3) TSV病毒液的制備取2_5g TSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨3成粉末，將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入12 30ml的O. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用O. 45 μ m的濾器過濾，利用步驟(2)所述 PCR方法檢測病毒液是否為陽性，以確定在制備病毒液過程中核酸完全裂解出來，即病毒粒子完全釋放出來，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建 TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d，既而確定感染量，確定病毒感染模型。所述PBS平衡鹽溶液為每IL平衡鹽溶液中含有O. 2g氯化鉀，0.2g磷酸二氫鉀， 8. OOg氯化鈉，2. 16g 7個(gè)水分子的磷酸氫二鈉；以上所述步驟(4)的η值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
以上所述步驟(2)擴(kuò)增的體系為12yL 2 X Taq PCR康為試劑，11 μ L的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各I μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s， 35個(gè)循環(huán)，72°C延伸IOmin0
以上所述步驟(I)試驗(yàn)對蝦的體重為l(Tl2g。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是通過本發(fā)明的方法建立的對蝦TSV病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA病毒致病力比較強(qiáng)，感染效果比較明顯；鑒定方法比較簡單，判斷標(biāo)準(zhǔn)明晰，不僅適用于RNA病毒的抗病選育研究，還可以用于TSV致病機(jī)理的研究。


圖I為凡納濱對蝦TSV感染模型的建立，橫坐標(biāo)為對蝦感染TSV的天數(shù)，縱坐標(biāo)為對蝦的死亡率，系列1-5代表由低到高的不同濃度的病毒液攻毒組，系列6為對照組；圖2為TSV感染對蝦的肝胰腺組織的RNA提取圖；圖3為凡納濱對蝦體內(nèi)TSV的PCR檢測圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍，實(shí)施例I:一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，包括以下步驟(1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾(體重l(Tl2g)， 每尾注射l(Tl2yL (以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦)，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在 28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)，將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中；(2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，擴(kuò)增的體系為12 μ L 2 X Taq PCR康為試劑，11 μ L的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各I μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制備取2gTSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末， 將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入12ml的O. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用O. 45 μ m的濾器過濾，利用步驟(2)所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d,既而確定感染量，確定病毒感染模型；n值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
如圖I所示，隨著TSV病毒感染液濃度的降低，凡納濱對蝦死亡高峰的出現(xiàn)時(shí)間相對延后，且觀察時(shí)間內(nèi)對蝦累計(jì)死亡率相對降低；當(dāng)TSV病毒液的稀釋度在10_卜10_2時(shí)，7d 內(nèi)對蝦幾乎全部死亡(大于90%)，而稀釋度為10_3倍時(shí)死亡率明顯降低。根據(jù)本發(fā)明的判定標(biāo)準(zhǔn)7d內(nèi)感染對蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒液稀釋倍數(shù)作為RNA干擾用病毒感染濃度。因此，該批對蝦進(jìn)行RNA感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用的感染液濃度為病毒液作10_2倍稀釋(n=2)。建立病毒感染模型是通過以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦，從而確定對蟲下的病毒感染劑量。
(5)每年10月份左右取南美白對蝦育種中心易感家系群體的對蝦進(jìn)行病毒的復(fù)制，將感染TSV病毒的對蝦組織經(jīng)過液氮充分凍存之后，取出置于-80°c冰箱凍存，待第二年4-5月份將該病蝦組織制備病毒液感染新的對蝦。
實(shí)施例2 一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，包括以下步驟(1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾(體重l(Tl2g)， 每尾注射1(Γ 2μ L (以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦)，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在 28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)，將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中；(2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，擴(kuò)增的體系為12 μ L 2 X Taq PCR康為試劑，11 μ L的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各I μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制備取3gTSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末， 將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入18ml的O. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用O. 45 μ m的濾器過濾，利用步驟(2)所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d,既而確定感染量，確定病毒感染模型；n值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
如圖I所示，隨著TSV病毒感染液濃度的降低，凡納濱對蝦死亡高峰的出現(xiàn)時(shí)間相對延后，且觀察時(shí)間內(nèi)對蝦累計(jì)死亡率相對降低；當(dāng)TSV病毒液的稀釋度在10_卜10_2時(shí)，7d內(nèi)對蝦幾乎全部死亡(大于90%)，而稀釋度為10_3倍時(shí)死亡率明顯降低。根據(jù)本發(fā)明的判定標(biāo)準(zhǔn)7d內(nèi)感染對蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒液稀釋倍數(shù)作為RNA干擾用病毒感染濃度。因此，該批對蝦進(jìn)行RNA感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用的感染液濃度為病毒液作10_2倍稀釋(n=2)。建立病毒感染模型是通過以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦，從而確定對蟲下的病毒感染劑量。
(5)每年10月份左右取南美白對蝦育種中心易感家系群體的對蝦進(jìn)行病毒的復(fù)制，將感染TSV病毒的對蝦組織經(jīng)過液氮充分凍存之后，取出置于-80°c冰箱凍存，待第二年4-5月份將該病蝦組織制備病毒液感染新的對蝦。
實(shí)施例3:一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，包括以下步驟
(1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾(體重l(Tl2g)， 每尾注射l(Tl2yL (以I y L/g的劑量注射病毒給每只對蝦)，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在 28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)，將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中；(2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，擴(kuò)增的體系為12 μ L 2XTaq PCR康為試劑，11 μ L的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各I μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制備取4gTSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末， 將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入24ml的O. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用O. 45 μ m的濾器過濾，利用步驟(2)所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d,既而確定感染量，確定病毒感染模型；n值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
如圖I所示，隨著TSV病毒感染液濃度的降低，凡納濱對蝦死亡高峰的出現(xiàn)時(shí)間相對延后，且觀察時(shí)間內(nèi)對蝦累計(jì)死亡率相對降低；當(dāng)TSV病毒液的稀釋度在10_卜10_2時(shí)，7d 內(nèi)對蝦幾乎全部死亡(大于90%)，而稀釋度為10_3倍時(shí)死亡率明顯降低。根據(jù)本發(fā)明的判定標(biāo)準(zhǔn)7d內(nèi)感染對蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒液稀釋倍數(shù)作為RNA干擾用病毒感染濃度。因此，該批對蝦進(jìn)行RNA感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用的感染液濃度為病毒液作10_2倍稀釋(n=2)。建立病毒感染模型是通過以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦，從而確定對蟲下的病毒感染劑量。
(5)每年10月份左右取南美白對蝦育種中心易感家系群體的對蝦進(jìn)行病毒的復(fù)制，將感染TSV病毒的對蝦組織經(jīng)過液氮充分凍存之后，取出置于-80°c冰箱凍存，待第二年4-5月份將該病蝦組織制備病毒液感染新的對蝦。
實(shí)施例4 一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，包括以下步驟(1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾(體重l(Tl2g)， 每尾注射1(Γ 2μ L (以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦)，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在 28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)，將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中；(2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5 ' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3 '，下游引物5 ' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3 '，擴(kuò)增的體系為12 μ L 2 X Taq PCR康為試劑，11 μ L的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各I μ L，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35 個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin ;(3)TSV病毒液的制備取5gTSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末， 將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入30ml的O. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用O. 45 μ m的濾器過濾，利用步驟(2)所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 10_(η_2)，ΙΟ+1)，10_n，10_(n+1)，10_(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d,既而確定感染量，確定病毒感染模型；n值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
如圖I所示，隨著TSV病毒感染液濃度的降低，凡納濱對蝦死亡高峰的出現(xiàn)時(shí)間相對延后，且觀察時(shí)間內(nèi)對蝦累計(jì)死亡率相對降低；當(dāng)TSV病毒液的稀釋度在10_卜10_2時(shí)，7d 內(nèi)對蝦幾乎全部死亡(大于90%)，而稀釋度為10_3倍時(shí)死亡率明顯降低。根據(jù)本發(fā)明的判定標(biāo)準(zhǔn)7d內(nèi)感染對蝦的累積死亡率大于90%的組的最大病毒液稀釋倍數(shù)作為RNA干擾用病毒感染濃度。因此，該批對蝦進(jìn)行RNA感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，使用的感染液濃度為病毒液作10_2倍稀釋(n=2)。建立病毒感染模型是通過以I μ L/g的劑量注射病毒給每只對蝦，從而確定對蟲下的病毒感染劑量。
(5)每年10月份左右取南美白對蝦育種中心易感家系群體的對蝦進(jìn)行病毒的復(fù)制，將感染TSV病毒的對蝦組織經(jīng)過液氮充分凍存之后，取出置于-80°c冰箱凍存，待第二年4-5月份將該病蝦組織制備病毒液感染新的對蝦。
核苷酸序列表〈110〉廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所〈120〉一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法〈160>2000<170>PatentIn version 3. 5 〈210〉 I <211>231bp 〈212〉 RNA〈213〉對奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus)<400>1aagtagacag ccgcgcttgc gtggtgggac ttaattaatg cctgctaacc caactgaaat 60 tgataattca aatacaacaa ctagtggagg actaattcca ggaggtagtg ttacaaacaa 120tgaaggttct acaaccttga tgaacgatat cccaatcacc agtcagaatg tagttctatc 180 caagaatgta acagataacc tgtttgaagt ccaggaccaa gctctcattg a231〔核苷酸序列表
〈110〉廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所
〈120〉一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法
〈160>2000
<170>PatentIn version 3. 5
〈210〉 1 <211>231bp 〈212〉 RNA
〈213〉對奸桃拉病毒(Taura Syndrome Virus)
<400>1
aagtagacag ccgcgcttgc gtggtgggac ttaattaatg cctgctaacc caactgaaat 60 tgataattca aatacaacaa ctagtggagg actaattcca ggaggtagtg ttacaaacaa 120 tgaaggttct acaaccttga tgaacgatat cccaatcacc agtcagaatg tagttctatc 180 caagaatgta acagataacc tgtttgaagt ccaggaccaa gctctcattg a23權(quán)利要求
1.一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)TSV病毒組織的獲得將保存的TSV純化病毒粒子按質(zhì)量體積比1:1000稀釋，用胰島素注射器分別注射于凡納濱對蝦的第三腹節(jié)肌肉處，試驗(yàn)對蝦30尾，每尾注射l(Tl2ii L，注射后對蝦養(yǎng)殖水溫控制在28-30°C，鹽度28%。，持續(xù)充氣，每天觀察對蝦狀態(tài)，將瀕死對蝦及時(shí)收取置于液氮中； (2)TSV病毒檢測用PCR方法檢測對蝦TSV病毒感染情況，抽取瀕死對蝦的肝胰腺組織RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用此cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增TSV病毒上下游引物序列為上游引物5' -TCAATGAGAGCTTGGTCC-3'，下游引物5' -AAGTAGACAGCCGCGCTT-3'； (3)TSV病毒液的制備取2 5g TSV陽性的對蝦肝胰腺組織和肌肉組織液氮研磨成粉末，將其置于50ml的無菌的離心管中，再加入12 30ml的0. OlM的滅菌PBS緩沖液，劇烈震蕩混勻，以8000g離心15min，將上層清液用0. 45 y m的濾器過濾，利用步驟(2)所述PCR方法檢測病毒液是否為陽性，若為陽性則分裝成病毒保存液，_80°C凍存?zhèn)溆茫?4)構(gòu)建TSV 感染模型將 TSV 病毒液按 l(T(n-2)，lO+-1)，10-n，10-(n+1)，10-(n+2)共 5 個(gè)濃度制備感染液，將隨機(jī)挑選的90只對蝦分成6組，進(jìn)行肌肉注射感染，對照組注射等體積的PBS平衡鹽溶液，每小時(shí)觀察對蝦情況，連續(xù)觀察7d，既而確定感染量，確定病毒感染模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步驟(4)的n值為感染對蝦后7d內(nèi)致90%以上的對蝦死亡的最大的稀釋倍數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步驟(2)擴(kuò)增的體系為12ii L 2 X Taq PCR康為試劑，IluL的無菌雙蒸水，模板和上下游引物各Iu L，擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 3min, 94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 30s, 35個(gè)循環(huán)，72°C 延伸 IOmin0
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于所述步驟(I)試驗(yàn)對蝦的體重為l(Tl2g。
全文摘要
本發(fā)明公開一種對蝦病毒分離、鑒定和感染模型建立的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)TSV病毒組織的獲得；(2)TSV病毒檢測；(3)TSV病毒液的制備；(4)構(gòu)建TSV感染模型。通過本發(fā)明的方法建立的對蝦TSV病毒感染模型重現(xiàn)性好，RNA病毒致病力比較強(qiáng)，感染效果比較明顯；鑒定方法比較簡單，判斷標(biāo)準(zhǔn)明晰，不僅適用于RNA病毒的抗病選育研究，還可以用于TSV致病機(jī)理的研究。
文檔編號C12Q1/70GK102978171SQ20121052476
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者陳秀荔, 趙永貞, 陳曉漢, 彭敏, 李詠梅, 楊春玲, 何蘋萍 申請人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所