專利名稱：識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體a1的膠體金標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，更具體涉及用膠體金標(biāo)記單鏈抗體。
背景技術(shù)：
1993年以來，我國蝦病爆發(fā)性流行，引起養(yǎng)殖對(duì)蝦大面積死亡，經(jīng)濟(jì)損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的DNA雙鏈病毒一對(duì)蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)所致。該病毒可以感染我國所有人工海水養(yǎng)殖的對(duì)蝦種類，且感染性強(qiáng)，發(fā)病快，死亡率高，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的危害；據(jù)報(bào)道，其它國家和地區(qū)也有類似情況。目前，對(duì)蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病原接觸被認(rèn)為是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速診斷。目前較可靠和快速的診斷方法主要是PCR，核酸探針技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)。但是PCR和核酸探針技術(shù)只能依賴于實(shí)驗(yàn)室，技術(shù)條件要求較高，廣大蝦農(nóng)掌握此技術(shù)存在很大的困難。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)雖有望發(fā)展成為可在養(yǎng)蝦場(chǎng)應(yīng)用的診斷技術(shù)，但是由于此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體的制備非常麻煩和費(fèi)用昂貴，大大限制了該技術(shù)在診斷對(duì)蝦病毒病方面的應(yīng)用和發(fā)展。再由于常規(guī)的免疫印記法還需要二抗，不可避免的增加了檢測(cè)時(shí)間和成本。
“一種識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1及其用途”，專利申請(qǐng)?zhí)?0131231.6，申請(qǐng)日2000年12月8日，申請(qǐng)人中國科學(xué)院水生生物研究所。該申請(qǐng)?jiān)敿?xì)介紹了識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1的DNA序列、制備方法及其用途。由于該申請(qǐng)所述的“對(duì)蝦白斑桿狀病毒”以前有不同的命名，該命名國內(nèi)現(xiàn)已統(tǒng)一命名為“對(duì)蝦白斑綜合癥病毒”。
膠體金標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，是目前免疫組織化學(xué)技術(shù)中常用的敏感方法之一。膠體金是氯金酸的水溶膠，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結(jié)合，是免疫標(biāo)記技術(shù)中常用的一種非放射性示蹤劑。近年來，抗體IgG的膠體金標(biāo)記應(yīng)用最為廣泛，其技術(shù)條件具有通用性。而單鏈抗體僅是抗體的可變部分，只有完整抗體1/6的分子量，因此單鏈抗體的標(biāo)記完全不能參照IgG的條件，必須重新摸索條件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1的膠體金標(biāo)記方法，該方法將對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體經(jīng)純化、透析、調(diào)配pH值、確定膠體金溶液與單鏈抗體混和的最佳穩(wěn)定量、把膠體金溶液與單鏈抗體混和、離心、去上清液，即得到膠體金標(biāo)記的單鏈抗體A1。該方法可簡化檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的操作步驟，使得檢測(cè)時(shí)間和成本大大降低。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1的膠體金標(biāo)記方法，按下列步驟順序進(jìn)行1、取識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1(該單鏈抗體即為申請(qǐng)?zhí)?0131231.6，申請(qǐng)日2000年12月8日，申請(qǐng)人中國科學(xué)院水生生物研究所，發(fā)明名稱為“一種識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1及其用途”中所述的“識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1”)，用親和層析法純化單鏈抗體A1，并在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；2、用檸檬酸鈉還原法制備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測(cè)定單鏈抗體A1的等電點(diǎn)是pH 5.8，將膠體金溶液的pH調(diào)至6.2，使膠體金溶液的pH高于單鏈抗體A1等電點(diǎn)0.5 pH單位；3、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘后，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時(shí)，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩(wěn)定量；4、按步驟3確定的最佳穩(wěn)定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時(shí)間均勻加入到膠體金溶液中，室溫?cái)嚢?0分鐘；5、用12000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘，去上清液，沉淀物即為膠體金標(biāo)記的單鏈抗體A1。
6、將沉淀物溶于步驟4所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、余者為超純水，用6當(dāng)量的鹽酸調(diào)pH至7.4。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)與效果1、用于對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的檢測(cè)將待測(cè)樣品5μl點(diǎn)到NC膜上，用1％BSA/PBS包被5分鐘，然后放入膠體金-A1溶液中5-10分鐘取出，用水洗，觀察斑點(diǎn)顏色，有棕紅色斑點(diǎn)的為樣品中含有對(duì)蝦白斑綜合癥病毒。
2、用于膠體金免疫電鏡法可將對(duì)蝦白斑綜合癥病毒感染的病蝦組織包埋、切片后，與膠體金-A1保溫，洗去未結(jié)合膠體金，然后用電鏡觀察，可研究單鏈抗體A1的抗原決定簇在病毒結(jié)構(gòu)上的定位，以及示蹤病毒的感染過程。
3、噬菌體抗體展示技術(shù)不僅避免了在制備多克隆抗體過程中由個(gè)體引起的效價(jià)及專一性的差異，也避免了在制備單克隆抗體過程中繁雜的雜交瘤技術(shù)，并且操作簡單、經(jīng)濟(jì)，篩選范圍廣，使大量制備抗體或工廠化生產(chǎn)抗體成為可能。單鏈抗體A1可通過細(xì)菌的培養(yǎng)而獲得大量的抗對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的抗體，使得抗體制備的成本大大降低。單鏈抗體A1膠體金標(biāo)記的成功，使得對(duì)蝦白斑綜合癥病毒檢測(cè)的成本進(jìn)一步降低，也可免去二抗，使檢測(cè)程序得到很大的簡化。
具體實(shí)施例方式一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1的膠體金標(biāo)記方法，按下列步驟順序進(jìn)行1、取識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1(該單鏈抗體即為申請(qǐng)?zhí)?0131231.6，申請(qǐng)日2000年12月8日，申請(qǐng)人中國科學(xué)院水生生物研究所，發(fā)明名稱為“一種識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1及其用途”中所述的“識(shí)別對(duì)蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體A1”)，用親和層析法純化單鏈抗體A1，并在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；2、用檸檬酸鈉還原法制備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測(cè)定單鏈抗體A1的等電點(diǎn)是pH 5.8，將膠體金溶液的pH調(diào)至6.2，使膠體金溶液的pH高于單鏈抗體A1等電點(diǎn)0.5pH單位；3、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘后，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時(shí)，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩(wěn)定量；4、按步驟3確定的最佳穩(wěn)定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時(shí)間均勻加入到膠體金溶液中，室溫?cái)嚢?0分鐘；5、用12000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘，去上清液，沉淀物即為膠體金標(biāo)記的單鏈抗體A1；6、對(duì)識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒其它的單鏈抗體的膠體金標(biāo)記方法，同樣按照步驟1-5的方法進(jìn)行。
7、將沉淀物溶于步驟4所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、余者為重蒸水，用6當(dāng)量的鹽酸調(diào)pH至7.4。
權(quán)利要求
1.一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1的膠體金標(biāo)記方法，其特征在于，該方法按下列步驟順序進(jìn)行a、取識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體A1，用親和層析法純化單鏈抗體A1，并在0.005mol/L NaCl pH7.0的溶液中透析；b、用檸檬酸鈉還原法制備20-30nm的膠體金溶液，用凝膠電泳法測(cè)定單鏈抗體A1的等電點(diǎn)是pH5.8，將膠體金溶液的pH調(diào)至6.2，使膠體金溶液的pH高于單鏈抗體A1等電點(diǎn)0.5pH單位；c、用1毫升膠體金溶液與0.1毫升含0.1-0.5毫克不同蛋白濃度的單鏈抗體A1混和，5分鐘后，加入0.1毫升10％的NaCl溶液，放置1-2小時(shí)，觀察溶液的顏色變化，將紅色中蛋白濃度最低的確定為抗體的最佳穩(wěn)定量；d、按步驟c確定的最佳穩(wěn)定量，將單鏈抗體A1用5分鐘時(shí)間均勻加入到膠體金溶液中，室溫?cái)嚢?0分鐘；e、用12000轉(zhuǎn)/分離心60分鐘，去上清液，沉淀物即為膠體金標(biāo)記的單鏈抗體A1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體的膠體金標(biāo)記方法，其特征在于，將膠體金標(biāo)記的單鏈抗體A1溶于權(quán)利要求1步驟中所用膠體金溶液1/10體積的保存液中，在攝氏4度中保存；其中保存液的配方為每升含四硼酸鈉0.4克、牛血清白蛋白1.0克、疊氮鈉0.1克、余者為重蒸水，用6當(dāng)量的鹽酸調(diào)pH至7.4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種識(shí)別對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體的膠體金標(biāo)記方法，涉及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，該方法將對(duì)蝦白斑綜合癥病毒單鏈抗體經(jīng)純化、透析、調(diào)配pH值、確定膠體金溶液與單鏈抗體混和的最佳穩(wěn)定量、把膠體金溶液與單鏈抗體混和、離心、去上清液，即得到膠體金標(biāo)記的單鏈抗體Al。該方法可簡化檢測(cè)對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的操作步驟，使得檢測(cè)時(shí)間和成本大大降低。膠體金標(biāo)記的單鏈抗體可用于對(duì)蝦白斑綜合癥病毒的檢測(cè)，用于膠體金免疫電鏡法，可研究單鏈抗體Al的抗原決定簇在病毒結(jié)構(gòu)上的定位，以及示蹤病毒的感染過程。
文檔編號(hào)G01N33/532GK1540351SQ20031011129
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月30日
發(fā)明者戴和平, 戴玲芬, 張小華, 趙若虹, 韓明信 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院水生生物研究所