斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白t基因及其編碼的蛋白的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明公開了斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T及其編碼的蛋白的氨基序列，屬于生物基 因技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞周期調(diào)控是一個(gè)精確調(diào)控的過程。在細(xì)胞分裂過程中真核生物的細(xì)胞周期可 W概括為兩個(gè)大的階段；細(xì)胞分裂間期（即G1時(shí)期、S時(shí)期和G2時(shí)期）和細(xì)胞分裂期（即 M時(shí)期），在細(xì)胞分裂時(shí)期，需要許多周期蛋白參與調(diào)控W保證其精確性。
[0003] 細(xì)胞周期蛋白T(切Clin T)是細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控因子，和細(xì)胞周期蛋白依 賴性激酶9(cyclin cbpendent kinase 9，CD腳）等組成正性轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)因子b(positive transcription elongation factor b，P-TE訊）參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄延伸反應(yīng)的正性調(diào)控。 切clin T 和 CDK9 組成的 P-TE訊協(xié)同 CDK8、cyclin C、巧clin K、RNA 聚合酶 II (P0LR2A)、 負(fù)性調(diào)控因子值SIF、肥L巧等共同調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄，保證細(xì)胞功能的正常發(fā)揮。目前已知 的cyclin家族成員W A-J進(jìn)行編號(hào)，共有約15種，其中cyclin T作為轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)控 因子，在艾滋病、屯、肌肥大、腫瘤等疾病中有較深入的研究。切clins不僅是CDKs的激活 亞基，而且是復(fù)合體（cyclins/CDKs)與其他基團(tuán)或者調(diào)節(jié)因子直接作用時(shí)的識(shí)別效應(yīng) 器。1995年，人們首先從果蛹中分離純化出P-TE訊，通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了其成分主要是 cyclin T和CDK9等。近幾年的研究表明，cyclin T是胚胎正常發(fā)育、細(xì)胞生長(zhǎng)與分化W 及艾滋病病毒化IV-1)轉(zhuǎn)錄復(fù)制等過程必不可少的關(guān)鍵因子之一，其功能和作用機(jī)理是目 前研究的熱點(diǎn)。隨著細(xì)胞周期蛋白研究的不斷廣泛和深入，cyclin T在一些物種中相繼 被克隆出來，如人化omo sapiens, AAC39638. 1)、小鼠（Mus mus州lus，AAD17205. 1)、果蛹 (Drosophila melanogaster，AA(]73052. 1)、斑馬魚值anio rerio，XP_005167592. 1)和印度 跳蟻（Ha巧e即athos saltator，EFN77646. 1)等，但該基因在對(duì)郵中尚未研究。
[0004] 斑節(jié)對(duì)郵是世界=大對(duì)郵養(yǎng)殖品種之一，人工育種過程中廣泛采用的剪除單側(cè)眼 柄催熟卵巢的技術(shù)會(huì)導(dǎo)致親郵的高死亡率和產(chǎn)卵質(zhì)量低等問題。人們對(duì)于卵巢成熟促進(jìn)因 子（MaUire Promoting Factor,MPF，巧Clin B/CDC2)的研究揭示細(xì)胞周期蛋白在對(duì)郵卵巢 發(fā)育中具有重要的潛在研究?jī)r(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的是W實(shí)驗(yàn)室高通量測(cè)序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR擴(kuò)增引物，并 通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T基因的全表達(dá)序列；此外通過斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞 周期蛋白T基因設(shè)計(jì)巧光定量PCR引物，對(duì)周期蛋白T在斑節(jié)對(duì)郵卵巢各個(gè)發(fā)育時(shí)相的分 布情況及在不同組織中的分布情況進(jìn)行研究分析，為研究斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T在卵巢 發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可W為斑節(jié)對(duì)郵養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情 況從分子層面提供理論基礎(chǔ)。
[0006] 本發(fā)明提供的斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T基因，該基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0007] 該基因的制備方法依次包括下述步驟：
[000引 1、總RNA的提取
[0009] 取健康斑節(jié)對(duì)郵，解剖，取肌肉、卵巢、肝膜腺、腦、屯、臟、腸、精巢、胃等組織，并分 別將組織于1血TrizolQnvitrogen，日本）中勻漿，按Trizol試劑盒使用手冊(cè)提取斑節(jié)對(duì) 郵總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于-80°C保存。
[0010] 2、cDNA第一鏈的合成
[0011] 取上述斑節(jié)對(duì)郵總3歴2^1與反轉(zhuǎn)錄引物巧〉660：4〔6〔64押4614〔訊16<3)1^ 1(1化mol/L)混合在反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-鏈，反應(yīng)條件； 42°C 60min,70°C 15min〇
[0012] 3、斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T的PCR擴(kuò)增、克隆
[001引根據(jù)已獲得EST序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends, RACE)和半巢式 PCR(semi-nest PCR)技術(shù)擴(kuò)增斑節(jié)對(duì)郵 cyclinT基因的3'和5'未知序列。在3' RACE中，一擴(kuò)使用正向引物T3SP1(5' -CAAA AGGACCTGTTTGGAGGCACAT-3')和接頭通用引物 AP (GGCCACGCGACTAGTAC);二擴(kuò)使用正向引 物 T3SP2 巧'-GACCGCCTTCGTCCTGAAAAGGAATC-3')和接頭通用引物 AP。在 5' RACE 中，W T5SP1 (5' -CAGGGTCTGTAGCAAAATGTTCTCA-3')和 01igo-dG 巧'-GGGGGGGGGGGGGGG-3') 為引物進(jìn)行一擴(kuò)，用 T5SP2 (5' -CGGTGAAAACGGGTGAACGGATGAT-3')和 oligo-dG 進(jìn)行二次 PCR。對(duì)結(jié)果正確的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。
[0014] 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化 后，克隆到PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌巧scherichia coli)D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽 性克隆，提交上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。
[0015] 4、對(duì)斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T基因的測(cè)定
[0016] 所得到的PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行分離檢測(cè)后，將PCR產(chǎn)物純化 后，克隆到PMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌巧scherichia coli)D冊(cè)a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽 性克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件進(jìn)行同源性測(cè)定，來確定為斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋 白T基因同源序列。
[0017] 上述的斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T基因編碼的蛋白，所述的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示
[0018] 該氨基酸序列WSEQ ID N0:1基因序列的15bp處的起始密碼子ATG編碼至3147bp 處的終止密碼子TAG,編碼1044個(gè)氨基酸序列。
[0019] 上述的斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T在斑節(jié)對(duì)郵不同組織和發(fā)育各時(shí)期分布、表達(dá)。
[0020] 提取健康的斑節(jié)對(duì)郵不同組織（包括肌肉、卵巢、肝膜腺、腦、屯、臟、腸、精巢、胃） W及不同發(fā)育時(shí)期的卵巢的總RNA，按照PremeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)操作 手冊(cè)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。將不同組織樣品cDNA稀釋20倍作為模板，采用SYBR Gre en I染料法，在Roche巧光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。依照TaKaRa SYBR嚴(yán) Pri meScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體 系為 lOuL，包含 5yL 的 2X SYBR Green Realtime PCR Master Mix, 3yL 稀釋的模板， 各0.2化正、反引物（10 ymol/L)及1.6化的雙蒸水。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng) 參數(shù)為95°C預(yù)變性10s ;然后95°C變性15s，60°C退火延伸20s，共45個(gè)循環(huán)。使用引物 reT-F 巧'-TTTAGATGCCGCAGTGTTAGAA-3')和 reT-R(5' -TTTGGCTCAGGAGGTTTACG-3') 擴(kuò)增目標(biāo)基因，rEF-F巧'-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3 ')和 i~EF-R(5 ' -CGTGGTG CATCTCCACAGACT-3')擴(kuò)增EF-la基因作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用相對(duì)ACT法（2-A ACT 法）分析化cyclin T基因在斑節(jié)對(duì)郵各組織中的相對(duì)表達(dá)量。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：
[0022] 1、本發(fā)明提供的基因不僅為研究斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T在卵巢發(fā)育中的作用 奠定基礎(chǔ)，而且可W為斑節(jié)對(duì)郵養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層面 提供理論基礎(chǔ)。
[0023] 2、根本發(fā)明提供的基因序列設(shè)計(jì)dsRNA，然后進(jìn)行對(duì)郵的活體注射，可有效促進(jìn)對(duì) 郵卵巢發(fā)育，細(xì)胞周期進(jìn)程
[0024] 3、本發(fā)明提供的重組蛋白可W在體外合成，可W作為催熟劑注射對(duì)郵，促進(jìn)卵巢 發(fā)育，細(xì)胞周期進(jìn)程。
【附圖說明】
[0025] 圖1是利用實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)化cyclin T在斑節(jié)肌肉、卵巢、肝膜腺、腦、屯、 臟、腸、精巢、胃中的相對(duì)表達(dá)量。
[0026] 圖2利用實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)mcyclin T卵巢發(fā)育各時(shí)期表達(dá)在I期（卵原細(xì) 胞期）、II期（核染色質(zhì)期）、111期（周邊核仁期）、IV期（卵黃囊期）、v期（成熟期）的相 對(duì)表達(dá)量。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的任何限制，任何人在本發(fā)明權(quán)利要求范圍之內(nèi)所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明 的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[002引 W下實(shí)施例中除特別說明外，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法和操作步驟。
[0029] 本發(fā)明提供的斑節(jié)對(duì)郵細(xì)胞周期蛋白T基因，該基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0030] 其制備方法如下：
[0031] 1.總RNA的提取
[0032] 試驗(yàn)所用的雌雄斑節(jié)對(duì)郵（鮮重200g左右）均取自于海南S亞，室內(nèi)水族箱內(nèi)暫 養(yǎng)S天，水溫控制在24~25°C之間。取所需組織約50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol (美 國(guó)invitrogen公司）進(jìn)行勻漿，并按W下步驟提取總RNA。
[0033] 總RNA提取步驟；
[0034] (1)力日200 y L預(yù)冷氯仿，禍旋振蕩Imin混勻，靜置5min，12000g，4°C，15min。
[0035] (2)取S分之一上清溶液，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，冰上放置 lOmin，12000g，4°C，lOmin。
[0036] 做倒掉上清，加1血75%己醇重懸沉淀，7500g，4°C離屯、5min。
[0037] (4)重復(fù)步驟3 -次，并用槍頭吸出上清，干燥5~lOmin
[003引 （5)加40 y Ld地20溶解沉淀
[0039] (6) RNA的電泳檢測(cè)；將電泳槽、梳齒等置于3%肥02過夜浸泡，配置1. 5%的瓊脂 糖凝膠（用0. 5 X T邸溶液配制），取5化總RNA加1 y L上樣緩沖液，進(jìn)行30min電泳檢 巧I]，對(duì)提取的RNA質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定。
[0040] 2. cDNA第一鏈的合成
[00川 cDNA的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)按照相關(guān)試劑盒（PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa))操作方法進(jìn)行。
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 斑節(jié)對(duì)奸細(xì)胞周期蛋白T基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白T基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述的斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白T在斑節(jié)對(duì)蝦不同組織和發(fā)育各時(shí)期 分布與表達(dá)。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白T基因及其編碼的蛋白，旨在提供一種為研究斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白T在卵巢發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎(chǔ)基因及其蛋白，其技術(shù)要點(diǎn)是：該斑節(jié)對(duì)蝦細(xì)胞周期蛋白T基因序列，如SEQ ID NO:1所示；其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；屬于生物基因技術(shù)領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-12, C12Q1-68, C07K14-435
【公開號(hào)】CN104630231
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510082501
【發(fā)明人】邱麗華, 傅明駿, 趙超, 郭松, 江世貴, 周發(fā)林
【申請(qǐng)人】中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所
【公開日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月13日