一種同時(shí)檢測(cè)bp、mbv、hpv的三色熒光定量pcr聯(lián)合檢測(cè)方法及其試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】—種同時(shí)檢測(cè)BP、MBV、HPV的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)方法及其試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蟲下桿狀病毒(Baculovirus Penaei virus, BP)、斑節(jié)對(duì)ife下桿狀病毒(Monodon Baculovirus, MBV)、肝膜腺細(xì)小病毒(HepatopancreaticParvovirus, HPV)的方法，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)方法及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)蝦桿狀病毒病是一種對(duì)蝦的肝胰腺或中腸上皮細(xì)胞核內(nèi)由于感染多角體桿狀病毒而引起的多種對(duì)蝦的急性傳染病，對(duì)桃紅對(duì)蝦、褐對(duì)蝦(P.a z t e c u s )、萬(wàn)氏對(duì)蝦(P.vannami)和緣溝對(duì)奸(P.marginatus)等主要商業(yè)奸類有較大危害,可引起對(duì)奸幼體幾乎100%死亡。對(duì)奸桿狀病毒屬桿狀病毒科A亞群，具囊膜，大小為74X270nm,核衣殼約50nm，含雙股DNA。該病毒能感染多種對(duì)蝦的肝胰腺和中腸上皮細(xì)胞，并只在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，產(chǎn)生多個(gè)金字塔狀的核內(nèi)包涵體。這種包涵體從錐頂?shù)降酌娓?.5-20 μ m，大多數(shù)是8-10 μ m，由晶格排列的多角體蛋白亞單位構(gòu)成。病毒顆粒在包涵體內(nèi)。目前檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒的方法主要是依據(jù)SN/T 1151.5-2003的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行PCR-電泳法檢測(cè)。
[0003]斑節(jié)對(duì)奸桿狀病毒最初由Lightner和Redman從來(lái)自臺(tái)灣的種奸中發(fā)現(xiàn),但實(shí)際上自1976年在臺(tái)灣、菲律賓和南太平洋的塔希提島(Tahiti)等國(guó)家和地區(qū)已相繼出現(xiàn)此病。已知的如中國(guó)、泰國(guó)、新加坡、印度尼西亞、馬來(lái)西亞都有廣泛的分布。嚴(yán)重感染幼體能引起大量死亡，更因繼發(fā)感染其它病毒、細(xì)菌或附生物而導(dǎo)致幼體大批量死亡。斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒屬于桿狀病毒科，桿狀病毒屬A亞群。病毒為桿狀，有囊膜，含雙鏈DNA，核衣殼大小為42X246nm，連囊膜大小約為75X324nm。不同種類的蝦觀察到的病毒顆粒大小略有差異。病毒在細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制，能產(chǎn)生大量直徑0.5-8 μ m的圓形或橢圓形多角體,病毒則多被包果其中。目前檢測(cè)斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒的方法主要是肝胰臟直接染色壓片法檢測(cè)，或依據(jù)SC-T 7202.2-2007、SNT 1151.3-2002 的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行 PCR-電泳法檢測(cè)。
[0004]肝胰腺細(xì)小病毒主要感染對(duì)蝦之后尾幼蟲(postlarvae)及稚蝦，一般病蝦外觀無(wú)明顯特異癥狀，幼體蝦被感染后行動(dòng)不活潑、食欲減退、生長(zhǎng)緩慢、很少蛻皮，體表常有許多共棲性生物或雜物附著；養(yǎng)殖期的幼蝦或成蝦，蝦體瘦弱、體色較深，有些罹病蝦體甲殼表面有大量黑色斑點(diǎn)，有時(shí)甲殼變軟、腹部肌肉變白，抗逆性能力差，常并發(fā)二次性細(xì)菌感染，以弧菌(Vibr1 spp.)最常見，有時(shí)罹病蝦體除繼發(fā)性細(xì)菌感染外被感染的草蝦(P.monodon)?？蓹z出草奸桿狀病毒(Monodon baculovirus, MBV=Pm SNPV)及白斑綜合癥候群病毒(white spot syndrome virus, WSSV)0 (Umesha RK et al, 2003, R)，造成甚大的死亡，其死亡率達(dá)50?90%，并隨著蝦體增長(zhǎng)，病情減輕；種蝦多呈隱性感染而帶病毒。蝦肝胰腺細(xì)小病毒感染之靶的器官為肝胰腺管遠(yuǎn)盲端上皮E細(xì)胞及前中腸后段上皮細(xì)胞，并在細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，且破壞組織細(xì)胞。肝胰腺細(xì)小病毒為單股DNA病毒(Single-StrandDNA),在細(xì)胞核內(nèi)增殖并形成圓形或卵圓形包涵體(inclus1n body),經(jīng)Feulgen氏染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，病毒顆粒大小隨感染蝦種而有差異；如感染草蝦肝胰腺病毒顆粒為22-24nm(Lightner & Redman, 1985)、感染巴拿馬對(duì)蟲下(banana shrimp, Penaeus=Fenneropenaeusmerguiensis),肝膜腺病毒顆粒為 21_22nm (Roubal et al.1989)、感染斑節(jié)奸(kurumashrimp, P.=Marsupenaeus japonicus)、肝膜腺病毒顆粒為 17_20nm(Spann et al, 1997),平均病毒顆粒為22-24Mm。目前檢測(cè)肝胰腺細(xì)小病毒的方法主要為SC/T 7203.1-2007中的PCR-電泳法。
[0005]基于taqman探針的熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)熒光標(biāo)記的探針，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法，該方法操作方便快捷。相比組織病理學(xué)的檢測(cè)或者PCR-電泳法檢測(cè)的方法，靈敏度高、特異性高，可以更有效地檢測(cè)出攜帶病毒的對(duì)蝦。探針?lè)ú粌H可以在2小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，且閉管操作，可以有效地防范PCR產(chǎn)物的污染。
[0006]探針?lè)ㄊ峭ㄟ^(guò)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)的，通過(guò)加入不同的染料，在不同波長(zhǎng)的激發(fā)光下，可以產(chǎn)生不同波長(zhǎng)的熒光。通過(guò)對(duì)探針標(biāo)記FAM、VIC、JOE、NED、HEX等不同的染料，可以檢測(cè)同一次熒光定量PCR擴(kuò)增試驗(yàn)中同時(shí)擴(kuò)增的多個(gè)目的基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)方法。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)試劑盒。
[0009]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，包括如下成分:多色熒光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、熱啟動(dòng)Taq酶陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，所述多色熒光定量PCR MIX中含有同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的的特異性引物及探針，序列分別為:
對(duì)蝦桿狀病毒的
上游引物:BP-F:5，- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3，(SEQ ID NO:1)；
下游引物:BP-R:5’ - CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’ (SEQ ID NO:2)；
熒光探針:BP-P:5’ - TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA -3’ (SEQ ID NO:3)；
斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒的
上游引物:MBV-F:5，- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3，(SEQ ID NO:4)；
下游引物:MBV-R:5’ - AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’ (SEQ ID NO:5)；
熒光探針:MBV-P:5’ - CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG -3’ (SEQ ID NO:6)；
肝胰腺細(xì)小病毒的
上游引物:HPV-F:5’ -CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’ (SEQ ID NO:7)；
下游引物:HPV-R:5’ -AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’ (SEQ ID NO:8)；
熒光探針:HPV-P:5’ -TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’ (SEQ ID NO:9)。
[0010]進(jìn)一步的，上述多色熒光定量PCR MIX中含有5mM MgCl2, 50mM Tris，10mM KCl,400mM dNTP，0.lmg/mL GP32 蛋白，400nM BP_F、400nM BP_R、400nM MBV_F、400nM MBV-R、400nM BMNV-F、400nM BMNV_R、400nM HPV-F、HPV-R，240nM BP_P、240nM MBV_P、240nMBMNV-P、240nM HPV-P。
[0011]進(jìn)一步的，上述病毒核酸提取液含有50mM Tris-HCl，0.7M NaCl，1mM EDTA, 1%的CTAB 和 ImM 的 DTT。
[0012]一種同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦桿狀病毒、肝胰腺細(xì)小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測(cè)方法，包括以下步驟:
1)病毒DNA的提??；
2)多色熒光定量PCR擴(kuò)增:將多色熒光定量PCRMIX 20 μ I與熱啟動(dòng)Taq酶?μ?混合，瞬時(shí)離心后，加入提取好待檢測(cè)的DNA 4μ1 ;同樣按照上述體系設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照，加入陽(yáng)性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品4μ I ;放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測(cè)的名稱和熒光基團(tuán)種類，設(shè)定反應(yīng)程序?yàn)?94°C 2分鐘后；94°C 15秒，55°C 30秒，40個(gè)循環(huán)；若使用帶毛細(xì)管的儀器LightCycler，則反應(yīng)程序?yàn)?為93°C 2分鐘后；93°C 5秒58°C 45秒，共40個(gè)循環(huán)；
3)結(jié)果分析:根據(jù)信噪情況設(shè)定和調(diào)整基線和閾值，通過(guò)收集的熒