結(jié)果分析和判定
反應結(jié)束后，根據(jù)信噪情況設定和調(diào)整基線和閾值，陰性質(zhì)控品應無擴增曲線，陽性質(zhì)控品的FAM、JOE和CY5熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線，若待測樣品中FAM熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為對蝦桿狀病毒陽性，JOE熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為斑節(jié)對蝦陽性，CY5熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為肝胰腺細小病毒陽性。
[0031]下面對本發(fā)明檢測試劑盒及其檢測方法作進一步的效果檢測。
[0032]一、靈敏度實驗將上述人工合成的陽性質(zhì)控品，依次稀釋為1X107、1X106、1X105、1X104、1X103、I X 12拷貝/ μ 1，進行靈敏度實驗。
[0033]圖1為多色熒光PCR體系中對蝦桿狀病毒檢測的敏感性實驗，從左到右依次為I X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 12 拷貝 /μ I 的標準品的擴增結(jié)果。
[0034]圖2為多色熒光PCR體系中斑節(jié)對蝦桿狀病毒檢測的敏感性實驗，從左到右依次為 I X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 12拷貝 / μ I 的標準品的擴增結(jié)果。
[0035]圖3為多色熒光PCR體系中肝胰腺細小病毒檢測的敏感性實驗，從左到右依次為I X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X 12 拷貝 /μ I 的標準品的擴增結(jié)果。
[0036]結(jié)果證實本試劑盒檢測靈敏度為:
對蝦桿狀病毒靈敏度達到1.0X 13拷貝/ μ I ;
斑節(jié)對蝦桿狀病毒靈敏度達到1.0 X 13拷貝/ μ I ;
肝胰腺細小病毒靈敏度達到1.0X 13拷貝/μ I。
[0037]由此，該多色熒光定量PCR的方法敏感度優(yōu)于普通PCR方法。
[0038]二、特異性實驗
根據(jù)上述的多色熒光定量PCR檢測方法，用從廣東省多個出入境單位獲得的對蝦桿狀病毒ΒΡ、斑節(jié)對奸桿狀病毒MBV、中腸腺壞死桿狀病毒、肝胰腺細小病毒HPV、對奸白斑病毒W(wǎng)SSV、傳染性皮下和造血器官壞死病毒IHHNV以及陰性對照進行驗證實驗并對產(chǎn)物進行測序驗證，結(jié)果證實，本發(fā)明方法及試劑盒特異性好，未出現(xiàn)假陰性或假陽性，吻合度為100%，實驗結(jié)果見圖4、圖5、圖6。
[0039]圖4為多色熒光PCR體系中對蝦桿狀病毒檢測的特異性實驗，對蝦桿狀病毒為陽性，斑節(jié)對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、肝胰腺細小病毒、對蝦白斑病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、及陰性質(zhì)控品均為陰性。
[0040]圖5為多色熒光PCR體系中對斑節(jié)蝦桿狀病毒檢測的特異性實驗，斑節(jié)對蝦桿狀病毒為陽性，對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、肝胰腺細小病毒、對蝦白斑病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、及陰性質(zhì)控品均為陰性。
[0041]圖6為多色熒光PCR體系中肝胰腺細小病毒檢測的特異性實驗，肝胰腺細小病毒為陽性，對蝦桿狀病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、對蝦白斑病毒(WSSV)、傳染性皮下和造血器官壞死病毒(IHHNV)、及陰性質(zhì)控品均為陰性。
[0042]三、重復性試驗
將8次獨立重復提取含陽性質(zhì)控品質(zhì)粒分別進行雙色熒光定量PCR擴增，均出現(xiàn)一至的曲線，表明本發(fā)明的雙色熒光定量PCR檢測方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。
[0043]為本領域的專業(yè)技術人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均落在本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
[0044]為本領域的專業(yè)技術人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明專利的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均落在本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種同時檢測對蝦桿狀病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、肝胰腺細小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測試劑盒，包括如下成分:多色熒光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、熱啟動Taq酶陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品，其特征在于:所述多色熒光定量PCR MIX中含有同時檢測對蝦桿狀病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、肝胰腺細小病毒的的特異性引物及探針，序列分別為: 對蝦桿狀病毒的 上游引物:BP-F:5，- AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA -3，(SEQ ID NO:1)；下游引物:BP-R:5’ - CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA -3’ (SEQ ID NO:2)；熒光探針:BP-P:5’ - TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA -3’ (SEQ ID NO:3)； 斑節(jié)對蝦桿狀病毒的 上游引物:MBV-F:5，- TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA -3，(SEQ ID NO:4)；下游引物:MBV-R:5’ - AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT -3’ (SEQ ID NO:5)；熒光探針:MBV-P:5’ - CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG -3’ (SEQ ID NO:6)； 肝胰腺細小病毒的上游引物:HPV-F:5’ -CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’ (SEQ ID NO:7)；下游引物:HPV-R:5’ -AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’ (SEQ ID NO:8)；熒光探針:HPV-P:5’ -TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’ (SEQ ID NO:9)。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述多色熒光定量PCRMIX中含有5mM MgCl2, 50mM Tris，10mM KCl, 400mM dNTP，0.lmg/mL GP32 蛋白，400nM BP_F、400nMBP-R、400nM MBV_F、400nM MBV_R、400nM BMNV_F、400nM BMNV_R、400nM HPV_F、HPV-R，240nMBP-P、240nM MBV_P、240nM BMNV_P、240nM HPV-P。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述病毒核酸提取液含有50mMTris-HCl,0.7M NaCl,1mM EDTA,1% 的 CTAB 和 ImM 的 DTT。
4.一種同時檢測對蝦桿狀病毒、斑節(jié)對蝦桿狀病毒、肝胰腺細小病毒的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)病毒DNA的提取； 2)多色熒光定量PCR擴增:將多色熒光定量PCRMIX 20 μ I與熱啟動Taq酶?μ?混合，瞬時離心后，加入提取好待檢測的DNA 4μ1 ;同樣按照上述體系設置陽性和陰性對照，加入陽性質(zhì)控品或陰性質(zhì)控品4μ I ;放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)，設置各檢測的名稱和熒光基團種類，設定反應程序為:94°C 2分鐘后；94°C 15秒，55°C 30秒，40個循環(huán)；若使用帶毛細管的儀器LightCycler，則反應程序為:為93°C 2分鐘后；93°C 5秒58°C 45秒，共40個循環(huán)； 3)結(jié)果分析:根據(jù)信噪情況設定和調(diào)整基線和閾值，通過收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果; 陰性質(zhì)控品應無擴增曲線，陽性質(zhì)控品的3種熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線；若待測樣品中對蝦桿狀病毒的熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為對蝦桿狀病毒陽性，若斑節(jié)對蝦病毒的熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為斑節(jié)對蝦病毒陽性，若肝胰腺細小病毒的熒光Ct值小于35個循環(huán)且呈S型擴增曲線的為肝胰腺細小病毒陽性。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于:所述病毒DNA提取的具體操作為:將預處理的對蝦肝胰腺標本或各期幼體標本先加入10 μ? 20mg/ml蛋白酶K，56°C水浴10分鐘后，再加入50μ?病毒核酸提取液后，上清液即為待檢測DNA樣本。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時檢測BP、MBV、HPV的三色熒光定量PCR聯(lián)合檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明檢測試劑盒含有特異性引物和探針，通過反應體系和條件的優(yōu)化，一次試驗可同時高靈敏、高特異地檢測出BP、MBV和HPV，具有很好的特異性、敏感性和重復性；可特異性地檢測BP、MBV和HPV，與中腸腺壞死桿狀病毒、HPV、WSSV、IHHNV等病毒的不發(fā)生交叉反應；檢測限達103拷貝/μl；重復性較好；本發(fā)明的檢測方法是BP、MBV和HPV病毒快速初篩及初步確認定型的良好方法。
【IPC分類】C12Q1-68, C12Q1-70
【公開號】CN104531896
【申請?zhí)枴緾N201410740793
【發(fā)明人】張曉瑋, 鄧武
【申請人】廣州維伯鑫生物科技有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月4日