專利名稱：基于磁性納米粒子與通用標(biāo)簽技術(shù)的高通量單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用磁性納米粒子作為載體，與通用標(biāo)簽探針相 結(jié)合的基因檢測(cè)技術(shù)，尤其是一種適用于自動(dòng)化、多位點(diǎn)、多樣本、 高通量、低成本的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
隨著人類基因組計(jì)戈U(Human Genome Project, HGP)工作的完成，
基因測(cè)序提供了研究遺傳信息秘密的平臺(tái)，把人類的全基因研究列 入了視野范圍，大大方便了基因家族的研究，基因結(jié)構(gòu)的研究等。 而SNPs標(biāo)記的確立，不僅便利了遺傳病的原因基因的克隆工作，也 便利了單基因、多基因病等各種遺傳病的研究工作。SNPs標(biāo)記對(duì)臨 床醫(yī)學(xué)也有重大意義，SNPs標(biāo)記作為一種有效的遺傳多態(tài)性標(biāo)記物 為臨床醫(yī)學(xué)服務(wù)的，比其它的遺傳標(biāo)記物更能真實(shí)的反映人種、人 群及個(gè)體之間的遺傳差異。
SNP是人類基因組中最常見的變異形式， 一類較為普遍的多態(tài)性 是基因組中散在的單個(gè)堿基的不同，這種不同雖然也含有單個(gè)堿基 的缺失和插入，但更多的是單個(gè)堿基的置換，它在基因組中出現(xiàn)頻 率很高，據(jù)估計(jì)每300-1000個(gè)堿基中即出現(xiàn)一次，分布密度遠(yuǎn)大于 微衛(wèi)星重復(fù)序列等，因而成為目前最常用的第三代遺傳標(biāo)志物。理 論上講，SNP既可能是二等位多態(tài)性，也可能是3個(gè)或4個(gè)等位多 態(tài)性，但實(shí)際上，后兩者非常少見，幾乎可以忽略。因此，通常所 說的SNP都是二等位多態(tài)性的。SNP為數(shù)眾多，分布廣泛等自身的 特性決定了它比其他多態(tài)性標(biāo)記更適合于對(duì)復(fù)雜性狀與疾病關(guān)系的 遺傳解剖和基于群體的基因識(shí)別等方面的研究。因此，對(duì)SNP檢測(cè) 方法的開發(fā)具有時(shí)間上的緊迫性。 隨著對(duì)SNPs研究的廣泛關(guān)注，檢測(cè)技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，出 現(xiàn)了許多SNPs檢測(cè)技術(shù)。目前對(duì)SNPs研究的熱點(diǎn)集中于SNP與復(fù) 雜疾病的易感性研究，SNPs與疾病的關(guān)聯(lián)研究，SNPs與藥物基因 組學(xué)等各方面的研究中，由于有眾多基因和環(huán)境因素的參與，有必 要對(duì)來自不同種群的大量樣本的不同的SNPs位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。因 此，建立一種高通量、低成本且適用于多樣本、多位點(diǎn)的分型方法 是非常必要的。傳統(tǒng)的SNP檢測(cè)方法是采用一些已有的成熟技術(shù)， 如DNA測(cè)序、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)、等位基因特異的 寡聚核苷酸雜交(ASO)等。傳統(tǒng)的RFLP只能檢測(cè)到SNP的一部分， 但必須通過凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)序技術(shù)既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又不易實(shí)現(xiàn) 自動(dòng)化，而且DNA鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)還容易造成人工假象，使測(cè)序結(jié)果 出現(xiàn)偏差，不適宜于SNP的檢測(cè)；通過序列結(jié)構(gòu)不同對(duì)SNP檢測(cè)的 方法(如SSCP等)，則很難滿足自動(dòng)化的需要，難以大規(guī)模開展工作。 而DNA列陣的微測(cè)序法、動(dòng)態(tài)等位基因特異的雜交、寡聚核苷酸特 異的連接以及TaqMan系統(tǒng)等都必須首先進(jìn)行靶序列的擴(kuò)增，然后才 能進(jìn)行其它檢測(cè)，費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，且這些方法難以滿足高通量分型的 要求。
隨著納米技術(shù)的迅速發(fā)展，納米材料逐漸被應(yīng)用到生命科學(xué)領(lǐng) 域，為其研究和發(fā)展提供了新的技術(shù)和手段。由于磁性納米粒子分 離生物分子時(shí)具有分離速度快、效率高、可重復(fù)使用、操作簡(jiǎn)單、 不需要昂貴的儀器以及不影響分離物質(zhì)的活性等特殊的物理化學(xué)性 質(zhì)和生物相容性，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞的分離、免疫測(cè)定、蛋 白質(zhì)和酶的固定以及DNA檢測(cè)等。磁性鈉米粒子在溶液中較好的擴(kuò)散型，高的表面積以及特殊的磁分離性質(zhì)使其作為載體在核酸檢測(cè) 方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景。
基因芯片技術(shù)在高通量的核酸檢測(cè)方面也具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。從 目前已有的報(bào)道來看，高通量SNPs檢測(cè)方法主要集中在綜合利用生 物芯片技術(shù)、多重PCR技術(shù)，通過與各種熒光標(biāo)記的等位基因特異 性探針雜交來實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的高通量檢測(cè)。通過熒光探針雜交方 法進(jìn)行SNPs分型的方法，需要對(duì)每個(gè)SNPs位點(diǎn)設(shè)計(jì)兩條經(jīng)過標(biāo)記的
探針，而經(jīng)過標(biāo)記的探針價(jià)格昂貴，大大增加了對(duì)大量位點(diǎn)分型時(shí) 的成本。
發(fā)明目的
本發(fā)明的目的是為了提供一種利用磁性納米粒子作為載體，并運(yùn) 用帶有通用標(biāo)簽的特異性檢測(cè)探針和經(jīng)標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針對(duì)基因 組中多樣本多位點(diǎn)進(jìn)行高通量SNPs檢測(cè)方法。該方法利用了磁性納 米粒子特殊的理化性質(zhì)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)待檢測(cè)靶序列進(jìn)行純 化、濃縮而導(dǎo)致的成本高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺陷，同時(shí)可以借助核酸 自動(dòng)工作站系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。應(yīng)用通用標(biāo)簽技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)于多 位點(diǎn)的SNPs檢測(cè)只需設(shè)計(jì)一對(duì)標(biāo)記的通用檢測(cè)探針，大大降低了對(duì) 大量樣本進(jìn)行分型檢測(cè)的成本，該方法具有高通量、低成本、快速、 高效等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)
基于磁性納米粒子與通用標(biāo)簽技術(shù)的高通量SNP分型方法，包括 下述步驟
(1) 選取多個(gè)待檢測(cè)的功能SNPS位點(diǎn)。
(2) 針對(duì)步驟(l)中選取的SNPs位點(diǎn)，為每個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)需要設(shè)
計(jì)兩條檢測(cè)探針。檢測(cè)探針的結(jié)構(gòu)為， 一端為與待檢測(cè)靶序列互補(bǔ) 的等位基因特異性互補(bǔ)序列，中間連接若干個(gè)連續(xù)堿基的間隔序列 以減小雜交時(shí)的空間位阻，而探針的另一端連接有通用標(biāo)簽序列。 等位基因特異t互補(bǔ)序列分為野生型和突變型，野生型互補(bǔ)序列與 野生型靶序列完全互補(bǔ)，突變型互補(bǔ)序列與突變型靶序列完全互補(bǔ)， 野生型與突變型互補(bǔ)序列有一個(gè)堿基的不同。通用標(biāo)簽序列分為野 生型和突變型兩種，野生型通用標(biāo)簽對(duì)應(yīng)連接野生型等位基因特異 型探針，突變型通用標(biāo)簽對(duì)應(yīng)連接突變型等位基因特異型探針。同 時(shí)設(shè)計(jì)經(jīng)過標(biāo)記的野生型和突變型通用檢測(cè)探針，野生型通用標(biāo)簽 探針與野生型標(biāo)簽互補(bǔ)，突變型通用標(biāo)簽探針與突變型標(biāo)簽序列完 全互補(bǔ)。野生型和突變型通用標(biāo)簽序列之間無互補(bǔ)，且均與人類基 因組無交叉同源。所有的檢測(cè)探針和通用標(biāo)簽探針經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)去除
了四個(gè)堿基以上的發(fā)夾和回文結(jié)構(gòu)，無交叉同源。
(3) 針對(duì)步驟(l)中對(duì)每個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的選擇 有以下幾種①對(duì)于每個(gè)SNPs位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，其中一 條引物5'端經(jīng)過標(biāo)記。在96或者384孔PCR板中通過PCR擴(kuò)增出 包含有待測(cè)SNPs位點(diǎn)的靶序列；②將經(jīng)過標(biāo)記的下游引物共價(jià)固定 在功能化的磁性納米粒子表面，在96或者384孔PCR板中通過固 相PCR直接擴(kuò)增出包含有待測(cè)SNPs位點(diǎn)的靶序列。
(4) 針對(duì)步驟(3)①中擴(kuò)增的經(jīng)過標(biāo)記的靶序列，加入適量的經(jīng) 過功能化修飾的磁性納米粒子，通過共價(jià)結(jié)合，將擴(kuò)增出的產(chǎn)物固 定在磁性納米粒子上，構(gòu)成磁性納米粒子一DNA復(fù)合物。
(5) 上述步驟(4)磁性納米粒子一DNA復(fù)合物變性、洗滌后與步 驟(2)中的通用標(biāo)簽檢測(cè)探針以及經(jīng)過標(biāo)記的通用檢測(cè)子標(biāo)簽探針雜 交，野生純合型樣本只與野生型標(biāo)簽檢測(cè)探針匹配，然后與標(biāo)記的 野生通用標(biāo)簽探針檢測(cè)子雜交；突變純合型樣本只與突變型標(biāo)簽檢 測(cè)探針匹配，然后與標(biāo)記的突變通用檢測(cè)子標(biāo)簽探針雜交；雜合型 樣本與兩種通用探針均匹配，然后與Cy3、 Cy5兩種標(biāo)記的野生型和
突變型通用標(biāo)簽探針均能雜交。
(6) 將雜交有通用標(biāo)簽探針的磁性納米粒子經(jīng)洗滌、變性、磁分 離后，通過檢測(cè)變性下來探針上的標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的SNPs分 型。
所述步驟(6)中SNP檢測(cè)方法，其中當(dāng)所述的步驟(2)兩條通用標(biāo) 簽探針為雙色熒光標(biāo)記物時(shí)，對(duì)應(yīng)檢測(cè)樣本基因型的方法為雙色熒 光檢測(cè)法，則可實(shí)現(xiàn)樣本的SNPs分型。
所述步驟(2)通用標(biāo)簽探針的標(biāo)記物為發(fā)光酶時(shí)，對(duì)應(yīng)步驟(3)中 一個(gè)樣本的PCR反應(yīng)在兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)管中進(jìn)行，對(duì)應(yīng)步驟(5)中兩 種檢測(cè)探針分別加入到兩管進(jìn)行雜交，對(duì)應(yīng)步驟(6)檢測(cè)樣本基因型 的方法為化學(xué)發(fā)光法。
所述步驟(2)標(biāo)記物為膠體金時(shí)，對(duì)應(yīng)步驟(3)中一個(gè)樣本的PCR 反應(yīng)在兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)管中進(jìn)行，對(duì)應(yīng)步驟(5)中兩種檢測(cè)探針分別 加入到兩管進(jìn)行雜交，對(duì)應(yīng)步驟(6)檢測(cè)樣本基因型的方法為金標(biāo)銀
染法。
所述步驟(3)PCR產(chǎn)物的標(biāo)記物為生物素時(shí)，對(duì)應(yīng)功能化的磁性
納米粒子表面修飾為親合素。
所述步驟(3)PCR產(chǎn)物的標(biāo)記物為氨基基團(tuán)時(shí)，對(duì)應(yīng)功能化的磁 性納米粒子表面修飾為醛基基團(tuán)。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、 本發(fā)明使用了磁性納米粒子作為雜交靶序列載體，克服了現(xiàn) 有技術(shù)中對(duì)待檢測(cè)靶序列進(jìn)行純化、濃縮而導(dǎo)致的成本高、費(fèi)時(shí)、 費(fèi)i等缺陷。
2、 在對(duì)于多個(gè)SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)時(shí)，只需設(shè)計(jì)一對(duì)經(jīng)過標(biāo)記的通 用標(biāo)簽探針，大大降低了多位點(diǎn)分型時(shí)的成本，且沒有增加任何分 型步驟。
3、本發(fā)明中通過使用磁性納米粒子作為反應(yīng)載體，在整個(gè)分型 步驟都可以在96或384孔板中利用核酸自動(dòng)化工作站實(shí)現(xiàn)自動(dòng)操 作，對(duì)于樣本的分型信號(hào)能夠借助芯片法實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，因此最終能夠 實(shí)現(xiàn)對(duì)大量樣本的高通量自動(dòng)化檢測(cè)。


圖1為實(shí)施方案的流程圖。
圖中標(biāo)號(hào)說明如下
1為功能化(如鏈霉親合素、醛基)的磁性納米粒子，2為標(biāo)記(如
生物素、氨基)的PCR產(chǎn)物(可以為常規(guī)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，也可以是 基于磁性納米粒子表面固相擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物)，3為標(biāo)記的野生通用 標(biāo)簽探針(發(fā)光酶、膠體金或者熒光標(biāo)記)，4為野生型檢測(cè)探針，5 為標(biāo)記的突變通用標(biāo)簽探針(發(fā)光酶、膠體金或者熒光標(biāo)記)，6為突 變型檢測(cè)探針。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施方案I:
本發(fā)明涉及一種利用磁性納米粒子為載體以及通用標(biāo)簽技術(shù)進(jìn)
行高通量SNPS分型的方法。具體如下1、選取若干重要的功能SNP 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物(其中一側(cè)引物為生物素標(biāo)記)、 一對(duì)野生及突 變型檢測(cè)探針4、 6(序列包括與耙序列互補(bǔ)的等位基因特異性序列， 中間連接11個(gè)堿基的Poly T間隔序列以及與通用標(biāo)簽序列)以及一對(duì) 帶有標(biāo)記物的(熒光、納米金、發(fā)光酶)通用標(biāo)簽檢測(cè)探針3、 5(通用 檢測(cè)探針長(zhǎng)度在13個(gè)堿基左右，與檢測(cè)探針的通用標(biāo)簽序列互補(bǔ))。 2、通過PCR擴(kuò)增出包含有待測(cè)SNPs位點(diǎn)的生物素標(biāo)記的靶序列， 生物素標(biāo)記的靶序列可以是常規(guī)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，也可以是在磁性 納米粒子表面固相擴(kuò)增PCR的產(chǎn)物。3、如果生物素標(biāo)記的靶序列2 為常規(guī)擴(kuò)增產(chǎn)物，則需要將適量的鏈親合素標(biāo)記的磁性納米粒子1加 入PCR產(chǎn)物中孵浴、洗滌后，雙鏈PCR產(chǎn)物固定在磁性納米粒子表 面；如果生物素標(biāo)記的耙序列2為基于磁性納米粒子固相擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物則只需要充分洗滌。4、經(jīng)過95°C變性、驟冷后，磁性粒子表 面的雙鏈PCR產(chǎn)物變?yōu)閱?，?gòu)成磁性納米粒子-ssDNA復(fù)合體。5、 將磁性納米粒子一ssDNA復(fù)合體平均分到兩個(gè)獨(dú)立的PCR管中，每 管中磁性納米粒子一DNA復(fù)合體分別與野生、突變檢測(cè)探針以及一 對(duì)標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針進(jìn)行雜交。通過控制雜交溫度，使野生型樣本 只與野生型檢測(cè)探針雜交，然后與標(biāo)記的野生通用標(biāo)簽探針雜交；突 變型樣本只與突變檢測(cè)探針雜交，然后與標(biāo)記的突變通用標(biāo)簽探針雜 交；雜合型樣本與兩種檢測(cè)探針均能雜交，然有與兩種通用標(biāo)簽檢測(cè) 雜交。洗滌后，將磁性粒子均勻分散到3XSS.C緩沖液中。6、變性， 磁分離后，磁性納米粒子被磁富集在反應(yīng)管底部，溶液的上清液中含 有變性下來的檢測(cè)探針。7、通過熒光檢測(cè)、銀染法或者化學(xué)發(fā)光法 對(duì)變性下來的探針進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分型。
實(shí)施方案n-
具體如下1、選取若干重要的功能SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物
(其中一側(cè)引物經(jīng)過標(biāo)記)、 一對(duì)野生及突變型檢測(cè)探針4、 6(序列包 括與耙序列互補(bǔ)的等位基因特異性序列，中間連接ll個(gè)堿基的Poly T 間隔序列以及與通用標(biāo)簽序列)以及 一 對(duì)雙色熒光標(biāo)記的(野生型 Cy3，突變型Cy5)通用標(biāo)簽檢測(cè)探針3、 5(通用檢測(cè)探針長(zhǎng)度在13個(gè)
堿基左右，與檢測(cè)探針的通用標(biāo)簽標(biāo)簽序列互補(bǔ))。2、通過PCR擴(kuò) 增出包含有待測(cè)SNPs位點(diǎn)的經(jīng)標(biāo)記的靶序列，標(biāo)記的靶序列可以是 常規(guī)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，也可以是在磁性納米粒子表面固相擴(kuò)增PCR 的產(chǎn)物。3、如果標(biāo)記的靶序列2為常規(guī)擴(kuò)增產(chǎn)物，則需要將適量的 功能化的磁性納米粒子1加入PCR產(chǎn)物中，通過共價(jià)結(jié)合將PCR產(chǎn) 物固定在磁性納米粒子表面；如果經(jīng)過標(biāo)記的靶序列2為基于磁性納 米粒子固相擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物則只需要充分洗滌。4、經(jīng)過95°C變性、 驟冷后，磁性粒子表面的雙鏈PCR產(chǎn)物變?yōu)閱?，?gòu)成磁性納米粒子 一ssDNA復(fù)合體。5、將反應(yīng)管中磁性納米粒子一DNA復(fù)合體分別與 野生、突變型檢測(cè)探針以及雙色熒光標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針進(jìn)行雜交。 通過控制雜交溫度，使野生型樣本只與野生型檢測(cè)探針雜交，然后與 標(biāo)記的野生通用標(biāo)簽探針雜交；突變型樣本只與突變檢測(cè)探針雜交， 然后與標(biāo)記的突變通用標(biāo)簽探針雜交；雜合型樣本與兩種檢測(cè)探針均 能雜交，然有與兩種通用標(biāo)簽檢測(cè)雜交。洗滌后，將磁性粒子均勻分 散到3XSSC緩沖液中。6、變性，磁分離后，磁性納米粒子被磁富 集在反應(yīng)管底部，溶液的上清液中含有變性下來的檢測(cè)探針。7、通 過檢測(cè)兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分型。
權(quán)利要求
1、一種基于磁性納米粒子與通用標(biāo)簽技術(shù)的高通量單核苷酸多態(tài)性分型方法，包括下述步驟(a)選取多個(gè)待檢測(cè)功能SNP位點(diǎn)。
對(duì)于每一個(gè)SNP位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物(其中一條5’端經(jīng)過標(biāo)記)以及兩條野生、突變通用標(biāo)簽探針，標(biāo)記的通用檢測(cè)子一對(duì)(發(fā)光酶、膠體金或者熒光標(biāo)記)。(b)針對(duì)步驟(a)中選取的SNPs位點(diǎn)，為每個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)需要設(shè)計(jì)兩條檢測(cè)探針。檢測(cè)探針的結(jié)構(gòu)為，一端為與待檢測(cè)靶序列互補(bǔ)的等位基因特異性互補(bǔ)序列，中間連接若干個(gè)連續(xù)堿基的間隔序列以減小雜交時(shí)的空間位阻，而探針的另一端連接有通用標(biāo)簽序列。等位基因特異型互補(bǔ)序列分為野生型和突變型，野生型互補(bǔ)序列與野生型靶序列完全互補(bǔ)，突變型互補(bǔ)序列與突變型靶序列完全互補(bǔ)，野生型與突變型互補(bǔ)序列有一個(gè)堿基的不同。通用標(biāo)簽序列分為野生型和突變型兩種，野生型通用標(biāo)簽對(duì)應(yīng)連接野生型等位基因特異型探針，突變型通用標(biāo)簽對(duì)應(yīng)連接突變型等位基因特異型探針。同時(shí)設(shè)計(jì)經(jīng)過標(biāo)記的野生型和突變型通用檢測(cè)探針，野生型通用標(biāo)簽探針與野生型標(biāo)簽互補(bǔ)，突變型通用標(biāo)簽探針與突變型標(biāo)簽序列完全互補(bǔ)。野生型和突變型通用標(biāo)簽序列之間無互補(bǔ)，且均與人類基因組無交叉同源。(c)待檢測(cè)的靶序列可以通過兩種方法獲得①利用常規(guī)PCR的方法擴(kuò)增出標(biāo)記的PCR產(chǎn)物；②將一端標(biāo)記的引物固定在表面功能化的磁性納米粒子上，通過固相PCR擴(kuò)增，直接在磁性納米粒子表面擴(kuò)增出包含有待測(cè)SNP位點(diǎn)的靶序列，構(gòu)成磁性納米粒子-DNA復(fù)合物。(d)磁性納米粒子-DNA復(fù)合物變性后，與檢測(cè)探針以及標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針雜交。通過控制雜交溫度，使野生型樣本只與野生型通用標(biāo)簽探針雜交，然后與標(biāo)記的野生通用標(biāo)簽探針雜交；突變型樣本只與突變檢測(cè)探針雜交，然后與標(biāo)記的突變通用標(biāo)簽探針雜交；雜合型樣本與兩檢測(cè)探針均能雜交，然有與兩種通用標(biāo)簽探針雜交。(e)將雜交有檢測(cè)探針的磁性納米粒子經(jīng)洗滌、變性、磁分離后，通過檢測(cè)變性下來通用標(biāo)簽探針上的標(biāo)記物來實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本的SNPs分型。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分型方法，對(duì)每個(gè)SNPs位點(diǎn)的檢測(cè)， 其特征在于設(shè)計(jì)包含有等位基因特異性序列、間隔序列和通用標(biāo)簽序 列的檢測(cè)探針，以及經(jīng)過標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針，對(duì)多個(gè)SNPs位點(diǎn)檢 測(cè)時(shí)所需要的檢測(cè)探針不同，而所用的經(jīng)過標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針相 同。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的SNP分型方法，其特征在用于SNPs 分型檢測(cè)的野生型和突變型通用標(biāo)簽探針，可以選擇不同的標(biāo)記物， 如納米金、化學(xué)發(fā)光物、熒光標(biāo)記物等。當(dāng)選擇熒光標(biāo)記物時(shí)，可以 使用同種熒光標(biāo)記，也可以使用雙色熒光標(biāo)記。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的SNPs分型方法，其特征在于所述步 驟中靶序列可以是常規(guī)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物也可以是將在一條引物固定 在的磁性納米粒子上，通過PCR直接在磁性納米粒子表面擴(kuò)增出來 的。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3所述的SNPs分型方法，其特征在于 所述步驟(b)中標(biāo)記引物的方法可以是生物素或者氨基，修飾磁性納 米粒子的標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)是親合素、醛基，通過生物素—親合素或氨基 一醛基之間的共價(jià)結(jié)合，將引物固定在磁性納米粒子上。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 4、 5所述的SNP分型方法，其特征 在于所述的磁性納米粒子一DNA復(fù)合物與檢測(cè)探針以及標(biāo)記的通用 標(biāo)簽探針在液相體系中完成雜交。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1、 2、 3、 4、 5、 6所述的SNP分型方法，其 特征在于所述步驟(d)中檢變性下來的探針上的標(biāo)記物的方法，根據(jù) 標(biāo)記物的不同對(duì)應(yīng)選擇選熒光檢測(cè)法、化學(xué)發(fā)光法、銀染法中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用磁性納米粒子作為載體以及與通用標(biāo)簽探針技術(shù)相結(jié)合，針對(duì)基因組中單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行多樣本多位點(diǎn)分型的方法。其特征在于通過標(biāo)記物之間的共價(jià)結(jié)合，直接將標(biāo)記的PCR產(chǎn)物固定在磁性納米粒子上，或者將標(biāo)記的引物固定在磁性納米粒子上直接進(jìn)行固相PCR擴(kuò)增，構(gòu)成磁性納米粒子-DNA復(fù)合體(MNPs-ssDNA)。然后通過MNPs-ssDNA與對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)探針以及標(biāo)記的通用標(biāo)簽探針雜交，從而實(shí)現(xiàn)多樣本多位點(diǎn)的高通量SNP檢測(cè)。該方法最大的優(yōu)勢(shì)是利用通用標(biāo)簽技術(shù)實(shí)現(xiàn)了多位點(diǎn)分型時(shí)只需要一對(duì)經(jīng)過標(biāo)記的探針，大大降低了分型成本，同時(shí)利用了磁性納米粒子易于分離等優(yōu)點(diǎn)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)待檢測(cè)靶序列進(jìn)行純化、濃縮而導(dǎo)致的成本高、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺陷，從而使該方法具有簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確地對(duì)大量樣品進(jìn)行分型的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101205560SQ20071019245
公開日2008年6月25日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 劉洪娜, 松 李, 嵐 田 申請(qǐng)人:李 松;何農(nóng)躍