本發(fā)明涉及一種植物種子休眠相關(guān)的rve1蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：種子休眠是指種子在適宜的條件下不能萌發(fā)的現(xiàn)象。休眠是種子植物的一種適應(yīng)機(jī)制，是種子植物長期進(jìn)化的結(jié)果，對于其自身發(fā)展和種族延續(xù)都起著至關(guān)重要的作用。種子休眠是在種子成熟過程中逐漸建立起來的，其程度受多種外界環(huán)境因素和自身因素的影響。其中g(shù)a和aba是一對在調(diào)控種子萌發(fā)和休眠方面起拮抗功能的激素：aba促進(jìn)種子休眠、抑制種子萌發(fā)，而ga抑制種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)。除了激素依賴的途徑外，組蛋白甲基化、乙酰化等引起的染色質(zhì)重塑、小干擾rna、長的非編碼rna以及其他功能未知的因子(如dog1)也參與種子休眠的調(diào)控。處于休眠狀態(tài)的種子必須經(jīng)過長時(shí)間儲存(即后熟作用)、或低溫處理打破休眠，種子才能夠正常的萌發(fā)，從而避免了胎萌和穗發(fā)芽現(xiàn)象的發(fā)生。所以種子休眠現(xiàn)象在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上也具有重要的意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物種子休眠相關(guān)的rve1蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼rve1蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下(a1)或(a2)中的至少一種表型：(a1)種子萌發(fā)率低于所述出發(fā)植物；(a2)種子休眠程度高于所述出發(fā)植物。所述rve1蛋白是如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與調(diào)控種子休眠與萌發(fā)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。所述“編碼rve1蛋白的基因”為如下(1)或(2)或(3)或(4)：(1)其編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的dna分子；(2)序列表中序列2所示的dna分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的dna序列雜交且編碼具有調(diào)控種子休眠與萌發(fā)功能的蛋白質(zhì)的dna分子；(4)與(1)或(2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼具有調(diào)控種子休 眠與萌發(fā)功能的蛋白質(zhì)的dna分子。所述方法中，所述編碼rve1蛋白的基因可以通過重組表達(dá)載體導(dǎo)入出發(fā)植物。所述重組表達(dá)載體可通過ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述方法中，所述“種子萌發(fā)率低于所述出發(fā)植物”指的是“低溫破除休眠前種子萌發(fā)率低于所述出發(fā)植物”。所述“低溫破除休眠”的方法具體可為“4℃放置72小時(shí)”。本發(fā)明還保護(hù)一種蛋白質(zhì)，獲自擬南芥，命名為rve1蛋白，是如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b2)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與調(diào)控種子休眠與萌發(fā)相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(b1)中的rve1蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列poly-arg5-6(通常為5個(gè))rrrrrpoly-his2-10(通常為6個(gè))hhhhhhflag8dykddddkstrep-tagii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl上述(b2)中的rve1蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b2)中的rve1蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的dna序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述rve1蛋白的基因(rve1基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)的dna分子：(1)其編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第1-1161位核苷酸所示的dna分子；(2)序列表中序列2所示的dna分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的dna序列雜交且編碼調(diào)控種子休眠與萌 發(fā)功能的蛋白質(zhì)的dna分子；(4)與(1)或(2)限定的dna序列具有90％以上同源性且編碼具有調(diào)控種子休眠與萌發(fā)功能的蛋白質(zhì)的dna分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有所述rve1基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體具體可為將雙元載體pri101an-6myc的ecori和sali酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列1的自5′端第1-1161位核苷酸所示的dna分子得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)所述rve1蛋白或其編碼基因的應(yīng)用，為如下(c1)至(c5)中的至少一種：(c1)調(diào)控植物種子萌發(fā)；(c2)抑制植物種子萌發(fā)；(c3)降低植物種子的萌發(fā)率；(c4)調(diào)控植物種子休眠；(c5)促進(jìn)植物種子休眠；所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述應(yīng)用中，所述“抑制植物種子萌發(fā)”指的是“抑制植物種子低溫破除休眠前的萌發(fā)”。所述“低溫破除休眠”的方法具體可為“4℃放置72小時(shí)”。本發(fā)明還保護(hù)所述rve1蛋白、所述rve1基因、所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、所述重組菌或以上任一所述方法在植物育種中的應(yīng)用。所述育種的目的為培育種子萌發(fā)率低和/或種子休眠程度高的植物。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述種子萌發(fā)率低指的是“低溫破除休眠前種子萌發(fā)率低”。所述“低溫破除休眠”的方法具體可為“4℃放置72小時(shí)”。本發(fā)明從擬南芥中獲得一個(gè)調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā)的基因rve1，其編碼的蛋白可以 調(diào)控種子的萌發(fā)過程和種子的休眠程度，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要的意義。附圖說明圖1為各株系種子萌發(fā)情況觀察及統(tǒng)計(jì)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。雙元載體pri101an-6myc：參考文獻(xiàn)：xug，guoh，zhangd，etal.reveille1promotesnadph：protochlorophyllideoxidoreductaseaexpressionandseedlinggreeninginarabidopsis[j].photosynthesisresearch，2015，126(2-3)：1-10.；公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所獲得。根癌農(nóng)桿菌gv3101：參考文獻(xiàn)：cloughsj，bentaf.floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.[j].plantjournal，1998，16(6)：735-743.；公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所獲得。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥：參考文獻(xiàn)：swarupk，alonso-blancoc，lynnjr，michaelssd，amasinorm，koornneefm，millaraj.naturalallelicvariationidentifiesnewgenesinthearabidopsiscircadiansystem.plantjournal.1999，20(1)：67-77.；公眾可以從中國科學(xué)院植物研究所獲得。rve1功能缺失突變植株：以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥為出發(fā)植株，使用t-dna插入的方法得到的突變植株；經(jīng)測序驗(yàn)證，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比該突變植株的區(qū)別僅在于在序列表的序列2所示rve1基因中插入了t-dna從而引起了rve1基因失活。實(shí)施例1、rve1蛋白及其編碼基因的獲得提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的總rna，并反轉(zhuǎn)錄為cdna。經(jīng)過大量序列分析、表達(dá)量分析與功能驗(yàn)證，從cdna中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)dna編碼序列，如序列表的序列2所示，其編碼的蛋白質(zhì)如序列表的序列1所示。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為rve1蛋白，由387個(gè)氨基酸殘基組成。將編碼rve1蛋白的基因命名為rve1基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。實(shí)施例2、重組表達(dá)載體構(gòu)建1、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna為模板，采用f 和r組成的引物對進(jìn)行pcr擴(kuò)增，回收pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。f：5’-gaattcatggcgtcgtctccgttgactg-3’；r：5’-gtcgactaagtggagatgaatctcatgc-3’。f和r中，下劃線分別標(biāo)注ecori和sali酶切位點(diǎn)。2、用限制性內(nèi)切酶ecori和sali雙酶切步驟1的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶ecori和sali雙酶切雙元載體pri101an-6myc，回收約10.4kb的載體骨架。4、將步驟2得到的酶切產(chǎn)物和步驟3得到的載體骨架連接，得到重組表達(dá)載體pri101-rve1-6myc。根據(jù)測序結(jié)果，對重組表達(dá)載體pri101-rve1-6myc進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將雙元載體pri101an-6myc載體的ecori和sali酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列1的自5′端第1-1161位核苷酸所示的雙鏈dna分子。實(shí)施例3、rve1蛋白的功能驗(yàn)證一、培育轉(zhuǎn)基因植物1、將重組表達(dá)載體pri101-rve1-6myc導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌gv3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用花芽浸泡法(cloughandbent，floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantjournal1998，16：735-743.)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，收獲t1代種子。t2代表示t1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，t3代表示t2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。在含50mg/l卡那霉素的ms固體培養(yǎng)基平板上篩選t1代植株并進(jìn)行t2代和t3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在t3代得到單拷貝插入的純合轉(zhuǎn)rve1基因擬南芥株系。3、將雙元載體pri101an-6myc導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株gv3101，得到重組農(nóng)桿菌。4、采用花芽浸泡法(cloughandbent，floraldip：asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantjournal1998，16：735-743.)，用步驟3得到的重組農(nóng)桿菌哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，收獲t1代種子。t2代表示t1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，t3代表示t2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。在含50mg/l卡那霉素的ms固體培養(yǎng)基平板上篩選t1代植株并進(jìn)行t2代和t3代的分離比統(tǒng)計(jì)，在t3代得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥株系。二、表型檢測待測植物分別為：哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(col)、rve1功能缺失突變植株(rve1-2)、純合轉(zhuǎn)rve1基因擬南芥株系的t3代植株(rve1-oe)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥株系的t3代植株。(1)將待測植株的種子用1％次氯酸鈉消毒5min，用無菌水洗五次。(2)完成步驟(1)后，將種子播種在0.6％agar(ph5.7)上，在23℃、長日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下培養(yǎng)5天，觀察種子萌發(fā)情況并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。(3)完成步驟(1)后，將種子播種在0.6％agar(ph5.7)培養(yǎng)基上，在23℃、黑暗條件(24小時(shí)黑暗)培養(yǎng)5天，觀察種子萌發(fā)情況并統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率。進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，每次重復(fù)試驗(yàn)中每個(gè)株系100粒種子，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖1所示。圖1a為步驟(2)或步驟(3)中培養(yǎng)5天后種子萌發(fā)表型觀察結(jié)果，圖1b為步驟(2)中日照條件下培養(yǎng)5天后種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果，圖1c為步驟(3)中黑暗條件下培養(yǎng)5天后種子萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。結(jié)果表明，在長日照和黑暗條件下，轉(zhuǎn)rve1基因擬南芥的萌發(fā)率均顯著低于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，幾乎全不萌發(fā)，在黑暗條件下，rve1功能缺失突變植株的萌發(fā)率顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子萌發(fā)率與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥無顯著差異。說明rve1在調(diào)控種子休眠方面起著非常重要的作用。(4)完成步驟(2)或步驟(3)后，將未萌發(fā)的種子4℃放置72小時(shí)(目的是打破休眠)，然后再次置于在0.6％agar(ph5.7)上，23℃、長日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下培養(yǎng)5天，均正常萌發(fā)。因此rve1過表達(dá)可以增強(qiáng)種子休眠，但不影響在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的種子萌發(fā)。當(dāng)前第1頁12