本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

工業(yè)微生物生產(chǎn)通常需要對菌株的基因組進(jìn)行改造來改進(jìn)其生產(chǎn)性能。例如，通過基因敲除、敲入或者替換經(jīng)的方法修飾代謝通路或者改造基因調(diào)控原件經(jīng)?？梢蕴岣吣繕?biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量。在大腸桿菌，釀酒酵母或者枯草芽孢桿菌中進(jìn)行遺傳操作，為了篩選到重組子，需要篩選標(biāo)記的幫助。為了實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的優(yōu)良性狀，經(jīng)常需要對多個基因進(jìn)行順序的操作，因此在一個基因編輯結(jié)束后，將篩選標(biāo)記從基因組上移除，從而重復(fù)的利用一個標(biāo)記進(jìn)行多位點(diǎn)的操作就十分必要。

為了將正篩選標(biāo)記從基因組上移除，利用位點(diǎn)特異性重組是最常用的方法。常用的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包括cre/loxp系統(tǒng)、xis/attp系統(tǒng)和flp/frt系統(tǒng)。位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)可以高效的將一段序列高效的從基因組上消除，在大腸桿菌中甚至不需要負(fù)篩選編輯就可以獲得消除菌株。然而這類方法的一個缺點(diǎn)是會在基因組上留下一個重組位點(diǎn)的疤痕，這個疤痕經(jīng)常會對基因的表達(dá)造成影響。

為了實(shí)現(xiàn)無痕的基因組編輯，可以將一個負(fù)篩選標(biāo)記與正篩選編輯連在一起，通過第二次重組將標(biāo)記從基因組上移除。負(fù)篩選標(biāo)記在特定條件下表達(dá)可以將菌株殺死，例如毒性基因就是一類常用的負(fù)篩選標(biāo)記。在完成一輪基因組編輯之后，誘導(dǎo)毒性基因的表達(dá)，可以幫助篩選到消除標(biāo)記的菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題：使用毒性基因進(jìn)行基因組編輯的一個缺點(diǎn)是，其克隆通常比較困難，例如mazf基因是枯草芽孢桿菌中的一種常用的負(fù)篩選標(biāo)記，但是據(jù)報道，它在大腸桿菌中的克隆比較困難，通常需要特定的載體才可以完成，增加了克隆的成本和難度。另外一些研究使用融合pcr的方法構(gòu)建基因編輯模板，但是一般需要多輪的pcr過程才可以獲得一個編輯模板，因此增加了pcr過程中引入突變的概率，也使構(gòu)建過程更加的不穩(wěn)定。

本發(fā)明的目的在于針對以上技術(shù)問題提供一種構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法，本發(fā)明要要解決的技術(shù)問題是，提供一種構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法，使含有毒性基因(例如mazf基因)的編輯模板的構(gòu)建更加快速方便。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法，包括以下步驟：

(1)將毒性基因從中間分成兩部分，然后將前半部分毒性基因和后半部分毒性基因分別克隆入克隆載體，并將前半部分毒性基因與一個正篩選標(biāo)記相結(jié)合，兩部分毒性基因均加入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和相匹配的粘性末端；

(2)將上下游同源臂分別克隆入克隆載體，并且在上同源臂的下游和下同源臂的上游加正向重復(fù)片段、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和相匹配的粘性末端；

(3)將步驟(1)制備的含有前半部分毒性基因的載體質(zhì)粒、含有后半部分毒性基因的載體質(zhì)粒和步驟(2)制備的分別含有上下游同源臂的載體質(zhì)?；旌显谝黄?，利用金門組裝反應(yīng)將兩部分毒性基因片段和上下游同源臂共四個片段拼接在一起；

(4)將拼接產(chǎn)物做為pcr模板，擴(kuò)增基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的全長。

本發(fā)明方法中所述的毒性基因?yàn)閙azf毒性基因，但不限于mazf毒性基因，對其他毒性基因的克隆也適用。

本發(fā)明方法中所述的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為bsai酶切位點(diǎn)或typeiis酶切位點(diǎn)，但不限于上述酶切位點(diǎn)。

本發(fā)明方法中所述的正篩選標(biāo)記為cat抗性基因、amp抗性基因或em抗性基因，但不限于上述的抗性基因。

上述的構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法，其所述的克隆載體為puc57載體。

上述的構(gòu)建基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的方法，具體包括以下步驟：

(1)將毒性基因mazf分成兩部分mazf1和mazf2，然后將mazf1和mazf2分別克隆入克隆載體puc57，并將mazf1與氯霉素抗性基因cat相結(jié)合，兩部分毒性基因均加入了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和相匹配的粘性末端，構(gòu)建了載體質(zhì)粒puc57-cat-mazf1和puc57-mazf2；

(2)將上下游同源臂分別克隆在puc57的載體上，并在上同源臂的下游和下同源臂的上游加正向重復(fù)片段、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和相匹配的粘性末端；

(3)將步驟(1)制備的puc57-cat-mazf1和puc57-mazf2以及步驟(2)制備的分別含有上下游同源臂的載體質(zhì)?；旌显谝黄?，利用金門組裝反應(yīng)將上下游同源臂、cat-mazf1片段和mazf2片段拼接在一起；

(4)將拼接產(chǎn)物做為pcr模板，擴(kuò)增基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板的全長。

上述方法構(gòu)建的基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板在無痕基因敲除中的應(yīng)用。

上述的應(yīng)用，其在于將基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板轉(zhuǎn)化入菌株中，實(shí)現(xiàn)了與正篩選標(biāo)記相結(jié)合的毒性基因的染色體整合，之后利用毒性基因的毒性將與正篩選標(biāo)記相結(jié)合的毒性基因標(biāo)記從基因組上移除，從而實(shí)現(xiàn)無痕的基因敲除。

為了方便毒性基因的擴(kuò)增，本發(fā)明將毒性基因從中間分成兩部分，從而使每一部分都不具有毒性，兩部分毒性基因的長短沒有嚴(yán)格的限制。具體的，將mazf基因從atg起始密碼子開始的前79bp作為前半部分mazf1；之后的序列作為后半部分mazf2。本發(fā)明測試了mazf基因的克隆，發(fā)現(xiàn)完整的mazf基因無法連接在傳統(tǒng)的克隆載體(如puc57)中。但是分成兩部分之后，mazf基因能夠克隆在傳統(tǒng)的克隆載體(如puc57)中。其中mazf的前半部分mazf1可以與一個正篩選標(biāo)記(如氯霉素抗性基因cat)相結(jié)合，方便進(jìn)行正篩選。

為了方便克隆，本發(fā)明同時構(gòu)建了輔助載體puc57-cat-mazf1和puc57-mazf2。其中在cat-mazf1部分和mazf2部分均加入了bsai的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和相匹配的粘性末端，從而使兩部分和上下游同源臂四個片段進(jìn)行一步拼接。具體的，在cat-mazf1的5’端添加了“ggtctcaatcc”；在cat-mazf1的3’端添加了“gctgagagacc”；在mazf2的5’端添加了“ggtctcagctg”；在cat-mazf2的3’端添加了“tacaagagacc”。

本發(fā)明還提供了上述方法構(gòu)建的正負(fù)篩選標(biāo)記模板的用途。將編輯模板轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌168菌株中，實(shí)現(xiàn)了cat-mazf的染色體整合。之后利用mazf的毒性將cat-mazf標(biāo)記從基因組上移除，從而實(shí)現(xiàn)了無痕的基因敲除。本發(fā)明測試了amye、hisz和upp基因的敲除。

本發(fā)明所述的金門組裝反應(yīng)為金門克隆反應(yīng)golden-gatecloning。

本發(fā)明的有益效果：

僅需要一個金門組裝反應(yīng)和一個pcr反應(yīng)就可以擴(kuò)增出可以直接轉(zhuǎn)化的正負(fù)篩選標(biāo)記模板。避免了克隆毒性基因的困難和多重pcr過程引入的突變和造成的不便。

附圖說明

圖1為基因組編輯正負(fù)篩選標(biāo)記模板構(gòu)建流程圖

圖2為hisz基因敲除編輯模板pcr擴(kuò)增電泳圖

圖3為hisz基因敲除cat-mazf基因組整合驗(yàn)證電泳圖

圖4為hisz基因敲除cat-mazf基因組消除驗(yàn)證電泳圖

圖5為upp基因敲除編輯模板pcr擴(kuò)增電泳圖

圖6為amye基因敲除編輯模板pcr擴(kuò)增電泳圖

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1puc57-cat-mazf1和puc57-mazf2通過基因合成獲得。

具體的，cat-mazf1以及mazf2片段均通過基因合成后，克隆進(jìn)入ecorv單酶切的puc57載體中；經(jīng)測序驗(yàn)證正確后使用。

這兩個合成的載體中，cat基因的序列來自pc194的載體[1]。mazf基因的序列來自大腸桿菌的基因組序列(http://ecocyc.org/)。mazf基因的啟動子pxyla來自bacillussubtilist30的基因組序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/772681982)。

另外，在cat-mazf1的5’端添加了“ggtctcaatcc”；在cat-mazf1的3’端添加了“gctgagagacc”；在mazf2的5’端添加了“ggtctcagctg”；在cat-mazf2的3’端添加了“tacaagagacc”。

實(shí)施例2：枯草芽孢桿菌hisz基因的敲除

使用如下引物擴(kuò)增枯草芽孢桿菌的基因組：

hisz-up-f：tttcgtctctaacgggtctcaccctggttacgtccatcggcttcgctaat(seqidno.1)

hisz-up-r：cttcgtctcgtcggggtctcaggattcgtctggtccattattgatttgataaacgtgtccgcctggatctgaatatggtc(seqidno.2)

hisz-dn-f：tttcgtctctaacgggtctcatacacgtttatcaaatcaataatggaccagacgatgtcttgccgtcctgatcaagtagc(seqidno.3)

hisz-dn-r：cttcgtctcgtcggggtctcacgtttcgcagctgagtctgtatcgctatc(seqidno.4)

pcr反應(yīng)體系為：10xpbobuffer5μl,10mmdntps0.8μl、上游引物1μl、下游引物1μl、模板dna1μl、pbodnapolymerase1μl、無菌水至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s,55℃退火15s,72℃延伸30s，30個循環(huán)；最后72℃延伸反應(yīng)10min。

將擴(kuò)增的上同源臂和下同源臂片段切膠回收后通過平末端連接克隆進(jìn)入ecorv酶切的puc57的載體中。轉(zhuǎn)化進(jìn)入dh5alpha細(xì)胞中挑選轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒，獲得hisz基因敲除的上游和下游同源臂。

將含有上下游同源臂的載體質(zhì)粒與實(shí)施例1獲得的puc57-cat-mazf1質(zhì)粒和puc57-mazf2質(zhì)?；旌显谝黄?，配置如下的反應(yīng)體系：上下游同源臂載體質(zhì)粒、puc57-cat-mazf1質(zhì)粒和puc57-mazf2各1μl、t4dnaligasebuffer(neb)2μl、bsai(neb)1μl、t4dnaligase(neb)1μl、無菌水至20μl。反應(yīng)程序?yàn)椋簊tep1：37℃5min；step2：16℃5min；step1-step210個循環(huán)。step350℃,step480℃，完成金門組裝。

將上述反應(yīng)液中取出2μl作為pcr模板，以hisz-up-f和hisz-dn-r作為pcr引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10xpbobuffer5μl,10mmdntps0.8μl、50pmol上游引物1μl、50pmol下游引物1μl、模板dna5μl、pbodnapolymerase1μl、無菌水至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s,55℃退火15s,72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸反應(yīng)10min。

反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，如圖2，編輯模板的長度為2.7kb。

上述pcr反應(yīng)的終產(chǎn)物切膠回收，制得編輯模板。

將上述編輯模板轉(zhuǎn)化進(jìn)入枯草芽孢桿菌168菌株中。菌液涂布在含有氯霉素的lb培養(yǎng)基上篩選重組子。

對氯霉素平板上長出的平板進(jìn)行菌落pcr驗(yàn)證。以hisz-up-f和hisz-dn-r為引物，反應(yīng)體系為：10xpbobuffer5μl,10mmdntps0.8μl、50pmol上游引物1μl、50pmol下游引物1μl、單菌落一個、pbodnapolymerase1μl、無菌水至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s,55℃退火15s,72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸反應(yīng)10min。

從圖3中可見。野生對照菌株擴(kuò)增到1743bp的目的條帶。擴(kuò)增出2.7kp條帶的為重組菌株。在圖3中，條帶1-9為氯霉素平板上長出的克隆擴(kuò)增出的條帶；條帶wt為野生型菌株擴(kuò)增出的條帶。條帶c為編輯模板擴(kuò)增出的條帶。

將上述重組菌株的單菌落無抗生素的4mllb液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)16-24小時。之后取100μl涂布于1％木糖lb平板，37℃培養(yǎng)8-16小時。

對上述平板上長出的菌落進(jìn)行pcr驗(yàn)證。以hisz-up-f和hisz-dn-r為引物，反應(yīng)體系為：10xpbobuffer5μl,10mmdntps0.8μl、50pmol上游引物1μl、50pmol下游引物1μl、單菌落一個、pbodnapolymerase1μl、無菌水至50μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性15s,55℃退火15s,72℃延伸2min，30個循環(huán)；最后72℃延伸反應(yīng)10min。

從圖4中可見。擴(kuò)增出1.1kb條帶的為重組菌株。

在圖4中，條帶1-16為木糖lb平板上長出的克隆擴(kuò)增出的條帶；條帶wt為野生型菌株擴(kuò)增出的條帶。條帶c為整合了cat-mazf的菌株增出的條帶。

實(shí)施例3：枯草芽孢桿菌upp基因的敲除

本發(fā)明還測試了對枯草芽孢桿菌upp基因的敲除。使用的擴(kuò)增上下同源臂引物如下：

upp-up-fn：tttcgtctctaacgggtctcaccctcacactcgccacagtaatcatcag(seqidno.5)

upp-up-rn：cttcgtctcgtcggggtctcaggattcgtctggtccattattgatttgataaacggcaaggcttgcggatgaatgat(seqidno.6)

upp-dn-fn：tttcgtctctaacgggtctcatacacgtttatcaaatcaataatggaccagacgatgccatgagtgtagccactt(seqidno.7)

upp-dn-rn：cttcgtctcgtcggggtctcacgttgcggagcatgtacttgatga(seqidno.8)

編輯模板的具體構(gòu)建方法同實(shí)施例2，獲得的編輯模板的電泳圖如圖5。2.7kb為目的條帶。

實(shí)施例4：枯草芽孢桿菌amye基因的敲除

本發(fā)明還測試了對枯草芽孢桿菌amye基因的敲除。使用的擴(kuò)增上下同源臂引物如下：

amye-up-f：tttgaagaccttgccggtctcaccctttcaaaaaatcaaataaggagt(seqidno.9)

amye-up–r3：tttgaagactgctcaggtctcaggattcgtctggtccattattgatttgataaacgcttaacctcattggaaatcgcg(seqidno.10)

amye-down-f3：tttgaagaccttgccggtctcatacacgtttatcaaatcaataatggaccagacgacagatgcgaatacaacaaaagc(seqidno.11)

amye-down-r：cttgaagactgctcaggtctcacgttgtaagtcccgtctagccttgccctc(seqidno.12)

編輯模板的具體構(gòu)建方法同實(shí)施例2，獲得的編輯模板的電泳圖如圖6。2.6kb的為目的條帶。

[1]jbacteriol.1982may；150(2):815–825

參考文件/referencedocuments:gs-sop-blaw001-02專利管理程序。