本申請(qǐng)要求英國(guó)專利申請(qǐng)第1418892.4號(hào)的優(yōu)先權(quán)，在此出于全部目的將其全部?jī)?nèi)容并入作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于基因編輯領(lǐng)域，從而對(duì)染色體dna基因座的核苷酸序列進(jìn)行修飾，例如，以改正突變。
背景技術(shù)：
：使用寡核苷酸編輯基因組dna是本領(lǐng)域已知的。例如，參見(jiàn)papaioannou等人(expertopinbiolther.2012mar；12(3)：329-42)。aarts&riele(nucleicacidsresearch2010，38：20)公開(kāi)了使用單鏈dna寡核苷酸(ssodn)改正整合到小鼠es細(xì)胞中的突變熒光報(bào)道基因的序列并恢復(fù)功能的方法。他們報(bào)道，比起具有末端保護(hù)的硫代磷酸鍵的ssodn，未修飾的ssodn給出更好的結(jié)果。同作者已經(jīng)報(bào)道了更多類似的結(jié)果(aarts&riele，jcellmolmed2010，14(6b)：1657-67)。andrieu-soler等人(nucleicacidsresearch2005，33：3833-3742)使用具有或不具有各種末端保護(hù)形式的單鏈dna來(lái)修飾293t細(xì)胞中的熒光報(bào)道基因。他們使用具有側(cè)翼鎖核酸(lna)殘基或具有末端硫代磷酸鍵的25聚體寡核苷酸觀察到最佳結(jié)果。他們還在小鼠中對(duì)lna-側(cè)翼的寡核苷酸進(jìn)行了體內(nèi)測(cè)試，報(bào)道了表型改善，但他們沒(méi)有檢查這些細(xì)胞的基因組序列來(lái)確認(rèn)發(fā)生了序列修飾。但是，在后來(lái)的工作中，顯示具有末端硫代磷酸鍵的寡核苷酸在小鼠體內(nèi)發(fā)揮作用(andrieu-soler等人，molecularvision2007，13：692-706)。papaioannou等人(jgenemed.200911(3)：267-74)報(bào)道，比起末端保護(hù)的ssodn，使用硫代磷酸鍵的內(nèi)部保護(hù)的ssodn在cho細(xì)胞中給出更好的結(jié)果。它們還使用sirna抑制內(nèi)源性msh2表達(dá)。另一使用寡核苷酸的dna編輯技術(shù)稱作crispr，但該技術(shù)要求crispr/cas9酶與寡核苷酸一起的共遞送(co-delivery)。對(duì)于能夠使用內(nèi)源性細(xì)胞途徑編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞中、甚至整個(gè)有機(jī)體中內(nèi)源性基因的新技術(shù)仍有需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性染色體dna序列進(jìn)行改變的方法，其包括以下步驟：(i)向所述細(xì)胞中引入除該改變以外序列與染色體dna序列互補(bǔ)的寡核苷酸；(ii)給予細(xì)胞充分長(zhǎng)的時(shí)間，以通過(guò)內(nèi)源性核酸修飾途徑將該改變并入內(nèi)源性染色體dna序列；和(iii)識(shí)別染色體dna序列中該改變的存在。本發(fā)明還提供一種對(duì)人細(xì)胞的內(nèi)源性突變cftr染色體dna序列進(jìn)行改變的方法，其包括以下步驟：(i)向所述細(xì)胞中引入除該改變以外序列與染色體dna序列互補(bǔ)的寡核苷酸；和(ii)給予細(xì)胞充分長(zhǎng)的時(shí)間，以通過(guò)內(nèi)源性核酸修飾途徑將該改變并入內(nèi)源性染色體dna序列。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，除其包括目標(biāo)序列的所需修飾以外，其序列與內(nèi)源性哺乳動(dòng)物染色體dna序列中的目標(biāo)序列互補(bǔ)，其中寡核苷酸具有一個(gè)或多個(gè)以下結(jié)構(gòu)特征：(i)其包括至少一個(gè)鎖(locked)核苷；(ii)其包括至少一個(gè)核苷酸間硫代磷酸鍵；和/或(iii)其長(zhǎng)度為至少26個(gè)核苷酸，例如，長(zhǎng)度45-100個(gè)核苷酸。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，除其在內(nèi)部位置處包括目標(biāo)序列的所需修飾以外，其序列與內(nèi)源性哺乳動(dòng)物染色體dna序列中的目標(biāo)序列互補(bǔ)，其中內(nèi)部位置上游緊鄰的核苷酸是鎖核苷酸。優(yōu)選地，內(nèi)部位置上游緊鄰的兩個(gè)核苷酸均是鎖定的。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，除其在內(nèi)部位置處包括目標(biāo)序列的所需修飾以外，其序列與內(nèi)源性哺乳動(dòng)物染色體dna序列中的目標(biāo)序列互補(bǔ)，其中內(nèi)部位置上游緊鄰的核苷酸和/或內(nèi)部位置下游緊鄰的核苷酸經(jīng)由硫代磷酸鍵與內(nèi)部位置處的核苷酸連接。本發(fā)明還提供一種用于在目標(biāo)染色體dna序列的選定鏈中在特定位置處進(jìn)行所需插入或置換的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與特定位置的非選定鏈中的下游的染色體序列互補(bǔ)；z與特定位置的非選定鏈中的上游的染色體序列互補(bǔ)；y是所需的插入或置換。選定鏈優(yōu)選為反義鏈，因此非選定鏈為有義鏈。x和/或z可以通過(guò)硫代磷酸鍵與y連接。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，除其包括目標(biāo)序列的所需修飾以外，其序列與內(nèi)源性哺乳動(dòng)物染色體dna序列中的目標(biāo)序列互補(bǔ)，其中(i)至少寡核苷酸的5′和/或3′端核苷酸是鎖定的；和/或(ii)至少5′和/或3′端二核苷酸經(jīng)由硫代磷酸鍵連接。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，除其在內(nèi)部位置處包括目標(biāo)序列的所需修飾以外，其序列與內(nèi)源性哺乳動(dòng)物染色體dna序列中的目標(biāo)序列互補(bǔ)，其中內(nèi)部位置下游和/或上游緊鄰的核苷酸(i)經(jīng)由硫代磷酸鍵與內(nèi)部位置處的核苷酸連接，并且/或者(ii)是鎖核苷酸。下游和/或上游的更多核苷酸可以類似地加以修飾，使得兩個(gè)或更多個(gè)連續(xù)核苷酸可以具有特性(i)和/或(ii)。類似地，本發(fā)明還提供一種用于在目標(biāo)染色體dna序列的選定鏈中在特定位置處進(jìn)行所需插入或置換的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與特定位置的非選定鏈中的下游的染色體序列互補(bǔ)；z與特定位置的非選定鏈中的上游的染色體序列互補(bǔ)；y是所需的插入或置換；并且其中(i)x和/或z通過(guò)硫代磷酸鍵與y連接，并且/或者(ii)x的3′核苷酸和/或z的5′核苷酸是鎖核苷酸。這些寡核苷酸進(jìn)一步的細(xì)節(jié)在下文中進(jìn)行討論。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，其包括seqidno：1-6中任一個(gè)或者seqidno：7-10中任一個(gè)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種用于改正δf508cftr突變的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與人cftr基因的有義鏈互補(bǔ)，在核苷酸1524處開(kāi)始；z與人cftr基因的有義鏈互補(bǔ)，直至核苷酸1520；y是三核苷酸aag、aaa或aat。本文的人cftr核苷酸編號(hào)是標(biāo)準(zhǔn)的，并基于有義鏈(seqidno：11)。也可以在不恢復(fù)phe密碼子的情況下恢復(fù)cftr功能，因?yàn)榘被醡et、gly和cys也可以在位置508處發(fā)揮功能。因此，在這些實(shí)施方式中，序列y可以另外可選地為ccg、cag、cca、caa、cct或cat。本發(fā)明還提供一種用于改正δf508cftr突變的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與人cftr基因的反義鏈互補(bǔ)，直至核苷酸1520；z與人cftr基因的反義鏈互補(bǔ)，在核苷酸1524處開(kāi)始；并且y是三核苷酸ctt、ttt或att。如上所述，也可以在不恢復(fù)phe密碼子的情況下恢復(fù)cftr功能，因此序列y可以另外可選地為cgg、ctg、tgg、ttg、agg或atg。本發(fā)明類似地提供一種用于改正δf508cftr突變的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與人cftr基因的有義鏈互補(bǔ)，在核苷酸1525處開(kāi)始；z與人cftr基因的有義鏈互補(bǔ)，直至核苷酸1521；y是三核苷酸aaa或gaa。如上所述，也可以在不恢復(fù)phe密碼子的情況下恢復(fù)cftr功能，因此序列y可以另外可選地為acc、gcc、tcc、ccc、aca、gca或cat。本發(fā)明類似地提供一種用于改正δf508cftr突變的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與人cftr基因的反義鏈互補(bǔ)，直至核苷酸1521；z與人cftr基因的反義鏈互補(bǔ)，在核苷酸1525處開(kāi)始；y是三核苷酸t(yī)tt或ttc。如上所述，也可以在不恢復(fù)phe密碼子的情況下恢復(fù)cftr功能，因此序列y可以另外可選地為ggt、ggc、gga、ggg、tgt、tgc或atg。本發(fā)明還提供一種寡核苷酸，其包括seqidno：4的核苷酸序列。該寡核苷酸(優(yōu)選dna)可以包括一個(gè)或多個(gè)ps-鍵和/或一個(gè)或多個(gè)鎖核苷酸。優(yōu)選在seqidno：4的23-25位處的aag三核苷酸的側(cè)翼緊鄰著(例如，上游緊鄰著)具有至少一個(gè)ps-鍵(例如，2個(gè)或更多個(gè)，例如3個(gè)連續(xù)的鍵)(例如，包括基序ca*aag、cc*a*aag、ac*c*a*aag、aag*at、aag*a*tg、aag*a*t*ga、ca*aag*at、cc*a*aag*a*tg等)。寡核苷酸的總長(zhǎng)度可以為47nt(即單獨(dú)的seqidno：4)，或者其可以在上游和/或下游延長(zhǎng)，例如，達(dá)到長(zhǎng)度80個(gè)核苷酸。本發(fā)明還提供一種包括本發(fā)明的寡核苷酸的細(xì)胞。哺乳動(dòng)物細(xì)胞本發(fā)明涉及哺乳動(dòng)物細(xì)胞中染色體dna序列的修飾。原則上，本發(fā)明可以用于來(lái)自任何哺乳動(dòng)物物種的細(xì)胞，但優(yōu)選用于來(lái)自靈長(zhǎng)類動(dòng)物的細(xì)胞，最優(yōu)選人的細(xì)胞。本發(fā)明可以用于來(lái)自任意器官的細(xì)胞，例如，皮膚、肺、心臟、腎、肝、眼、腦、血液。本發(fā)明特別適合于修飾上皮細(xì)胞中、更優(yōu)選腸或肺上皮細(xì)胞中的序列。本發(fā)明還可以用于非天然存在于有機(jī)體中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，細(xì)胞系或胚胎干(es)細(xì)胞。本發(fā)明可以用于不同類型的干細(xì)胞，包括多能干細(xì)胞、全能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞等。細(xì)胞可以位于體外或體內(nèi)。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于其可以在活的有機(jī)體中原位用于細(xì)胞，但是其也可以用于培養(yǎng)物中的細(xì)胞。使用本發(fā)明的一個(gè)方式是修飾自患者取得的細(xì)胞中的染色體序列，然后在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾之后將其再引入至患者。本發(fā)明還可以用于編輯類器官(organoid)內(nèi)的細(xì)胞的基因組。細(xì)胞器可以視作是體外得到的三維組織，但使用特定條件驅(qū)使產(chǎn)生單獨(dú)的、分離的組織(例如，參見(jiàn)lancaster&knoblich，science2014，vol.345no.61941247125)。其在治療設(shè)定中是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢栽隗w外自患者細(xì)胞取得，然后可以將類器官作為自體材料再引入至患者，這比起一般移植物更不容易排斥。因此，根據(jù)另一優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明可以在從取自患者的組織樣品生長(zhǎng)的類器官上實(shí)施(例如，來(lái)自其胃腸道；參見(jiàn)sala等人，jsurgres.2009；156(2)：205-12，另有sato等人，gastroenterology2011；141：1762-72)；在根據(jù)本發(fā)明基因修復(fù)時(shí)，類器官或位于類器官中的干細(xì)胞可以用于移植回患者體內(nèi)，以改善器官功能。細(xì)胞在根據(jù)本發(fā)明被修飾之前將通常具有基因突變。突變可以是雜合的或純合的。本發(fā)明通常用于修飾點(diǎn)突變或小的缺失(例如，至多3個(gè)核苷酸)。含有所關(guān)注突變的基因在下文中進(jìn)行討論。但是，在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將與疾病相關(guān)的突變引入至細(xì)胞系或動(dòng)物中以相反的方式使用本發(fā)明，例如，以提供用于所考察疾病的有用的研究工具。與本發(fā)明使用的最優(yōu)選的細(xì)胞類型是在cftr基因中具有突變例如δf508突變的人肺細(xì)胞。目標(biāo)序列和改變本發(fā)明用于在也稱作目標(biāo)序列的內(nèi)源性染色體dna序列中進(jìn)行改變。如上所述，在根據(jù)本發(fā)明被修飾之前，目標(biāo)序列通常包括突變，例如點(diǎn)突變或小的缺失(小于10個(gè)核苷酸，例如密碼子缺失)。染色體可以是線粒體染色體，但更通常為細(xì)胞核染色體。含有所關(guān)注突變的基因包括，但不限于，cftr基因(囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)受體)、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(dystrophin)、亨廷頓蛋白、神經(jīng)纖維瘤蛋白1、神經(jīng)纖維瘤蛋白2、血紅蛋白的β-球蛋白鏈、cep290(中心體蛋白290kda)、β-氨基己糖苷酶a的hexa基因以及任何一種作為稱作usher綜合征的遺傳性失明形式的原因的烏謝爾(usher)基因(例如，編碼ush2b的usherin)。目標(biāo)序列將會(huì)相應(yīng)地選擇，寡核苷酸將會(huì)包括所需修飾，以改正突變。根據(jù)本發(fā)明引入的改變通常是單個(gè)核苷酸置換、短的插入(例如，至多3個(gè)核苷酸)或者短的缺失(例如，至多3個(gè)核苷酸)。本發(fā)明尤其可用于將一個(gè)或多個(gè)核苷酸(特別地，2個(gè)或更多個(gè)的例如3個(gè)的，如密碼子)插入至目標(biāo)序列中。當(dāng)目標(biāo)序列是編碼序列時(shí)，可以靶向有義鏈或反義鏈。反義鏈?zhǔn)寝D(zhuǎn)錄的dna鏈，因此與rna互補(bǔ)；相反，有義鏈?zhǔn)遣槐晦D(zhuǎn)錄的dna鏈。優(yōu)選靶向反義鏈，因?yàn)榭傮w上發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)靶向該鏈時(shí)觀察到成功修飾的頻率更高。如上所述，最優(yōu)選的目標(biāo)序列是突變cftr基因。最常見(jiàn)的致病cftr基因突變導(dǎo)致δf508多肽突變，由跨過(guò)密碼子507-508的核苷酸1521-3的喪失導(dǎo)致，在多肽水平上導(dǎo)致phe-508的喪失。因此，目標(biāo)序列可以是cftr基因的這一區(qū)域，寡核苷酸將會(huì)導(dǎo)致引入3個(gè)核苷酸，以在修飾的序列中提供苯丙氨酸(或者如上所述，另一仍提供可以發(fā)揮離子通道作用的cftr蛋白質(zhì)并因此減輕囊性纖維化的氨基酸)的密碼子。因此，寡核苷酸可以包括用于在密碼子507的第二個(gè)核苷酸之后插入的三聯(lián)體ctt、ttt或att(如果靶向有義鏈)或者其互補(bǔ)物(如果靶向反義鏈)即aag、aaa或aat；另外可選地，寡核苷酸可以包括用于在密碼子507的第三個(gè)核苷酸之后插入的三聯(lián)體ttt或ttc(如果靶向有義鏈)或者其互補(bǔ)物(如果靶向反義鏈)即aaa或gaa。除δf508以外，cf突變領(lǐng)域技術(shù)人員還認(rèn)識(shí)到cftr基因中已知有1000-2000個(gè)突變，包括r117h、g542x、g551d、r553x、w1282x和n1303k。所有這些突變均可以使用本發(fā)明的方法進(jìn)行修飾，并可以相應(yīng)地設(shè)計(jì)寡核苷酸。目標(biāo)序列是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性的。因此，例如，目標(biāo)序列不是細(xì)胞歷史上一些時(shí)間點(diǎn)處人工引入的轉(zhuǎn)基因或標(biāo)記基因，而是細(xì)胞中天然存在的基因(無(wú)論突變還是非突變形式)。寡核苷酸本發(fā)明使用寡核苷酸來(lái)修飾哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的目標(biāo)序列。這些寡核苷酸通常是單鏈的，并且可以具有不同的結(jié)構(gòu)特征，如下文中進(jìn)一步詳述。寡核苷酸通常長(zhǎng)度短于100個(gè)核苷酸，通常具有20-80或25-75個(gè)核苷酸，優(yōu)選具有27-50或45-70個(gè)核苷酸。發(fā)明人使用40-50個(gè)核苷酸和50-60個(gè)核苷酸的寡核苷酸已經(jīng)觀察到非常好的結(jié)果。當(dāng)所需修飾是插入或置換時(shí)，寡核苷酸具有序列x-y-z，其中兩個(gè)最外的序列(x&z)與目標(biāo)序列在所需修飾位置側(cè)翼的區(qū)域互補(bǔ)。這兩個(gè)區(qū)域理想地長(zhǎng)度各自為至少10個(gè)核苷酸，例如，20-35或10-25個(gè)核苷酸，例如，長(zhǎng)度各自為12或22或26或28個(gè)核苷酸。它們的長(zhǎng)度可以不同，但是優(yōu)選地，它們的長(zhǎng)度大致相等，例如，長(zhǎng)度差異不大于5個(gè)核苷酸。中間的區(qū)域(y)包括所需的修飾，即要插入到目標(biāo)序列中的序列，或者要進(jìn)行的序列置換(例如要被插入的三核苷酸)。因此，y序列指定目標(biāo)序列的所需修飾(即插入或置換)。當(dāng)所需修飾是缺失時(shí)，寡核苷酸具有序列x-z，其中x&z與目標(biāo)序列在所需缺失位置側(cè)翼的區(qū)域互補(bǔ)，如上文所討論。目標(biāo)序列在這兩個(gè)區(qū)域之間包括短的序列，本發(fā)明導(dǎo)致該短序列缺失。因此，寡核苷酸中不存在該段序列指定目標(biāo)序列的所需修飾(即缺失)。無(wú)意拘泥于理論，根據(jù)本發(fā)明的dna編輯的可能模型在插入或置換的情形中設(shè)想，寡核苷酸具有序列y導(dǎo)致的“凸出(bulge)”(例如，參見(jiàn)aarts&riele，2010中圖8)，而在dna編輯包括缺失的情形中，目標(biāo)序列包括與改變對(duì)應(yīng)的凸出。據(jù)信寡核苷酸在dna復(fù)制過(guò)程中并入至初生鏈中，從而將改變引入至初生鏈。在隨后的復(fù)制循環(huán)中，新形成的并入有改變的鏈被用作正常復(fù)制的模板，從而將改變拷貝至下一個(gè)鏈，依次類推。對(duì)于所有類型的修飾，除所需改變以外，寡核苷酸的序列與染色體dna序列互補(bǔ)。因此，對(duì)于插入和置換，區(qū)域x和z與目標(biāo)序列互補(bǔ)，但y不互補(bǔ)，因?yàn)樵撔蛄性谌旧w組中不存在或者被置換。類似地，對(duì)于缺失，區(qū)域x和z與目標(biāo)序列互補(bǔ)，但染色體組額外地包括與寡核苷酸不互補(bǔ)的區(qū)域，這便是被缺失的區(qū)域。通常，寡核苷酸中編碼所需改變(例如，所需插入)的位置將具有至少5個(gè)上游和下游核苷酸。因此，例如，區(qū)域x和z二者的長(zhǎng)度均為至少5個(gè)核苷酸。更典型地，這些上游區(qū)和下游區(qū)會(huì)更長(zhǎng)，例如至少8、10、12個(gè)核苷酸。上游區(qū)和下游區(qū)可以長(zhǎng)度相同，或者長(zhǎng)度不同。寡核苷酸與染色體dna序列互補(bǔ)的區(qū)域最優(yōu)選地100％互補(bǔ)，使得在并入之后，除所需位置以外不對(duì)染色體組進(jìn)行改變。然而，即使這些互補(bǔ)區(qū)在少量位置處有錯(cuò)配，只要互補(bǔ)性大致保持，該方法仍可以進(jìn)行，寡核苷酸仍可以與目標(biāo)序列雜交(雖然效率較低)。當(dāng)目標(biāo)序列包括針對(duì)其設(shè)計(jì)互補(bǔ)區(qū)的序列的多態(tài)變體時(shí)，互補(bǔ)性小于100％也可以進(jìn)行。任何這樣的錯(cuò)配不應(yīng)當(dāng)引入終止密碼子、隱蔽剪接位點(diǎn)或其他會(huì)在轉(zhuǎn)錄、前體mrna剪接或翻譯過(guò)程中影響基因正常發(fā)揮作用的特征。在這些區(qū)域中也可以使用非watson/crick堿基配對(duì)，例如，包括肌苷殘基。寡核苷酸可以是dna寡核苷酸，但更典型地，包括至少一個(gè)非天然核苷酸。因此，糖部分、嘌呤、嘧啶和/或骨架可以與天然dna不同。由dna核苷酸和修飾核苷酸的混合物制成的寡核苷酸最為典型。寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)鎖核苷，因此，包括一個(gè)或多個(gè)鎖核苷酸。這些核苷中的核糖包括連接2′氧和4′碳的橋(通常為亞甲基橋)，從而在3′-endo構(gòu)象中鎖定核糖。鎖核苷可以包括二環(huán)糖化學(xué)結(jié)構(gòu)，典型地，受限(constrained)乙基?？梢允褂?′，4′-受限2′-o-甲氧基乙基(cmoe)和2′-o-乙基(cet)二環(huán)核苷酸(pallan等人，2012，chemcommun(camb).48：8195-7)。當(dāng)使用包括鎖核苷的寡核苷酸時(shí)，發(fā)明人已經(jīng)觀察到高頻率的成功修飾。具體地，在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，寡核苷酸在其5′或3′端或者優(yōu)選地在5′和3′端二處均具有鎖核苷。在其他實(shí)施方式中，寡核苷酸在指定目標(biāo)序列所需修飾的部分5′和/或3′緊挨著具有鎖核苷(例如，當(dāng)所需修飾是插入或置換時(shí)，如上文所定義，z中最3′-的核苷酸和/或z中最5′-的核苷酸是鎖定的)。在其他實(shí)施方式中，指定目標(biāo)序列所需修飾的部分5′和/或3′緊挨著的三個(gè)核苷酸中的至少一個(gè)是鎖定的(例如，當(dāng)所需修飾是插入或置換時(shí)，如上文所定義，x中最3′-和/或z中最5′-的三核苷酸包括至少一個(gè)鎖核苷)。當(dāng)寡核苷酸包括鎖核苷時(shí)，則其優(yōu)選地包括至少2個(gè)。更優(yōu)選地，至少2個(gè)(例如，2或3個(gè))相鄰的核苷酸均是鎖定的。因此，在一實(shí)施方式中，寡核苷酸兩端的2或3個(gè)核苷酸是鎖定的。在另一實(shí)施方式中，當(dāng)所需修飾時(shí)插入或置換時(shí)，x的3′端處的2或3個(gè)核苷酸(即緊挨著要插入的序列上游)是鎖定的。寡核苷酸可以包括一個(gè)或多個(gè)核苷酸間硫代磷酸鍵。與天然的dna磷酸二酯鍵相比較，硫代磷酸鍵(ps)將一硫原子取代為非橋接氧。當(dāng)使用包括硫代磷酸鍵的寡核苷酸時(shí)，發(fā)明人已經(jīng)觀察到高頻率的成功修飾。具體地，在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，寡核苷酸在其5′或3′端或者優(yōu)選地在5′和3′端二處均具有硫代磷酸鍵。寡核苷酸包括硫代磷酸鍵時(shí)，則其優(yōu)選包括至少兩個(gè)。例如，寡核苷酸兩端處至多5個(gè)核苷酸之間的鍵可以是ps-鍵，例如，兩端4個(gè)核苷酸之間3個(gè)鍵。類似地，可以使用其他的非磷酸二酯鍵。寡核苷酸的3′端優(yōu)選地具有游離-oh基。寡核苷酸的5′端可以具有游離磷酸或硫代磷酸基，但在許多實(shí)施方式中，寡核苷酸的5′端反而是-oh基。如本領(lǐng)域所知，3′和5′端也可以使用其他化學(xué)基團(tuán)。靶向cftrδf508突變的特定的所關(guān)注寡核苷酸包括seqidno：1-6或7-10中任一者或者由其組成，特別關(guān)注seqidno：3和4。特別關(guān)注的修飾寡核苷酸如下：在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，如上所述，本發(fā)明提供一種用于在目標(biāo)染色體dna序列的選定鏈中在特定位置處進(jìn)行所需插入或置換的寡核苷酸，其具有序列5′-x-y-z-3′，其中：x與特定位置的非選定鏈中的下游的染色體序列互補(bǔ)；z與特定位置的非選定鏈中的上游的染色體序列互補(bǔ)；y是所需的插入或置換；并且其中(i)x和/或z通過(guò)硫代磷酸鍵與y連接，和/或(ii)x的3′核苷酸和/或z的5′核苷酸是鎖核苷酸。在這些寡核苷酸中，特性(i)和/或(ii)優(yōu)選地不僅在x-y和/或y-z連接處存在，而且進(jìn)一步繼續(xù)。因此：(a)x的3′端處的n個(gè)核苷酸之間的連接可以通過(guò)硫代磷酸鍵連接，然后是x的5′端和y的3′核苷酸之間的硫代磷酸鍵；(b)z的5′端處的n個(gè)核苷酸之間的連接可以通過(guò)硫代磷酸鍵連接，之前是y的3′核苷酸和z的5′核苷酸之間的硫代磷酸鍵；(c)x的3′端處的n個(gè)核苷酸可以是鎖核苷酸；并且/或者(d)z的5′端處的n個(gè)核苷酸可以是鎖核苷酸。n的值可以是1、2、3、4或5(或更多)。例如，n可以是2或3。盡管這些寡核苷酸可以包括硫代磷酸鍵和鎖核苷酸二者，在單個(gè)寡核苷酸中通常僅存在一種這樣的修飾。類似地，盡管硫代磷酸鍵和/或鎖核苷酸可以在y的5′和3′端二處均存在，通常其僅在一端存在，例如在x中。因此，例如，寡核苷酸x-y-z可以在x的3個(gè)3′核苷酸和y的5′核苷酸之間具有3個(gè)硫代磷酸鍵。寡核苷酸通常長(zhǎng)度為20-100個(gè)核苷酸。寡核苷酸優(yōu)選地長(zhǎng)度為至少25個(gè)核苷酸，例如長(zhǎng)度為至少或正好40、50、55、57或60個(gè)核苷酸。寡核苷酸優(yōu)選地具有脫氧核糖(如果合適，如上文討論通過(guò)鎖定修飾來(lái)修飾)。y優(yōu)選為插入，其可以是1個(gè)或多個(gè)核苷酸，例如2-6個(gè)核苷酸，優(yōu)選2或3個(gè)核苷酸(例如，缺失的密碼子)。選定鏈優(yōu)選為反義鏈，因此非選定鏈為有義鏈。將改變并入至染色體中本發(fā)明的方法包括以下步驟，其中將寡核苷酸引入至細(xì)胞中，然后給予足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以使細(xì)胞將改變(其存在于寡核苷酸中)并入至其基因組dna中。改變通過(guò)細(xì)胞中的內(nèi)源性核酸修飾途徑介導(dǎo)，其與寡核苷酸相互作用，并使改變實(shí)現(xiàn)。因此，例如，該方法與基于crispr的技術(shù)形成對(duì)比，上述技術(shù)也使用寡核苷酸促進(jìn)dna編輯，但需要額外的非內(nèi)源性酶在細(xì)胞中的表達(dá)。對(duì)于術(shù)語(yǔ)“核酸修飾途徑”，發(fā)明人無(wú)意于將其自身限定至任何具體的途徑；該術(shù)語(yǔ)設(shè)想了細(xì)胞內(nèi)源性的dna復(fù)制、dna修復(fù)等涉及的路徑的任何子集或全部。使細(xì)胞并入改變所需的時(shí)間可以隨不同細(xì)胞類型而不同，但可以通過(guò)簡(jiǎn)單試驗(yàn)很容易地評(píng)價(jià)。當(dāng)修飾的序列導(dǎo)致易于檢測(cè)的表型變化時(shí)，試驗(yàn)尤其簡(jiǎn)單。一種合適的試驗(yàn)技術(shù)涉及將寡核苷酸遞送至測(cè)試有機(jī)體，然后之后在不同時(shí)間點(diǎn)取活檢樣品。目標(biāo)dna的序列可以在活檢序列中評(píng)價(jià)，具有修飾的細(xì)胞的比例可以容易地得出。將該試驗(yàn)進(jìn)行過(guò)一次之后，則知識(shí)可以得以保留，可以在無(wú)需取活檢樣品的情況下進(jìn)行進(jìn)一步遞送。因此，本發(fā)明的方法可以包括以下步驟：識(shí)別細(xì)胞的染色體dna序列中所需改變的存在，從而驗(yàn)證基因組序列已經(jīng)加以修飾。如上文所討論，該步驟典型地涉及對(duì)染色體dna的相關(guān)部分進(jìn)行測(cè)序，從而可以很容易驗(yàn)證序列的改變。有可能細(xì)胞可以在寡核苷酸已經(jīng)引入其中之后、但基因改變發(fā)生之前分裂。在這些情形中，寡核苷酸可以仍在兩種子細(xì)胞中存在，使得它們均可以視作是其中引入寡核苷酸的細(xì)胞。因此，其基因改正的細(xì)胞可以是接收寡核苷酸的細(xì)胞，但有時(shí)其可以是接收細(xì)胞的子代。而且，即使dna修飾已發(fā)生之后，修飾的細(xì)胞也可以變得稀釋(例如，參見(jiàn)aarts&riele，2010的圖8)。因此，在實(shí)際治療方面，本發(fā)明的方法可以涉及寡核苷酸的重復(fù)遞送，直至足夠多的細(xì)胞已被修飾，以便為患者提供切實(shí)的益處。寡核苷酸的遞送(delivery)本發(fā)明的寡核苷酸特別適合于治療用途，因此本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包括本發(fā)明的寡核苷酸和藥學(xué)可接受的載體。在本發(fā)明一些實(shí)施方式中，藥學(xué)可接受的載體可以簡(jiǎn)單地為鹽水溶液。這可以有用地是等滲或低滲的，特別是對(duì)于肺遞送。本發(fā)明還提供包括本發(fā)明的藥物組合物的遞送裝置(例如，注射器、吸入器、霧化器)。如本文所述，本發(fā)明還提供在對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)源性染色體dna序列進(jìn)行改變的方法中使用的本發(fā)明的寡核苷酸。類似地，如本文所述，本發(fā)明提供本發(fā)明的寡核苷酸在用于對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)源性染色體dna序列進(jìn)行改變的藥物制造中的用途。本發(fā)明特別適合用于治療遺傳疾病，例如，囊性纖維化、白化病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥、阿爾茨海默氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥、哮喘、β-地中海貧血、cadasil綜合征、腓骨肌萎縮癥、慢性阻塞性肺病(copd)、遠(yuǎn)端型脊肌萎縮癥(dsma)、duchenne/becker肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、營(yíng)養(yǎng)不良性大皰性表皮松懈癥、大皰性表皮松懈癥、法布里病、家族性腺瘤、息肉病(polyposis)、半乳糖血癥、戈謝氏病(gaucher’sdisease)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、血友病、遺傳性血色病、亨特氏綜合征、亨廷頓病、赫爾勒氏綜合征(hurlersyndrome)、炎癥性腸病(ibd)、遺傳性多凝集反應(yīng)綜合征、雷伯氏先天性黑內(nèi)障(lebercongenitalamaurosis)、萊施-奈恩綜合征(lesch-nyhansyndrome)、lynch綜合征、馬凡綜合征(marfansyndrome)、粘多糖病、肌肉萎縮癥、i型和ii型肌強(qiáng)直性營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)纖維瘤、a型、b型和c型尼曼-匹克病(niemann-pickdisease)、ny-eso1相關(guān)的癌癥、帕金森病、peutz-jeghers綜合征、苯丙酮尿癥、龐培氏病(pompe′sdisease)、原發(fā)性纖毛病(primaryciliarydisease)、肺動(dòng)脈高血壓、色素性視網(wǎng)膜炎、桑德霍夫病(sandhoffdisease)、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷綜合征(scid)、鐮狀細(xì)胞性貧血、脊髓性肌肉萎縮癥、斯特格氏病(stargardt’sdisease)、泰-薩二氏病(tay-sachsdisease)、usher綜合征、x-關(guān)聯(lián)免疫缺陷、各種形式的癌癥(例如brca1和2關(guān)聯(lián)乳腺癌和卵巢癌)等。在一些實(shí)施方式中，寡核苷酸可以全身遞送，但更典型的是將寡核苷酸遞送至其中觀察到目標(biāo)序列的表型的細(xì)胞。例如，cftr中的突變導(dǎo)致囊性纖維化，其主要在肺上皮組織中觀察到，因此對(duì)于cftr目標(biāo)序列，優(yōu)選地將寡核苷酸特異性、直接地遞送至肺。這可以通過(guò)例如粉末或氣溶膠的吸入方便地實(shí)現(xiàn)，典型地經(jīng)由使用霧化器。特別優(yōu)選使用所謂的振動(dòng)篩的霧化器，包括來(lái)自respironics的parieflow(快速)或i-neb。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，吸入使用寡核苷酸可以導(dǎo)致寡核苷酸的全身分布，并在腸、肝、胰腺、腎和唾腺組織等中被細(xì)胞攝取。因此，預(yù)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的吸入給藥也可以有效地靶向細(xì)胞，在cftr基因靶向的情形中，其可以導(dǎo)致囊性纖維化另外相關(guān)的胃腸道癥狀減輕。對(duì)于其他目標(biāo)序列，取決于疾病和/或目標(biāo)器官，給藥可以是局部(例如，在皮膚上)、皮膚內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、口服、眼注射等。在許多疾病中，粘液層顯示出厚度增加，導(dǎo)致藥物經(jīng)由肺的吸收降低。一種這樣的疾病是慢性支氣管炎，另一個(gè)例子是囊性纖維化?？色@得各種形式的粘液正常化劑(mucusnormalizer)，例如，脫氧核糖核酸酶、高滲鹽水或甘露醇，其以bronchitol的名稱市售。當(dāng)粘液正?；瘎┡cdna修復(fù)寡核苷酸例如根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸結(jié)合使用時(shí)，它們可以增加這些藥物的效果。因此，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸向受試者優(yōu)選人受試者的給藥，優(yōu)選地與粘液正常化劑結(jié)合，優(yōu)選本文所述的這些粘液正?；瘎?。此外，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸的給藥可以與用于治療cf的小分子的給藥結(jié)合，例如，增效劑化合物例如kalydeco(ivacaftor；vx-770)，或者校正劑(corrector)化合物例如vx-809(lumacaftor)和/或vx-661。另外可選地，或者與粘液正常化劑結(jié)合，在粘液滲透顆?；蚣{米顆粒中的釋放可以應(yīng)用于將rna修復(fù)分子有效遞送至例如肺和腸的上皮細(xì)胞。因此，將根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸給予受試者、優(yōu)選人受試者，優(yōu)選地使用在粘液滲透顆粒或微顆粒中的遞送?；加屑膊”热缒倚岳w維化的患者中常常存在慢性和急性肺感染。抗生素治療減輕細(xì)菌感染及其癥狀例如粘液稠化和/或生物膜形成。由于修復(fù)分子更容易到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞，與根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸結(jié)合使用抗生素可以增加dna修復(fù)的效果。因此，將根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸給予受試者，優(yōu)選人受試者，優(yōu)選地與抗生素治療結(jié)合，以降低細(xì)菌感染及其癥狀，例如粘液稠化和/或生物膜形成?？股乜梢匀砘蚓植炕蛘咭赃@兩種方式給藥。對(duì)于在例如囊性纖維化患者中的應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸或者根據(jù)本發(fā)明的包裝的或復(fù)合的寡核苷酸可以與以下任意者結(jié)合：粘液正?；瘎├缑撗鹾颂呛怂崦浮⒏事洞?、高滲鹽水，和/或抗生素，和/或用于治療cf的小分子，例如增效劑化合物例如kalydeco(ivacaftor；vx-770)或者校正劑(corrector)化合物例如vx-809(lumacaftor)和/或vx-661。為了增加到達(dá)目標(biāo)細(xì)胞，在給予根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸之前可以應(yīng)用broncheo-alveolar灌洗(bal)以清潔肺部。通用術(shù)語(yǔ)“包括”涵蓋了“包括”以及“由其組成”，例如，組合物“包括”x可以排他性地由x組成，或者可以包括一些額外，例如x+y。關(guān)于數(shù)值x的術(shù)語(yǔ)“大約”是任選的，例如，是指x±10％。措辭“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”的組合物y可以完全不含y。當(dāng)有關(guān)時(shí)，術(shù)語(yǔ)“基本上”可以從發(fā)明定義中忽略。關(guān)于核酸序列，術(shù)語(yǔ)“下游”是指在3′方向上進(jìn)一步沿著序列；術(shù)語(yǔ)“上游”意思相反。因此，在任何編碼多肽的序列中，起始密碼子在有義鏈中在終止密碼子的上游，但在反義鏈中在終止密碼子的下游。述及“雜交”通常是指特異性雜交，并排除非特異性雜交。使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)，可以在選擇的實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行特異性雜交，以保證探針和目標(biāo)之間大多數(shù)的穩(wěn)定相互作用是在探針和目標(biāo)的序列同一性為至少90％時(shí)。雜交條件可以用于有助于陣列中探針的設(shè)計(jì)，使得當(dāng)其與被分析的基因組的其他區(qū)域的同一性大于90％時(shí)不使用探針序列，以使交叉雜交最小化。任何具體探針/目標(biāo)雙鏈的穩(wěn)定性取決于所用的緩沖/洗滌條件。穩(wěn)定的雙鏈?zhǔn)窍礈熘蟊３蛛s交者，使得其在讀取陣列時(shí)將會(huì)促成對(duì)于該探針獲得的信號(hào)。附圖說(shuō)明圖1：本發(fā)明使用的寡核苷酸。圖2&3：實(shí)驗(yàn)1和2的結(jié)果，顯示檢測(cè)到ctt三聯(lián)體的基因組序列讀取結(jié)果的比例。在圖2中，黑色條柱是“正常”轉(zhuǎn)染，淺色條柱是“反向”轉(zhuǎn)染。在圖3中，黑色條柱顯示轉(zhuǎn)染后72小時(shí)的水平，淺色條柱顯示轉(zhuǎn)染后240小時(shí)的水平。圖4&5分別顯示實(shí)驗(yàn)3和4的ddpcr結(jié)果，顯示以％表示的野生型cftr序列拷貝數(shù)除以δf508cftr序列拷貝數(shù)的基因修飾率。除“cftr47nt3xpsas”是“47psas”以外，忽略“cftr”前綴和內(nèi)部的“nt”以后，x軸上的標(biāo)記與圖1中的名稱匹配。最后“nt”柱表示非轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照。具體實(shí)施方式實(shí)施本發(fā)明的模式囊性纖維化是白種人當(dāng)中的常染色體隱形遺傳病，每30,000人中感染1人，其由cftr基因(囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)基因)中的突變導(dǎo)致。cftr基因(seqidno：11)編碼1480氨基酸的蛋白質(zhì)，其作為camp-介導(dǎo)的cl-通道發(fā)揮功能，并在使氣道分泌物保濕和調(diào)節(jié)其他的細(xì)胞功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，包括na+傳輸，特別是在呼吸道上皮中。最普遍的cftr突變(δf508)涉及在基因的1421-3位處喪失三核苷酸(有義鏈中為ctt)，導(dǎo)致在編碼的多肽中喪失殘基phe508。為了改正這一突變，發(fā)明入已經(jīng)設(shè)計(jì)出可以重新導(dǎo)入ctt三聯(lián)體的寡核苷酸。這些寡核苷酸長(zhǎng)度不同，包括例如硫代磷酸(ps)和鎖核酸(lna)殘基的化學(xué)修飾，靶向δf508突變側(cè)翼的序列。材料和方法根據(jù)制造商標(biāo)準(zhǔn)(biospringgmbh)制造并提純寡核苷酸，并在水中重構(gòu)至最終濃度100μm，用于注射?？偣矊?duì)15種不同的寡核苷酸進(jìn)行測(cè)試，如圖1所示。在一些情形中，寡核苷酸在3′端包括cy5標(biāo)記，其僅用于有利于轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)。將具有δf508突變的cfpac-1細(xì)胞(atcc，crl-1918)在補(bǔ)充有10％熱滅活胎牛血清的杜氏改良eagle培養(yǎng)基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium)(lifetechnologies)中培養(yǎng)。細(xì)胞保持在具有5％co2的加濕空氣氣氛中。借助于k2轉(zhuǎn)染試劑(biontex)轉(zhuǎn)染cfpac-1細(xì)胞。簡(jiǎn)言之。2小時(shí)預(yù)轉(zhuǎn)染，細(xì)胞暴露于k2擴(kuò)增試劑。將寡核苷酸在150mmnacl中稀釋至最終體積50μl。在單獨(dú)的試管中，將4μlk2轉(zhuǎn)染試劑在46μl150mmnacl中稀釋，并添加至寡核苷酸混合物中。渦旋10秒之后，將混合物在室溫下保持30分鐘，之后將50μl加入至含有1.0×105細(xì)胞的cfpac-1細(xì)胞懸浮液中，隨后在24孔板的孔中接種。孵育過(guò)夜之后，將接種物用新鮮的培養(yǎng)基取代，并在37℃、5％co2下孵育48、72或240小時(shí)。對(duì)于基因組dna測(cè)序，使用tissuexs試劑盒(machereynagel)如制造商方案所指定，對(duì)來(lái)自已經(jīng)與寡核苷酸孵育的cfpac-1細(xì)胞的總細(xì)胞dna進(jìn)行分離，達(dá)到最終體積20μl。對(duì)回收的dna進(jìn)行兩種不同的pcr方案。為了產(chǎn)生人cftr特異性擴(kuò)增子，進(jìn)行含有1μl分離的總細(xì)胞dna的靶向cftr基因的pcr。在這一方面，組裝含有0.4μm正向和反向引物、25μm各dntp、1×amplitaq360緩沖液、3.125mmmgcl2和1.0單位amplitaq360聚合酶(均來(lái)自lifetechnologies)的反應(yīng)。使用以下循環(huán)條件進(jìn)行pcr循環(huán)。在7分鐘95℃下初始變性步驟之后是30個(gè)以下循環(huán)：95℃下30s，55℃下30s，72℃下45s。通過(guò)7分鐘72℃下的最終延長(zhǎng)期，使pcr擴(kuò)增終止。在含有每樣品0.4μm正向引物和獨(dú)特的miseqindex引物、25μm各dntp、1×amplitaq360緩沖液、3.125mmmgcl2和1.0單位amplitaq360聚合酶的巢式pcr程序中使用1μl之前的pcr。使用以下循環(huán)條件進(jìn)行pcr循環(huán)。在7分鐘95℃下初始滅活步驟之后是25個(gè)以下循環(huán)：95℃下30s，60℃下30s，72℃下45s。使用7分鐘72℃下的最終延長(zhǎng)期，使反應(yīng)終止。在所有情形中，正向和反向引物均在導(dǎo)致δf508突變的三聯(lián)體缺失的位置側(cè)翼。在序列分析儀中裝載含有miseq序列引物序列的pcr產(chǎn)物之前，使用熒光計(jì)(lifetechnologies)根據(jù)制造商的方案測(cè)量提純的pcr產(chǎn)物的濃度?？傊?，通過(guò)將2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)液在工作溶液中進(jìn)行20倍稀釋，制作2個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)物的檢驗(yàn)試管。對(duì)于每個(gè)樣品，在單獨(dú)的試管中制備200μl工作溶液，將1μlpcr產(chǎn)物加入至該溶液中，并通過(guò)渦旋混合數(shù)秒。將樣品針對(duì)2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)量，并因此計(jì)算以ng/μl為單位的濃度。pcr產(chǎn)物的測(cè)序在來(lái)自illumina的miseqtm系統(tǒng)上進(jìn)行，其使用合成測(cè)序(sequencing-by-synthesis)提供快速的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)1使用兩種不同的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染cfpac-1細(xì)胞，反向轉(zhuǎn)染在將細(xì)胞接種至24孔板的孔中的同時(shí)將轉(zhuǎn)染混合物與細(xì)胞混合，常規(guī)轉(zhuǎn)染方案接種預(yù)種的cfpac-1細(xì)胞。使用表2所示的轉(zhuǎn)染混合物。將預(yù)接種的cfpac-1細(xì)胞(24孔板中1.5×105細(xì)胞/孔)和新鮮接種的細(xì)胞(反向轉(zhuǎn)染，24孔板中1.5×105細(xì)胞/孔)暴露于這些混合物24小時(shí)，之后將培養(yǎng)基用新鮮的培養(yǎng)基取代。轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收獲細(xì)胞，如上文討論使用tissuexs試劑盒分離基因組dna。使用pcr(參見(jiàn)上文)對(duì)該材料進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行測(cè)序，以確定已經(jīng)實(shí)現(xiàn)δf508突變修復(fù)的細(xì)胞的比例。pcr之前基因組dna的濃度和擴(kuò)增之后pcr產(chǎn)物的濃度如表1所示。該表格還顯示了對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果(另參見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)2由于實(shí)驗(yàn)1已經(jīng)顯示出使用k2和反向轉(zhuǎn)染方案的cfpac-1細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)染，該方法用于對(duì)在不同位置處(參見(jiàn)圖1)含有l(wèi)na修飾的不同寡核苷酸進(jìn)行驗(yàn)證。使用表4所示的轉(zhuǎn)染混合物。細(xì)胞(24孔中1.5×105細(xì)胞/孔)是與混合物一起新鮮接種的細(xì)胞(反向轉(zhuǎn)染)，其暴露于反應(yīng)混合物24小時(shí)，之后將培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基取代。轉(zhuǎn)染后72或240小時(shí)，收獲細(xì)胞，并使用tissuexs試劑盒分離基因組dna，并如之前所述進(jìn)行pcr和測(cè)序。結(jié)果示于表3(另參見(jiàn)圖3)。盡管轉(zhuǎn)染之后10天信號(hào)已衰減，該效果可以通過(guò)dna整合和細(xì)胞分裂的持續(xù)過(guò)程導(dǎo)致的稀釋解釋，但即使在初步的實(shí)驗(yàn)中，觀察到的修復(fù)水平也高于背景。實(shí)驗(yàn)3基于這些結(jié)果，我們用寡核苷酸對(duì)cfpac-1細(xì)胞進(jìn)行反向轉(zhuǎn)染，以在cftr中實(shí)現(xiàn)δf508突變位點(diǎn)的dna編輯。分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的基因組dna，并對(duì)其進(jìn)行設(shè)計(jì)成區(qū)分突變和野生型cftr片段的微滴數(shù)字(dropletdigital)pcr(ddpcr)方法。序列差異導(dǎo)致不同的基于taqman的探針在40循環(huán)的pcr程序中結(jié)合并水解。該ddpcr檢驗(yàn)的結(jié)果示于圖4中，其顯示了不同的寡核苷酸誘導(dǎo)基因編輯將遺失的ctt核苷酸引入至cftr中的能力。如之前所見(jiàn)，含有末端3核苷酸的硫代磷酸修飾的47nt單鏈反義寡核苷酸(“47psas”)以及在agg的5′上游具有兩個(gè)lna修飾核苷酸的序列相同的47nt反義寡核苷酸(“47i2x5′lnaas”)給出的基因轉(zhuǎn)化率最高。在此接下來(lái)，在agg的3′下游含有兩個(gè)lna修飾核苷酸的寡核苷酸(“47i2x3′lnaas”)也給出可用的基因轉(zhuǎn)化作用。實(shí)驗(yàn)4為了進(jìn)一步考察5′內(nèi)部修飾的寡核苷酸的基因編輯能力，我們進(jìn)一步設(shè)計(jì)了5種在aag上游含有3個(gè)ps-修飾的核苷酸連接的長(zhǎng)度不同的寡核苷酸(圖1中的最后5個(gè)寡核苷酸)。轉(zhuǎn)導(dǎo)cfpac-1細(xì)胞(反向轉(zhuǎn)染)，分離基因組dna，并進(jìn)行ddpcr檢驗(yàn)。結(jié)果示于圖5中，修飾的細(xì)胞中具有明顯的依賴于長(zhǎng)度的增加，因?yàn)檩^長(zhǎng)的寡核苷酸導(dǎo)致野生型cftr的比例有大的增加(即“i3x5′psas”系列，長(zhǎng)度47-57nt)。出于比較，另外對(duì)“47psas”(在早期實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好活性)進(jìn)行測(cè)試。明顯地，在aag的5′含有3個(gè)ps-修飾核苷酸的57nt反義寡核苷酸要?jiǎng)龠^(guò)較短的形式。相比較于之前測(cè)試的“47psas”，提高的基因編輯率為大約38倍。結(jié)論這些實(shí)驗(yàn)顯示，設(shè)計(jì)的寡核苷酸能夠通過(guò)在人細(xì)胞基因組中在預(yù)期位置處并入遺失的ctt序列來(lái)改正δf508突變。應(yīng)當(dāng)理解到，本發(fā)明僅僅通過(guò)例子在上文中加以說(shuō)明，可以在保持在本發(fā)明范圍和精神內(nèi)的同時(shí)進(jìn)行修改。表1#21-#30顯示反向轉(zhuǎn)染方案的結(jié)果。表2名稱μl寡核苷酸μlnaclμlk2μlnacl總μlμl/孔27pss5,5449,464,450,6110,005027psas5,5449,464,450,6110,005047pss2,6452,364,450,6110,005047psas2,6452,364,450,6110,005027lnaas5,5449,464,450,6110,005047lnaas2,6452,364,450,6110,0050僅k2-55,004,450,6110,0050表3#21-#30顯示轉(zhuǎn)染后240小時(shí)的結(jié)果。表4序列表(f508密碼子位置加以下劃線)seqidno：15′-agaaaatatcatctttggtgtttccta-3′seqidno：25′-taggaaacaccaaagatgatattttct-3′seqidno：35′-gcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatat-3′seqidno：45′-atattcatcataggaaacaccaaagatgatattttctttaatggtgc-3′seqidno：55′-taggaaacaccaaagatgatattttctttaatggtgcaaagcaccattaa-3′seqidno：65′-actacttataaaatataagtagttaggaaacaccaaagatgatattttct-3′seqidno：75′-tcatcataggaaacaccaaagatgatattttctttaa-3′seqidno：85′-attcatcataggaaacaccaaagatgatattttctttaatgg-3′seqidno：95′-ctatattcatcataggaaacaccaaagatgatattttctttaatggtgccag-3′seqidno：105′-atctatattcatcataggaaacaccaaagatgatattttctttaatggtgccaggca-3′seqidno：11atgcagaggtcgcctctggaaaaggccagcgttgtctccaaactttttttcagctggaccagaccaattttgaggaaaggatacagacagcgcctggaattgtcagacatataccaaatcccttctgttgattctgctgacaatctatctgaaaaattggaaagagaatgggatagagagctggcttcaaagaaaaatcctaaactcattaatgcccttcggcgatgttttttctggagatttatgttctatggaatctttttatatttaggggaagtcaccaaagcagtacagcctctcttactgggaagaatcatagcttcctatgacccggataacaaggaggaacgctctatcgcgatttatctaggcataggcttatgccttctctttattgtgaggacactgctcctacacccagccatttttggccttcatcacattggaatgcagatgagaatagctatgtttagtttgatttataagaagactttaaagctgtcaagccgtgttctagataaaataagtattggacaacttgttagtctcctttccaacaacctgaacaaatttgatgaaggacttgcattggcacatttcgtgtggatcgctcctttgcaagtggcactcctcatggggctaatctgggagttgttacaggcgtctgccttctgtggacttggtttcctgatagtccttgccctttttcaggctgggctagggagaatgatgatgaagtacagagatcagagagctgggaagatcagtgaaagacttgtgattacctcagaaatgattgaaaatatccaatctgttaaggcatactgctgggaagaagcaatggaaaaaatgattgaaaacttaagacaaacagaactgaaactgactcggaaggcagcctatgtgagatacttcaatagctcagccttcttcttctcagggttctttgtggtgtttttatctgtgcttccctatgcactaatcaaaggaatcatcctccggaaaatattcaccaccatctcattctgcattgttctgcgcatggcggtcactcggcaatttccctgggctgtacaaacatggtatgactctcttggagcaataaacaaaatacaggatttcttacaaaagcaagaatataagacattggaatataacttaacgactacagaagtagtgatggagaatgtaacagccttctgggaggagggatttggggaattatttgagaaagcaaaacaaaacaataacaatagaaaaacttctaatggtgatgacagcctcttcttcagtaatttctcacttcttggtactcctgtcctgaaagatattaatttcaagatagaaagaggacagttgttggcggttgctggatccactggagcaggcaagacttcacttctaatgatgattatgggagaactggagccttcagagggtaaaattaagcacagtggaagaatttcattctgttctcagttttcctggattatgcctggcaccattaaagaaaatatcatctttggtgtttcctatgatgaatatagatacagaagcgtcatcaaagcatgccaactagaagaggacatctccaagtttgcagagaaagacaatatagttcttggagaaggtggaatcacactgagtggaggtcaacgagcaagaatttctttagcaagagcagtatacaaagatgctgatttgtatttattagactctccttttggatacctagatgttttaacagaaaaagaaatatttgaaagctgtgtctgtaaactgatggctaacaaaactaggattttggtcacttctaaaatggaacatttaaagaaagctgacaaaatattaattttgcatgaaggtagcagctatttttatgggacattttcagaactccaaaatctacagccagactttagctcaaaactcatgggatgtgattctttcgaccaatttagtgcagaaagaagaaattcaatcctaactgagaccttacaccgtttctcattagaaggagatgctcctgtctcctggacagaaacaaaaaaacaatcttttaaacagactggagagtttggggaaaaaaggaagaattctattctcaatccaatcaactctatacgaaaattttccattgtgcaaaagactcccttacaaatgaatggcatcgaagaggattctgatgagcctttagagagaaggctgtccttagtaccagattctgagcagggagaggcgatactgcctcgcatcagcgtgatcagcactggccccacgcttcaggcacgaaggaggcagtctgtcctgaacctgatgacacactcagttaaccaaggtcagaacattcaccgaaagacaacagcatccacacgaaaagtgtcactggcccctcaggcaaacttgactgaactggatatatattcaagaaggttatctcaagaaactggcttggaaataagtgaagaaattaacgaagaagacttaaaggagtgcttttttgatgatatggagagcataccagcagtgactacatggaacacataccttcgatatattactgtccacaagagcttaatttttgtgctaatttggtgcttagtaatttttctggcagaggtggctgcttctttggttgtgctgtggctccttggaaacactcctcttcaagacaaagggaatagtactcatagtagaaataacagctatgcagtgattatcaccagcaccagttcgtattatgtgttttacatttacgtgggagtagccgacactttgcttgctatgggattcttcagaggtctaccactggtgcatactctaatcacagtgtcgaaaattttacaccacaaaatgttacattctgttcttcaagcacctatgtcaaccctcaacacgttgaaagcaggtgggattcttaatagattctccaaagatatagcaattttggatgaccttctgcctcttaccatatttgacttcatccagttgttattaattgtgattggagctatagcagttgtcgcagttttacaaccctacatctttgttgcaacagtgccagtgatagtggcttttattatgttgagagcatatttcctccaaacctcacagcaactcaaacaactggaatctgaaggcaggagtccaattttcactcatcttgttacaagcttaaaaggactatggacacttcgtgccttcggacggcagccttactttgaaactctgttccacaaagctctgaatttacatactgccaactggttcttgtacctgtcaacactgcgctggttccaaatgagaatagaaatgatttttgtcatcttcttcattgctgttaccttcatttccattttaacaacaggagaaggagaaggaagagttggtattatcctgactttagccatgaatatcatgagtacattgcagtgggctgtaaactccagcatagatgtggatagcttgatgcgatctgtgagccgagtctttaagttcattgacatgccaacagaaggtaaacctaccaagtcaaccaaaccatacaagaatggccaactctcgaaagttatgattattgagaattcacacgtgaagaaagatgacatctggccctcagggggccaaatgactgtcaaagatctcacagcaaaatacacagaaggtggaaatgccatattagagaacatttccttctcaataagtcctggccagagggtgggcctcttgggaagaactggatcagggaagagtactttgttatcagcttttttgagactactgaacactgaaggagaaatccagatcgatggtgtgtcttgggattcaataactttgcaacagtggaggaaagcctttggagtgataccacagaaagtatttattttttctggaacatttagaaaaaacttggatccctatgaacagtggagtgatcaagaaatatggaaagttgcagatgaggttgggctcagatctgtgatagaacagtttcctgggaagcttgactttgtccttgtggatgggggctgtgtcctaagccatggccacaagcagttgatgtgcttggctagatctgttctcagtaaggcgaagatcttgctgcttgatgaacccagtgctcatttggatccagtaacataccaaataattagaagaactctaaaacaagcatttgctgattgcacagtaattctctgtgaacacaggatagaagcaatgctggaatgccaacaatttttggtcatagaagagaacaaagtgcggcagtacgattccatccagaaactgctgaacgagaggagcctcttccggcaagccatcagcccctccgacagggtgaagctctttccccaccggaactcaagcaagtgcaagtctaagccccagattgctgctctgaaagaggagacagaagaagaggtgcaagatacaaggctt當(dāng)前第1頁(yè)12