本發(fā)明涉及一種新型賴氨酸脫羧酶、用對該賴氨酸脫羧酶活性進(jìn)行編碼的基因轉(zhuǎn)化的微生物以及利用其制備尸胺的方法。
背景技術(shù)：
：利用二胺(diamine)的尼龍的一般制備方法依賴以1,4-丁二胺(1,4-diaminobutane)和己二胺(hexamethylenediamine)為原料的化學(xué)工藝。由于利用以石油基礎(chǔ)的有機(jī)化合物來制備該原料物質(zhì)，因此在環(huán)境規(guī)制得到強(qiáng)化的同時(shí)，關(guān)于隨基于生物的途徑而產(chǎn)生的代替物質(zhì)的市場需求日益強(qiáng)烈。另外，尸胺為具有分子式nh2(ch2)5nh2且由五個(gè)碳原子構(gòu)成的二胺(diamine)有機(jī)化合物，從而尸胺可以是尼龍5,6的原料物質(zhì)。如果以生物為基礎(chǔ)制備尸胺，則被預(yù)測為能夠滿足基于生物的市場需求的同時(shí)生產(chǎn)各種尼龍。與以生物為基礎(chǔ)制備尸胺相關(guān)聯(lián)地，在1940年以前已知有使賴氨酸生物轉(zhuǎn)換的研究(galee.f.,eppsh.m.1944.studiesonbacterialamino-aciddecarboxylases.biochemj.38,232-242)。作為生物轉(zhuǎn)換的核心步驟的賴氨酸脫羧酶為從賴氨酸生成尸胺的酶(圖1)。報(bào)道了在各種微生物中的賴氨酸脫羧酶的活性，酶特異性活性(specificactivity，mmol/min/mg)已知的賴氨酸脫羧酶從四種微生物(大腸桿菌(escherichiacoli)、尸桿菌(bacteriumcadaveris)、大豆(glycinemax)和反芻月形單胞菌(selenomonasruminantium))得到。其中，來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶被評價(jià)為呈現(xiàn)最高活性的賴氨酸脫羧酶，實(shí)際生產(chǎn)中所應(yīng)用的酶也局限于來源于大腸桿菌的cada(日本專利第2005-147171號(hào)、歐洲專利第2004-010711號(hào)及日本專利第2002-257374號(hào))。但是，在使賴氨酸脫羧酶與賴氨酸反應(yīng)來生成尸胺的情況下，由于賴氨酸的脫羧而產(chǎn)生二氧化碳，并且因從作為一階陽離子的賴氨酸生成作為二階陽離子的尸胺而在反應(yīng)過程中ph不斷上升。由此，上述賴氨酸脫羧酶出現(xiàn)如下問題：在進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)，伴隨ph變化而效率降低。此外，也有可能因反應(yīng)溶液中所生成的酸或堿基導(dǎo)致酶變性而喪失活性。由此，本發(fā)明人通過挖掘?qū)Ω邷丶皃h具有穩(wěn)定性的新型賴氨酸脫羧酶，并且確認(rèn)該賴氨酸脫羧酶能在埃希氏菌屬菌株中表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種新型賴氨酸脫羧酶以及對具有該賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸。本發(fā)明的另一目的在于提供一種被轉(zhuǎn)化成表達(dá)上述賴氨酸脫羧酶的微生物。本發(fā)明的又一目的在于提供一種利用上述酶和包含該酶的微生物來制備尸胺的方法。技術(shù)手段在本發(fā)明的一具體方式中，提供一種具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)，上述蛋白質(zhì)包含序列號(hào)1的氨基酸序列或者與該序列號(hào)1的氨基酸序列具有75％以上的序列同源性的氨基酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語“具有賴氨酸脫羧酶(lysinedecarboxylase)活性的蛋白質(zhì)”是指能夠通過將5'-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate)作為輔酶使用來催化賴氨酸的脫羧反應(yīng)，由此使賴氨酸脫羧而生成尸胺(cadaverine)和二氧化碳的具有活性的蛋白質(zhì)。包含序列號(hào)1或與該序列號(hào)1具有75％以上的序列同源性的氨基酸序列的上述具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可以是從來源于假單胞菌屬的微生物中新發(fā)掘的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可以包括具有相應(yīng)活性且在假單胞菌屬的微生物中發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)。例如，上述假單胞菌屬菌株可以是耐熱假單胞菌(pseuodomonasthermotolerans)、產(chǎn)堿假單胞菌(pseuodomonasalcaligenes)、食樹脂假單胞菌(pseuodomonasresinovorans)、惡臭假單胞菌(pseuodomonasputida)和產(chǎn)黃假單胞菌(pseuodomonassynxantha)。具體而言，來源于上述耐熱假單胞菌微生物的具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可具有序列號(hào)1的氨基酸序列或者與該序列號(hào)1的氨基酸序列之間的序列同源性為75％以上、80％以上、85％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。來源于上述產(chǎn)堿假單胞菌菌株的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可具有序列號(hào)3的氨基酸序列或者與該序列號(hào)3的氨基酸序列之間的序列同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。來源于上述食樹脂假單胞菌菌株的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可具有序列號(hào)5的氨基酸序列或者與該序列號(hào)5的氨基酸序列之間的序列同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。來源于上述惡臭假單胞菌菌株的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可具有序列號(hào)7的氨基酸序列或者與該序列號(hào)7的氨基酸序列之間的序列同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。來源于上述產(chǎn)黃假單胞菌菌株的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)可具有序列號(hào)9的氨基酸序列或者與該序列號(hào)9的氨基酸序列之間的序列同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。但是，并不限定于上述氨基酸序列，可包含能夠維持賴氨酸脫羧酶活性的所有氨基酸序列。此外，在本發(fā)明的另一具體方式中，提供一種對上述新發(fā)掘的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸，具體而言，提供一種與序列號(hào)2的堿基序列具有75％以上的序列同源性的多核苷酸。能夠從已公開的來源于假單胞菌屬的菌株的基因組序列中獲得對具有上述賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸序列。具體而言，多核苷酸序列可來源于選自由耐熱假單胞菌、產(chǎn)堿假單胞菌、食樹脂假單胞菌、惡臭假單胞菌和產(chǎn)黃假單胞菌組成的組中的一個(gè)以上的菌株的基因組序列。來源于上述耐熱假單胞菌菌株的賴氨酸脫羧酶基因序列可具有序列號(hào)2的堿基序列，并且可具有與序列號(hào)2的堿基序列之間的同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的堿基序列。來源于上述產(chǎn)堿假單胞菌菌株的賴氨酸脫羧酶基因序列可具有序列號(hào)4的堿基序列，并且可具有與序列號(hào)4的堿基序列之間的同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的氨基酸序列。能夠從已公開的食樹脂假單胞菌的基因組序列中獲得來源于上述食樹脂假單胞菌菌株的賴氨酸脫羧酶基因序列，具體而言，來源于上述食樹脂假單胞菌菌株的賴氨酸脫羧酶基因序列可具有序列號(hào)6的堿基序列，并且可具有與序列號(hào)6的堿基序列之間的同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的堿基序列。來源于上述惡臭假單胞菌菌株的賴氨酸脫羧酶基因序列可具有序列號(hào)8的堿基序列，并且可具有與序列號(hào)8的堿基序列之間的同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的堿基序列。來源于上述產(chǎn)黃假單胞菌菌株的l-賴氨酸脫羧酶基因序列可具有序列號(hào)10的堿基序列，并且可具有與序列號(hào)10的堿基序列之間的同源性為75％以上、80％以上、90％以上或95％以上的堿基序列。但是，對具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸并不限定于此，如果是能夠?qū)Ρ景l(fā)明的新發(fā)掘的具有賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸，則可毫無限制地包含該多核苷酸。在本發(fā)明中，術(shù)語“同源性”是指與指定的氨基酸序列或堿基序列一致的程度，可用百分比表示來“同源性”。在本發(fā)明中，用“％同源性”來表示具有與指定的氨基酸序列或堿基序列相同或相似的活性的其同源性序列。例如，可利用用于計(jì)算分?jǐn)?shù)(score)、同一性(identity)和相似度(similarity)等參數(shù)(parameter)的標(biāo)準(zhǔn)軟件、具體而言利用blast2.0來比較序列而確認(rèn)同源性，或者在已定義的嚴(yán)格條件下通過印跡雜交試驗(yàn)來比較序列而確認(rèn)同源性，并且可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法來確定已定義的適當(dāng)雜交條件(例如，參考sambrook等,1989,infra)。更具體而言，上述賴氨酸脫羧酶可以是選自由序列號(hào)1、序列號(hào)3、序列號(hào)5、序列號(hào)7和序列號(hào)9的氨基酸序列組成的組中的一者以上。此外，對具有上述l-賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸可以是選自由序列號(hào)2、序列號(hào)4、序列號(hào)6、序列號(hào)8和序列號(hào)10的堿基序列組成的組中的一者以上。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，確認(rèn)來源于上述假單胞菌屬菌株的賴氨酸脫羧酶在高ph下也不會(huì)產(chǎn)生較大的活性變化，從而對ph變化具有穩(wěn)定性。在本發(fā)明的另一具體方式中，提供一種被轉(zhuǎn)化成表達(dá)具有上述新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的微生物。如果上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有該脫羧酶活性的蛋白質(zhì)，則包含原核微生物和真核微生物中的任一種微生物。例如，可包含埃希氏菌(escherichia)屬菌株、歐文氏菌(erwinia)屬菌株、沙雷氏菌(serratia)屬菌株、普羅威登斯菌(providencia)屬菌株或棒狀桿菌屬菌株。具體而言，上述微生物可以是屬于埃希氏菌屬或棒狀桿菌屬的微生物，更具體而言，可以是大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌，但并不限定于此。此外，上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物的親株可以是具有與野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物。但是，并不限定于此。本發(fā)明的術(shù)語“具有與野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物”是指與天然狀態(tài)的微生物或親株相比賴氨酸產(chǎn)能增加的微生物，如果上述賴氨酸產(chǎn)能提高的微生物是與親株相比賴氨酸產(chǎn)能提高的微生物，則并不特別限制。如上述，為了賦予與野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能，可使用如得到具有營養(yǎng)缺陷型突變株、抗類似物菌株或具有制備賴氨酸的能力的代謝控制突變株的方法、以及制備使賴氨酸生物合成酶活性增加的重組菌株的方法等的通常的微生物生長方法。在賴氨酸制備用微生物生長時(shí)，可單獨(dú)或組合賦予如營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性和代謝控制突變等的特性。增加的賴氨酸生物合成酶活性可以是單獨(dú)或組合式的。此外，也可以在賦予如營養(yǎng)缺陷性、類似物抗性和代謝控制突變等的特性的同時(shí)，使賴氨酸生物合成酶活性增加。具體而言，雖然對賴氨酸生物合成酶進(jìn)行加密的基因包含二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapa)、天冬氨酸激酶基因(lysc)、二氫吡啶二羧酸還原酶基因(dapb)、二氨基庚二酸脫羧酶基因(lysa)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因(aspc)和天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)等的酶，但并不限于此。對于通過使賴氨酸生物合成酶活性增加而賦予或增加制備賴氨酸的能力的方法而言，可通過在對該酶進(jìn)行加密的基因中誘導(dǎo)突變或使該基因擴(kuò)增而增加酶的細(xì)胞內(nèi)活性來執(zhí)行?？赏ㄟ^基因重組來執(zhí)行該方法，但并不限于此。如果是具有與上述野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物，則可包含原核微生物和真核微生物中的任一種微生物。具體而言，具有與上述野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物可以是埃希氏菌屬微生物或棒狀桿菌屬微生物。上述埃希氏菌屬微生物可以是大腸桿菌(escherichiacoli)、艾伯特埃希菌(escherichiaalbertii)、蟑螂埃希菌(escherichiablattae)、費(fèi)格森埃希菌(escherichiafergusonii)、赫氏埃希菌(escherichiahermannii)或傷口埃希菌(escherichiavulneris)，但并不限定于此。更具體而言，上述埃希氏菌屬菌株可以是大腸桿菌。上述棒狀桿菌屬微生物包含棒狀桿菌(corynebacterium)或短桿菌(brevibacterium)屬微生物。此外，雖然上述棒狀桿菌屬微生物具體可包括谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、嗜熱產(chǎn)氨棒狀桿菌(corynebacteriumthermoaminogenes)、黃色短桿菌(brevibacteriumflavum)和乳糖發(fā)酵短桿菌(brevibacteriumlactofermentum)，但并不限于此。為了將微生物轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有上述賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶基因可作為賴氨酸脫羧酶蛋白質(zhì)或基因表達(dá)單位而包含在成為轉(zhuǎn)化的對象的微生物內(nèi)。上述賴氨酸脫羧酶的基因表達(dá)單位可通過被可操作地連接到載體而轉(zhuǎn)化并包含在上述微生物中或被插入到上述微生物的染色體內(nèi)。具體而言，可以以由連接到起始密碼子的上游的啟動(dòng)子過度表達(dá)的方式可操作地連接上述賴氨酸脫羧酶基因。在本發(fā)明中，術(shù)語“表達(dá)單位”是指啟動(dòng)子與對蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的多核苷酸可操作地連接的片段，且還可以包含3'-utl、5'-utl和多聚腺苷酸尾(polyatail)等。在本發(fā)明中，術(shù)語“表達(dá)單位”也可以與“表達(dá)盒”混用。在本發(fā)明中，術(shù)語“可操作地連接”是指以開始及介導(dǎo)對賴氨酸脫羧酶進(jìn)行加密的基因轉(zhuǎn)錄的方式功能性性地連接上述基因序列和具有啟動(dòng)子活性的核酸序列。術(shù)語“可操作地連接”是指能夠通過具有啟動(dòng)子活性的核酸序列與賴氨酸脫羧酶基因可操作地連接而調(diào)節(jié)上述賴氨酸脫羧酶的轉(zhuǎn)錄活性。在本發(fā)明中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指通過將來源于假單胞菌屬菌株的賴氨酸脫羧酶基因?qū)氲剿拗骷?xì)胞內(nèi)，具體而言導(dǎo)入到埃希氏菌屬菌株或棒狀桿菌屬微生物內(nèi)，從而夠使該賴氨酸脫羧酶基因在上述宿主細(xì)胞內(nèi)能表達(dá)的總體行為。此時(shí)，上述賴氨酸脫羧酶基因作為能夠?qū)嚢彼崦擊让高M(jìn)行編碼的多核苷酸包含dna和rna。只要上述基因能夠被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)并能夠表達(dá)，則可以以任何形態(tài)導(dǎo)入。例如，上述基因可以以自行包含上述基因的表達(dá)所需要的所有要素(element)的多核苷酸結(jié)構(gòu)體的形態(tài)，即表達(dá)盒(expressioncassette)的形態(tài)被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)。上述表達(dá)盒通常包含被可操作地連接到上述基因的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及翻譯終止信號(hào)。上述表達(dá)盒可以是能夠進(jìn)行自我復(fù)制的表達(dá)載體的形態(tài)。此外，上述基因也可以以其自身形態(tài)或多核苷酸結(jié)構(gòu)體的形態(tài)被導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)而與宿主細(xì)胞的表達(dá)中所需要的序列可操作地連接。上述重組載體為用于通過將dna導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)而使蛋白質(zhì)表達(dá)的單元，可使用質(zhì)粒載體、粘粒載體或噬菌體載體等公知的表達(dá)載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過利用dna重組技術(shù)的任意公知方法來容易地制備上述載體，但并不限定于此。上述轉(zhuǎn)化方法還包括將多核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)的任何方法，可通過選擇本領(lǐng)域公知的適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來執(zhí)行該轉(zhuǎn)化方法。作為該轉(zhuǎn)化方法的例，具有電穿孔法(electroporation)、磷酸鈣共沉淀法(calciumphosphateco-precipitation)、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法((retroviralinfection)、顯微注射法(microinjection)、deae-葡聚糖法(deae-dextran)或陽離子脂質(zhì)體(cationicliposome)法等，但并不限于此。在一具體例中，通過將具有提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)，從而可具有優(yōu)異的尸胺產(chǎn)能。本發(fā)明的又一具體方式提供一種用于制備尸胺的新型賴氨酸脫羧酶或被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的微生物的用途。上述新型賴氨酸脫羧酶及被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的微生物分別如上所述。在一具體例中，確認(rèn)本發(fā)明的賴氨酸脫羧酶與現(xiàn)有尸胺制備中所使用的來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶相比對溫度或ph變化的穩(wěn)定性更高。特別是，由于本發(fā)明的新型賴氨酸脫羧酶的ph穩(wěn)定性與來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶相比相對高，因此有利于從賴氨酸到尸胺的轉(zhuǎn)換反應(yīng)。因此，本發(fā)明的新型賴氨酸脫羧酶及被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的微生物可應(yīng)用到尸胺的制備中。本發(fā)明的又一方式提供一種尸胺制備方法。本發(fā)明的尸胺制備方法的一具體方式為包括以下步驟的尸胺制備方法：利用具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)或被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有上述活性的蛋白質(zhì)的微生物來將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺；以及回收所轉(zhuǎn)換的尸胺。具有上述新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)及上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物分別如上所述。上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物具體可以是埃希氏菌屬微生物。將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的步驟可通過利用從表達(dá)具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的微生物中提取并純化的酶而使賴氨酸脫羧來制備尸胺。或者，能夠通過在培養(yǎng)上述經(jīng)轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)基中添加賴氨酸而利用微生物自身使賴氨酸脫羧，由此轉(zhuǎn)換為尸胺。此外，本發(fā)明的尸胺制備方法的又一具體方式提供一種包括以下步驟的尸胺制備方法：在培養(yǎng)基中培養(yǎng)具備尸胺產(chǎn)能的微生物，其中，具有與野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物被轉(zhuǎn)化為表達(dá)具有新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)的；以及從上述微生物或培養(yǎng)基中回收尸胺。上述具有新型l-賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)及具有與上述野生型相比提高的賴氨酸產(chǎn)能的微生物分別如上所述。上述培養(yǎng)可根據(jù)本領(lǐng)域公知的適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件來形成。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可根據(jù)所選擇的微生物來容易地調(diào)整培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。培養(yǎng)方法可包括分批式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)、補(bǔ)料分批式培養(yǎng)或它們的組合培養(yǎng)，但并不限定于此。上述培養(yǎng)基可包含各種碳源、氮源和微量元素成分。作為具體例，上述碳源可包含：如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素等的碳水化合物；如大豆油、葵花籽油、蓖麻油和椰子油等的脂肪；如軟脂酸、硬脂酸和亞油酸等的脂肪酸；如甘油和乙醇等的醇類；如乙酸等的有機(jī)酸類；或者它們的組合，具體而言，可通過將葡萄糖作為碳源來執(zhí)行，但并不限于此。上述氮源可包含：如蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿(csl)、大豆粉等的有機(jī)氮源；如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨等的無機(jī)氮源；或者它們的組合，但并不限于此。上述培養(yǎng)基為磷供給源，例如，可包含磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀以及相應(yīng)的含鈉鹽、如硫酸鎂或硫酸鐵等的金屬鹽，但并不限于此。此外，在培養(yǎng)基中可包含氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那膀?qū)體等。在培養(yǎng)基中能夠分批或連續(xù)添加上述培養(yǎng)基或個(gè)別成分，上述例僅為示例，并不限定于此。此外，在培養(yǎng)過程中能夠通過適當(dāng)?shù)姆绞较蛭⑸锱囵B(yǎng)基中添加如氫氧化銨、氫氧化鉀、氨、磷酸和硫酸等的化合物，從而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的ph。此外，在培養(yǎng)過程中能夠使用如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡劑來抑制氣泡生成。為了維持培養(yǎng)基的優(yōu)良狀態(tài)，可向培養(yǎng)液內(nèi)注入氧氣或含氧氣體(例如，空氣)。培養(yǎng)液的溫度通?？梢允?0℃至45℃，例如可以是25℃至40℃。培養(yǎng)時(shí)間可持續(xù)到直至獲得所需的賴氨酸脫羧酶的制備量為止，例如，培養(yǎng)時(shí)間可以是10至160小時(shí)?；厥丈鲜鍪返姆椒ɡ缈赏ㄟ^根據(jù)分批式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)、補(bǔ)料分批式培養(yǎng)方法等利用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)方法而從培養(yǎng)基中收集或回收所制備的尸胺。此外，這種回收方法可利用離心分離、過濾、離子交換層析和結(jié)晶化等方法。例如，能夠通過對培養(yǎng)基進(jìn)行低速離心分離而去除生物質(zhì)之后，借助離子交換層析來分離得到的上清液。此外，上述尸胺制備方法可進(jìn)一步包括以下步驟：從上述微生物或培養(yǎng)基中回收賴氨酸脫羧酶。從上述微生物或培養(yǎng)基中回收賴氨酸脫羧酶的方法可根據(jù)培養(yǎng)方法例如分批式、連續(xù)式或補(bǔ)料分批式培養(yǎng)方法等利用本領(lǐng)域公知的適當(dāng)方法來從微生物或培養(yǎng)基中收集或回收制備出的賴氨酸脫羧酶。此外，這種回收方法可利用離心分離、過濾、離子交換層析和結(jié)晶化等方法。例如，能夠通過對培養(yǎng)物進(jìn)行低速離心分離而去除生物質(zhì)之后，借助離子交換層析來分離得到的上清液。此外，可從通過破壞培養(yǎng)基中的微生物而得到的細(xì)胞裂解液(celllysate)中回收賴氨酸脫羧酶?？衫帽绢I(lǐng)域公知的適當(dāng)方法來得到上述細(xì)胞裂解液。例如，可使用物理裂解器或能夠經(jīng)適當(dāng)?shù)纳虡I(yè)活動(dòng)得到的細(xì)胞裂解緩沖液(celllysisbuffer)?？赏ㄟ^離心分離等適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域公知的方法從這種細(xì)胞裂解液中回收賴氨酸脫羧酶。有益效果本發(fā)明所提供的具有來源于假單胞菌(psuedomonas)屬菌株的新型賴氨酸脫羧酶活性的蛋白質(zhì)在ph上升的情況下也能夠具有穩(wěn)定的活性，從而能夠在從賴氨酸到尸胺的轉(zhuǎn)換反應(yīng)中有效地利用該蛋白質(zhì)，因此能夠在尸胺的生成中廣泛應(yīng)用該蛋白質(zhì)。附圖說明圖1表示通過賴氨酸脫羧酶從賴氨酸中生成尸胺的反應(yīng)機(jī)制。圖2是表示在ptldc及n-端具有組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的ptldc的表達(dá)結(jié)果的sds-page凝膠照片。圖3表示ptldc的將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的反應(yīng)性。圖4表示各種溫度下的ptldc的相對酶活性。圖5表示各種ph下的ptldc的相對酶活性。圖6是表示paldc及prldc的表達(dá)的sds-page凝膠照片。圖7表示paldc的將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的反應(yīng)性。圖8表示各種溫度下的paldc的相對酶活性。圖9表示各種ph下的paldc的相對酶活性。圖10表示prldc的將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的反應(yīng)性。圖11表示各種溫度下的prldc的相對酶活性。圖12表示各種ph下的prldc的相對酶活性。圖13表示ecldc、ppldc、ptldc和pxldc的表達(dá)結(jié)果的sds-page凝膠照片。圖14表示ppldc的將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的反應(yīng)性。圖15表示各種溫度下的ppldc的相對酶活性。圖16表示各種ph下的ppldc的相對酶活性。圖17表示pxldc的將賴氨酸轉(zhuǎn)換為尸胺的反應(yīng)性。圖18表示各種ph下的pxldc的相對酶活性。圖19表示各種溫度下的ecldc和ptldc各自的相對活性。圖20表示各種ph下的ecldc和ptldc各自的相對活性。具體實(shí)施方式下面，通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)說明。但是，這些實(shí)施例用于舉例說明本發(fā)明，而并不是通過這些實(shí)施例來限定本發(fā)明的范圍實(shí)施例1：篩選用于制備尸胺的新型賴氨酸脫羧酶1-1：篩選來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶為了篩選用于應(yīng)用到尸胺制備中的新型賴氨酸脫羧酶，利用由美國國家生物技術(shù)信息中心(ncbi)提供的blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)，來檢索與來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶的活性部位的肽序列具有高相似度的來源于嗜熱菌株的賴氨酸脫羧酶。具體而言，基于以作為來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶的主要氨基酸的第367位賴氨酸為中心，在n-端和c-端分別包含15個(gè)氨基酸的總計(jì)31個(gè)肽序列(grvegkviyetqsthkllaafsqasmihvkg：序列號(hào)12)，進(jìn)行了blast檢索。檢索結(jié)果，確認(rèn)為埃希氏菌(escherichia)、志賀氏菌(shigella)、腸桿菌(enterobacteria)、愛德華氏菌(edwardsiella)、克雷白氏菌(klebsiella)、沙雷氏菌(serratia)、耶爾森菌(yersinia)、約克氏菌(yokenella)、拉烏爾菌(raoultella)、實(shí)蠅菌(ceratitis)、沙門氏菌(salmonella)、薩特氏菌(sutterella)、肥桿菌(shimwellia)、弧菌(vibrio)和假單胞菌(pseudomonas)屬微生物等具有較高的同源性。其中，以探索能夠具有大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶程度的活性的同時(shí)，具有高熱穩(wěn)定性的賴氨酸脫羧酶為目的。一般，由于已知嗜熱菌株內(nèi)存在的蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性較高，因此在探索到的菌株中選擇已知為嗜熱(46～60℃)微生物的耐熱假單胞菌。1-2：篩選來源于多種假單胞菌屬的賴氨酸脫羧酶為了篩選來源于除耐熱假單胞菌菌株以外的其他假單胞菌屬菌株的賴氨酸脫羧酶，選擇假單胞菌種間的同源性較低的四個(gè)菌株(產(chǎn)堿假單胞菌、食樹脂假單胞菌、惡臭假單胞菌、產(chǎn)黃假單胞菌)。利用由美國國家生物技術(shù)信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的核苷酸(nucleotide)和基因組(genome)程序，確認(rèn)來源于上述已選擇的四個(gè)假單胞菌種的賴氨酸脫羧酶的基因和氨基酸序列。下述表1表示關(guān)于分別來源于假單胞菌種的賴氨酸脫羧酶的氨基酸序列同源性。[表1]ptldcpaldcprldcppldcpxldcptldc87％86％81％84％paldc87％89％80％85％prldc86％89％77％83％ppldc81％80％77％84％pxldc84％85％83％84％ptldc：來源于耐熱假單胞菌(p.thermotolerans)的賴氨酸脫羧酶paldc：來源于產(chǎn)堿假單胞菌(p.alcaligenes)的賴氨酸脫羧酶prldc：來源于食樹脂假單胞菌(p.resinovorans)的賴氨酸脫羧酶ppldc：來源于惡臭假單胞菌(p.putida)的賴氨酸脫羧酶pxldc：來源于產(chǎn)黃假單胞菌(p.synxantha)的賴氨酸脫羧酶實(shí)施例2：制備導(dǎo)入了來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌以及分析從該大腸桿菌中表達(dá)的賴氨酸脫羧酶活性2.1：利用來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化進(jìn)行將來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)胫链竽c桿菌中以及用于大腸桿菌中的表達(dá)的重組基因的克隆。從ncbi的基因組(genome)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)數(shù)據(jù)信息中確保關(guān)于耐熱假單胞菌的基因信息。在確保耐熱假單胞菌的基因組(genomic)dna之后，通過以該基因組為模板的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)來擴(kuò)增來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(ptldc)。為了執(zhí)行pcr，利用5_ldc_ndei(aatatacatatgtacaaagacctccaattcccc)(序列號(hào)13)和3_ldc_xhoi(aatatactcgagtcagatcttgatgcagtccaccg)(序列號(hào)14)的引物，并且使用pfuultratmdna聚合酶(stratagene公司，美國)重復(fù)30次94℃：30秒、55℃：30秒及72℃：2分鐘的條件，其結(jié)果確保擴(kuò)增后的ptldc(序列號(hào)2)。此外，為了表達(dá)來源于在n-端具有組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶，作為引物利用5_ldc_bamhi(aatataggatccgtacaaagacctccaattcccc)(序列號(hào)15)和3_ldc_saci(aatatagagctctcagatcttgatgcagtccaccg)(序列號(hào)16)，并且通過與pcr執(zhí)行方法相同的方法執(zhí)行pcr。之后，將從pcr執(zhí)行方法中得到的各ptldc基因分別插入到作為大腸桿菌的表達(dá)載體的pet-deut1中。之后，通過熱沖擊轉(zhuǎn)化方法將克隆有ptldc基因后的質(zhì)粒插入到大腸桿菌rosetta中。利用50ml液體lb培養(yǎng)基(包含50mg/ml氨芐西林)在37℃溫度下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株，在od600值達(dá)到0.8時(shí)加入0.4mm濃度的異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)，并且在18℃下培養(yǎng)48小時(shí)來誘導(dǎo)表達(dá)。通過sds-page凝膠結(jié)果確認(rèn)來源于完成表達(dá)后的各耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(ptldc)(圖2)。通過上述sds-page凝膠結(jié)果，能確認(rèn)低溫下表達(dá)的ptldc和包含有組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的ptldc被過度表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)(圖2的泳道2及4)。將利用包含上述ptldc(序列號(hào)2)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌rosetta菌株命名為“大腸桿菌cc04-0055(escherichiacolicc04-0055)”，并且在2014年7約24日保藏于韓國微生物保藏中心(kccm)并授予保藏號(hào)kccm11559p。2.2：分析在大腸桿菌中表達(dá)的來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性(1)確認(rèn)賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)性為了驗(yàn)證ptldc和包含有組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的ptldc的反應(yīng)性，加入可溶性蛋白質(zhì)(solubleprotein)50ml、100mm磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate,plp)和250mm賴氨酸，并且以200ml的體積在46℃下反應(yīng)兩小時(shí)。反應(yīng)緩沖液使用50mm磷酸鈉(ph6.2)。將導(dǎo)入有空載體的菌株作為對照組(control)分析了賴氨酸和尸胺的量(圖3)。利用高效液相層析法(waters,milford,ma)和2414折光率檢測器(refractiveindesdetector)(waters,milford,ma)來分析賴氨酸和尸胺的準(zhǔn)確量。從西格瑪(st.louis,mo，圣路易斯密蘇里州)購買賴氨酸-hcl試劑和1,5-二氨基戊烷(尸胺)試劑，并利用由1mm檸檬酸、10mm酒石酸、24mm二乙胺和5％乙腈組成的流動(dòng)相(mobilephase)，在ionospherc3-100mm，5mm柱(column)中進(jìn)行分離而對兩物質(zhì)即賴氨酸和尸胺進(jìn)行分離及定量。在對照組的情況下，能確認(rèn)完全沒有生成尸胺。在n-端插入有組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的ptldc的情況下使72％的賴氨酸轉(zhuǎn)換成尸胺，ptldc使100％的賴氨酸轉(zhuǎn)換成尸胺。(2)各溫度及ph下的賴氨酸脫羧酶的活性分析為了識(shí)別ptldc在各種溫度條件(30℃、42℃、50℃、60℃、70℃和80℃)下的酶特性，對相對酶活性(relativeactivity)進(jìn)行了比較。當(dāng)稀釋ptldc之后使用250mm的賴氨酸基質(zhì)在60℃下使其反應(yīng)30分鐘時(shí)，確認(rèn)生成42mm尸胺。此時(shí)，所使用的緩沖液為50mm磷酸鈉緩沖液(ph6.2)，并且在相同量的酶和相同的反應(yīng)條件下僅將溫度設(shè)定為30℃、42℃、50℃、70℃和80℃來分析尸胺的濃度。并且，與在60℃反應(yīng)溫度下生成的尸胺量進(jìn)行相對比較(圖4)。如從圖4中能確認(rèn)那樣，ptldc在60℃下呈現(xiàn)出最高的活性。此外，被評價(jià)為在55～65℃的溫度條件下維持80％以上的活性。進(jìn)一步，進(jìn)行各種ph(6.2、7.0、8.0和9.0)下的賴氨酸脫羧酶的活性評價(jià)。在將溫度條件固定為60℃之后通過同量的酶和相同的反應(yīng)條件且利用50mm磷酸鈉緩沖液(ph6.2)、50mmtris緩沖液(ph7.0)、100mm磷酸鉀緩沖液(ph8.0)和50mmtris緩沖液(ph7.0)在不同ph下進(jìn)行反應(yīng)性比較(圖5)。確認(rèn)ptldc在ph8.0下呈現(xiàn)出最高的活性，但在ph6至ph9的條件下也能維持90％以上的活性。對各ph條件下生成的尸胺量和ph8.0條件下生成的尸胺量進(jìn)行相對比較(圖5)。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果被評價(jià)為ptldc對ph變化或高ph具有較高的穩(wěn)定性。實(shí)施例3：制備導(dǎo)入了來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌以及分析從該大腸桿菌中表達(dá)的賴氨酸脫羧酶活性3-1：利用來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化為了克隆來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(paldc)，利用5_paldc_ndei(aatatacatatgtacaaagacctgaagttccccatcc)(序列號(hào)17)和3_paldc_xhoi(aatatactcgagtcactcccttatgcaatcaacggtatagc)(序列號(hào)18)的引物，并且以純化后的產(chǎn)堿假單胞菌的基因組dna為模板執(zhí)行pcr。作為聚合酶使用pfudna聚合酶，并且重復(fù)30次94℃：30秒、55℃：30秒、72℃：2分鐘的條件而執(zhí)行pcr，其結(jié)果確保擴(kuò)增后的paldc基因(序列號(hào)4)。利用與上述實(shí)施例2-1相同的方法使得到的paldc基因在大腸桿菌中低溫表達(dá)之后，通過sds-page凝膠來確認(rèn)該結(jié)果(圖6)。從圖6可知，來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(paldc)大部分被表達(dá)為不溶性蛋白質(zhì)，在sds-page凝膠上未確認(rèn)到可溶性蛋白質(zhì)(參照圖6的泳道1、2)。3.2：分析在大腸桿菌中表達(dá)的來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性(1)確認(rèn)賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)性為了驗(yàn)證paldc的反應(yīng)性，利用通過使由上述實(shí)施例3-1得到的paldc的細(xì)胞裂解液(celllysate)在13,000rpm下進(jìn)行15分鐘的離心分離而得到的上清液(可溶性蛋白質(zhì))來執(zhí)行賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)。在50mm磷酸鈉(ph6.2)緩沖液中使可溶性蛋白質(zhì)50μl、100mmplp和150mm賴氨酸在46℃下以200μl的反應(yīng)體積反應(yīng)兩小時(shí)。其結(jié)果，能確認(rèn)70％賴氨酸被paldc轉(zhuǎn)換為尸胺(圖7)。(2)各溫度及ph下的賴氨酸脫羧酶的活性分析為了尋找用于來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的最佳溫度條件，利用與實(shí)施例2-2相同的方法在30℃、40℃、46℃和60℃溫度條件下進(jìn)行酶活性的評價(jià)。其結(jié)果，確認(rèn)paldc在50℃下具有最優(yōu)的活性(圖8)。此外，利用與實(shí)施例2-2相同的方法進(jìn)行來源于產(chǎn)堿假單胞菌的賴氨酸脫羧酶在ph下的活性評價(jià)。其結(jié)果，確認(rèn)paldc在ph8及ph9下呈現(xiàn)出高穩(wěn)定性，在ph6下也能維持95％以上的活性(圖9)。實(shí)施例4：制備導(dǎo)入了來源于食樹脂假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌以及分析從該大腸桿菌中表達(dá)的賴氨酸脫羧酶活性4-1：利用來源于食樹脂假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化為了克隆來源于食樹脂假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(prldc)，利用5_prldc_ndei(aatatacatatgtacaaagagctcaagttccccgtcctc)(序列號(hào)19)和3_prldc_xhoi(aatatactcgagttattccctgatgcagtccactgtatagc)(序列號(hào)20)的引物，并且以純化后的食樹脂假單胞菌基因組dna為模板執(zhí)行pcr。能夠利用與實(shí)施例3-1相同的聚合酶和pcr執(zhí)行條件執(zhí)行pcr，以確保擴(kuò)增后的prldc(序列號(hào)6)。利用與上述實(shí)施例2-1相同的方法使得到的prldc基因在大腸桿菌中低溫表達(dá)之后，通過ds-page凝膠來確認(rèn)該結(jié)果(圖6地泳道3、4)。其結(jié)果，確認(rèn)prldc在低溫表達(dá)條件下也幾乎不會(huì)被表達(dá)。4.2：分析在大腸桿菌中表達(dá)的來源于食樹脂假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性(1)確認(rèn)賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)性為了驗(yàn)證來源于食樹脂假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(prldc)的反應(yīng)性，使由上述4-1得到的prldc的細(xì)胞裂解液在13,000rpm下進(jìn)行15分鐘的離心分離并利用上清液執(zhí)行賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)。在50mm磷酸鈉(ph6.2)緩沖液中使可溶性蛋白質(zhì)50μl、100mmplp和250mm賴氨酸在46℃下以200μl的反應(yīng)體積反應(yīng)兩小時(shí)。賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)結(jié)果為通過prldc生成66％尸胺(圖10)。(2)各溫度及ph下的賴氨酸脫羧酶的活性分析為了尋找用于prldc活性的最佳溫度條件，利用與實(shí)施例2-2相同的方法在30℃、40℃、46℃和60℃溫度條件下進(jìn)行酶活性的評價(jià)。其結(jié)果，確認(rèn)prldc在60℃下具有最優(yōu)的活性(圖11)。此外，利用與實(shí)施例2-2相同的方法進(jìn)行prldc在各ph下的活性評價(jià)。其結(jié)果，能確認(rèn)prldc在ph6下呈現(xiàn)出最高的活性，但在ph9下也保持90％以上的活性(圖12)。實(shí)施例5：制備導(dǎo)入了來源于惡臭假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的大腸桿菌以及分析從該大腸桿菌中表達(dá)的賴氨酸脫羧酶活性5-1：利用來源于惡臭假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化為了克隆來源于惡臭假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(ppldc)，利用5_ppldc_ndei(aatatacatatgtacaaagacctccaattcccc)(序列號(hào)21)和3_ppldc_xhoi(aatatactcgagtcactcccttatgcaatcaacggtatagc)(序列號(hào)22)的引物，并且以純化后的惡臭假單胞菌基因組dna為模板執(zhí)行pcr。作為聚合酶使用pfudna聚合酶，并且重復(fù)30次94℃：30秒、55℃：30秒及72℃：2分鐘的條件而執(zhí)行pcr，其結(jié)果確保擴(kuò)增后的ppldc基因(序列號(hào)8)。利用與上述實(shí)施例2-1相同的方法使得到的ppldc基因在大腸桿菌中低溫表達(dá)之后，通過ds-page凝膠來確認(rèn)該結(jié)果(圖13)。從圖13的泳道3及4可知，確認(rèn)來源于惡臭假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(ppldc)在低溫表達(dá)條件下也幾乎不會(huì)被表達(dá)。使細(xì)胞裂解液在13,000rpm下進(jìn)行15中的離心分離并利用上清液執(zhí)行賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)。5.2：分析在大腸桿菌中表達(dá)的來源于惡臭假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性(1)確認(rèn)賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)性為了驗(yàn)證ppldc的反應(yīng)性，使由上述5-1得到的ppldc的細(xì)胞裂解液(celllysate)在13,000rpm下進(jìn)行15分鐘的離心分離并利用上清液執(zhí)行賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)。在50mm磷酸鈉(ph6.2)緩沖液中使可溶性蛋白質(zhì)50μl、100mmplp和250mm賴氨酸在46℃下以200μl的反應(yīng)體積反應(yīng)兩小時(shí)。其結(jié)果，生成16％尸胺(圖14)。(2)各溫度及ph下的賴氨酸脫羧酶的活性分析為了尋找用于ppldc活性的最佳溫度條件，利用與實(shí)施例2-2相同的方法在50℃、60℃和70℃溫度條件下進(jìn)行酶活性的評價(jià)。其結(jié)果，確認(rèn)ppldc在50℃下具有最優(yōu)的活性(圖15)。此外，利用與實(shí)施例2-2相同的方法進(jìn)行ppldc在各ph下的活性評價(jià)。其結(jié)果，ppldc在ph6下呈現(xiàn)出最高的活性，ph越高則反應(yīng)性越低(圖16)。實(shí)施例6：制備導(dǎo)入了來源于產(chǎn)黃假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌以及分析從該大腸桿菌中表達(dá)的賴氨酸脫羧酶6-1：利用來源于產(chǎn)黃假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因?qū)Υ竽c桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化為了克隆來源于產(chǎn)黃假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(pxldc)，利用5_pxldc_ndei(aatatacatatgtacaaagacctccaattcccc)(序列號(hào)23)和3_pxldc_xhoi(aatatactcgagtcactcccttatgcaatcaacggtatagc)(序列號(hào)24)的引物，并且以純化后的產(chǎn)黃假單胞菌基因組dna為模板執(zhí)行pcr。為了基因擴(kuò)增而使用pfudna聚合酶，并且能夠通過重復(fù)30次94℃：30秒、45℃：30秒及72℃：2分鐘的條件來確保擴(kuò)增后的pxldc(序列號(hào)10)。利用與上述實(shí)施例2-1相同的方法使得到的pxldc基因在大腸桿菌中低溫表達(dá)之后，通過sds-page凝膠來確認(rèn)該結(jié)果(圖13)。從圖13的泳道7及8可知，能確認(rèn)來源于產(chǎn)黃假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(pxldc)在低溫表達(dá)條件下被過度表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)。6-2：分析在大腸桿菌中表達(dá)的來源于產(chǎn)黃假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性(1)確認(rèn)pxldc的反應(yīng)性為了驗(yàn)證pxldc的反應(yīng)性，使由上述6-1得到的pxldc的細(xì)胞裂解液在在13,000rpm下進(jìn)行15分鐘的離心分離并利用上清液執(zhí)行賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)。在50mm磷酸鈉(ph6.2)緩沖液中使可溶性蛋白質(zhì)50μl、100mmplp和250mm賴氨酸在46℃下以200μl的反應(yīng)體積反應(yīng)兩小時(shí)。其結(jié)果，生成25％尸胺(圖17)。(2)各ph下的賴氨酸脫羧酶的活性分析為了尋找pxldc的最佳ph條件，利用與實(shí)施例2-2相同的方法進(jìn)行各種ph下的酶活性評價(jià)。其結(jié)果，確認(rèn)pxldc在ph6下呈現(xiàn)出最高的活性，ph越高則反應(yīng)性越低。實(shí)施例7：來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶和來源于耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶的活性比較分析7-1：克隆及表達(dá)來源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶通過克隆作為大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶基因的cada來表達(dá)ecldc(序列號(hào)11)。ptldc和ecldc的氨基酸序列的同源性為36％。將克隆有cada基因的質(zhì)粒插入到大腸桿菌k-12bl21中并在37℃溫度條件下培養(yǎng)四小時(shí)而誘導(dǎo)表達(dá)。通過sds-page凝膠來確認(rèn)表達(dá)結(jié)束后的ecldc的結(jié)果(圖13；泳道1、2)，確認(rèn)ecldc被過度表達(dá)為可溶性蛋白質(zhì)。7-2：ecldc及ptldc的相對酶活性比較分析(1)各溫度下的活性比較利用與實(shí)施例2-2相同的方法，在各種溫度條件(37℃、42℃、50℃、60℃、70℃及80℃)下進(jìn)行ecldc及ptldc的相對酶活性(relativeactivity)比較(圖19)。其結(jié)果，確認(rèn)ecldc及ptldc均在60℃下呈現(xiàn)出最高的活性。被評價(jià)為ecldc在50℃下具有54％的相對活性(將60℃下的ecldc的活性固定為100％)，并且在80℃下具有12％的相對活性。在ptldc的情況下，評價(jià)為在50℃下具有76％的相對活性(將60℃下的ptldc的活性固定為100％)，并且在80℃下具有19％的相對活性。確認(rèn)為在高溫條件下ptldc能夠更好地維持活性。其結(jié)果，該兩種酶均呈現(xiàn)出各溫度下的較大的活性差異，評價(jià)為ptldc能夠更好地維持相對活性。(2)各ph下的活性比較進(jìn)一步，利用與實(shí)施例2-2相同的方法進(jìn)行各種ph(6.2、7.4、8.0和9.0)下的活性評價(jià)(圖20)。其結(jié)果，評價(jià)為ecldc在ph6下呈現(xiàn)出最高的活性，ph越增加則ecldc酶活性越大幅減少。在ph9下ecldc維持50％左右的活性。相反，未觀察到ptldc在ph下的較大的活性變化，能確認(rèn)在ph6.2～9之間的ph下維持90％以上的活性。由此，評價(jià)為ptldc對溫度和ph的穩(wěn)定性比ecldc更高。(3)ptldc和ecldc的活性比較在通過對ptldc和ecldc的蛋白質(zhì)量進(jìn)行定量而評價(jià)特異性活性(specificactivity)(unit/mg)時(shí)，ptldc具有10060(unit/mg)的值，ecldc具有36335(unit/mg)的值。在比較反應(yīng)性時(shí)，ecldc呈現(xiàn)出為ptldc約3.6倍的活性。此外，在比較最佳溫度時(shí)，能確認(rèn)該兩酶均在60℃下進(jìn)行最佳反應(yīng)，并且隨溫度變化而活性大幅降低。但是，在比較最佳ph條件時(shí)，觀察到雖然在ecldc的情況下隨著ph變高而比活度變高，但在ptldc的情況下酶活性相對于ph變化不會(huì)有太大的變化。雖然ecldc具有比ptldc更高的活性，但如果因賴氨酸脫羧酶的反應(yīng)而ph增加，則ecldc的活性有可能因ph變化而受到較大的影響。評價(jià)為ptldc的相對ph穩(wěn)定性比ecldc更高，在賴氨酸轉(zhuǎn)換反應(yīng)中具有有利的方面。此外，雖然在對賴氨酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)換而商業(yè)性地生產(chǎn)尸胺時(shí)，需要通過加酸處理來調(diào)整ph，但評價(jià)為ptldc能夠減輕ph滴定部分，并且該部分在尸胺生物轉(zhuǎn)化中能夠期待降低生產(chǎn)單價(jià)的效果。保藏單位名稱：韓國微生物保藏中心(國外)保藏號(hào)：kccm11559p保藏日期：2014年07月24日<110>cj第一制糖株式會(huì)社<120>新型賴氨酸脫羧酶及利用其制備尸胺的方法<130>px051109<150>kr15/019,732<151>2015-02-09<160>24<170>kopatentin2.0<210>1<211>751<212>prt<213>耐熱假單胞菌<220><221>肽<222>(1)..(751)<223>來自耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶(ptldc)<400>1mettyrlysaspleuglnpheproileleuilevalhisargaspile151015lysalaaspthrvalalaglyasnargvalarggluilealaargglu202530leugluglnaspglyphealaileleuserthralaseralaserglu354045glyargilevalalaserthrhishisglyleualacysileleuval505560alaalagluglyalaglygluasnargserleuleuglnaspvalval65707580gluleuileargvalalaargvalargalaproglnleuproilephe859095alaleuglygluglnvalthrilegluasnalaproalaglualamet100105110alaaspleuasnglnleuargglyleuleutyrleuphegluaspthr115120125valpropheleualaargglnvalalaargalaalaargglytyrleu130135140gluglyleuleuproprophepheargalaleuvalgluhisthrala145150155160glnserasntyrsertrphisthrproglyhisglyglyglyvalala165170175tyrarglysserprovalglyglnalaphehisglnphepheglyglu180185190asnthrleuargseraspleuservalservalprogluleuglyser195200205leuleuasphisthrglyproleualaglualagluthrargalaala210215220argasnpheglyalaasphisthrtyrphevalileasnglythrser225230235240thralaasnlysilevaltrphissermetvalglyargaspaspleu245250255valleuvalaspargasncyshislysserileleuhisalaileile260265270metthrglyalaileproleutyrleucysprogluargasngluleu275280285glyileileglyproileproleuserglupheserlysglualaile290295300glnalalysilealaalaserproleualaargglyarggluproarg305310315320vallysleualavalvalthrasnserthrtyraspglyleucystyr325330335asnalaglumetvallysglnalaleuglyaspservalgluvalleu340345350hispheaspglualatrptyralatyralaalaphehisgluphetyr355360365alaglyargtyrglymetglythrargleuglualaaspserproleu370375380valphealathrhisserthrhislysleuleualaalaphesergln385390395400alasermetilehisvalargaspglyglyserarglysleuasparg405410415tyrargpheasnglualaphemetmethisileserthrserprogln420425430tyrserileleualaserleuaspvalalaseralametmetglugly435440445proalaglyargserleuileglngluthrpheaspglualaleuser450455460pheargargalaleualaasnleuargglnasnleuproalaaspasp465470475480trptrppheaspiletrpglnproproargalaalaglyvalgluglu485490495valalathrargasptrpleuleugluproasnalaglutrphisgly500505510pheglygluvalasnaspasptyrvalleuleuaspprovallysval515520525thrleuvalthrproglyleuseralaglyglyargleuaspgluhis530535540glyileproalaalavalvalserlyspheleutrpgluargglyleu545550555560valvalglulysthrglyleutyrserpheleuvalleuphesermet565570575glyilethrlysglylystrpserthrleuleuthrgluleuleuglu580585590phelysargleutyraspalaasnvalalaleualaglualaleupro595600605serilealaargalaglyglythrargtyralaglymetglyleuarg610615620aspleucysaspgluleuhisalacystyrarggluasnalathrala625630635640lysalaleulysargmettyrthrthrleuprogluvalvalmetlys645650655proalaaspalatyraspargleuvalargglygluvalglualaval660665670proileaspargleugluglyargilealaalavalmetleuvalpro675680685tyrproproglyileproleuilemetproglygluargphethrgln690695700alathrargserileileasptyrleuglyphealaargasppheasp705710715720argargpheproglypheaspalaaspvalhisglyleuglnserglu725730735gluargglyglygluargcystyrthrvalaspcysilelysile740745750<210>2<211>2256<212>dna<213>耐熱假單胞菌<220><221>基因<222>(1)..(2256)<223>來自耐熱假單胞菌的賴氨酸脫羧酶基因(ptldc)<400>2a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