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：1.生物清除劑有機磷化合物(op)對人體具有高毒性。二十世紀三十年代op被首次研制為殺蟲劑，op對人類的極端毒性最終導致其被研制為用于戰(zhàn)爭的神經(jīng)毒劑?，F(xiàn)今，雖然op被國際法普遍禁止，但op被當成不斷增加的軍事和民事威脅。1995年，東京地鐵系統(tǒng)遭到沙林襲擊，造成十幾名乘客死亡，其他數(shù)十人受傷。據(jù)報道，沙林氣體近來已在敘利亞沖突中用于地地導彈，具有致命的效果。諸如沙林的op神經(jīng)毒劑是乙酰膽堿酯酶的有效抑制劑。在脊椎動物中，乙酰膽堿是用于將信號從神經(jīng)系統(tǒng)傳遞到肌肉纖維的神經(jīng)遞質。通常，從神經(jīng)元釋放乙酰膽堿以刺激肌肉。刺激后，乙酰膽堿酯酶代謝乙酰膽堿，使肌肉放松。然而，諸如沙林的op不可逆地抑制乙酰膽堿酯酶，抑制乙酰膽堿的降解。通常非常小劑量的op神經(jīng)毒劑即可致死，對象通常死于某種類型的窒息。接受致死劑量op的對象可能會發(fā)生永久性神經(jīng)損傷。另外，op農藥還在廣泛使用。雖然op農藥的毒性遠遠低于神經(jīng)毒劑，但op農藥對人類的毒性仍然令人擔憂。解毒劑和對op中毒的治療非常有限。對于op中毒癥狀(例如震顫)存在小分子療法。然而，總的來說，這些療法的益處非常有限?？墒┯冒⑼衅酚糜诙巨Aach受體阻斷，施用地西泮用于抽搐的癥狀管理。leee.c.(2003)clinicalmanifestationsofsarinnervegasexposure.j.am.med.assoc.290:659–662。另外，使用2-磷定(2-pam)的肟療法可以有效地重新激活一些op-ache加合物，但不是所有op-ache加合物。cannard,k.(2006)theacutetreatmentofnerveagentexposure.jneurolsci249:86–94。盡管這些療法可以在毒性較小的op(如殺蟲劑或非常低劑量的神經(jīng)毒劑)的情況下降低死亡率，但臨床醫(yī)生通常認為它們對暴露于可能的戰(zhàn)場水平的op神經(jīng)毒劑高度無效。對于預防性抗op治療，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些酶通過作為生物清除劑來解除諸如沙林的op的毒性。當預防性施用乙酰膽堿酯酶(ache)(來源于胎牛血清)，即op不可逆滅活的相同的酶時，能夠保護恒河猴免受甲氟膦酸3,3-二甲基-2-丁基酯(梭曼)的ld50的二倍到五倍的攻擊，梭曼是化學戰(zhàn)爭中設計的高毒性op神經(jīng)毒劑。wolfe,a.d.等人,(1992)useofcholinesterasesaspretreatmentdrugsfortheprotectionofrhesusmonkeysagainstsomantoxicity.toxicol.applpharmacol.117:189-193。ache是羧酸酯酶/膽堿酯酶(ce/che)的成員，ce/che是水解多種羧酸酯的酶的多基因家族。家族成員包括ache、人羧酸酯酶1(hce1)和2(hce2)以及丁酰膽堿酯酶(buche)。其中，人們對buche作為生物清除劑產(chǎn)生了最大的興趣。buche是人血清中主要的膽堿酯酶。雖然充分描述了密切相關的酶ache作為膽堿能傳遞的主要突觸調節(jié)劑，但buche的確定的生理作用尚未得到證實。buche是催化混雜的，不僅水解乙酰膽堿(ach)，而且還水解更長鏈的膽堿酯(例如丁酰膽堿(其優(yōu)選的底物)和琥珀酰膽堿)和各種非膽堿酯，例如乙酰水楊酸(阿司匹林)和可卡因。此外，buche結合大多數(shù)環(huán)境中存在的che抑制劑以及人造op農藥和神經(jīng)毒劑。然而，天然buche的生理可用水平太低，無法針對op給予任何有意義的保護。已使用從人血清純化的buche來治療人類。患者成功接受了部分純化的人buche以抵消肌肉松弛劑和op農藥中毒的作用。cascio,c.等人(1988)theuseofserumcholinesteraseinseverephosphorouspoisoning.minervaanestesiol(italian)54:337-345。然而，由于污染的威脅，非常不希望使用從人血清純化的產(chǎn)品，該未知血源性病原體當然是不能測試的。在這方面，例如，現(xiàn)今通過重組dna技術生產(chǎn)了用于治療血友病的fviii，并且在70年代末和80年代初數(shù)千名患者感染hiv病毒之后，不再從人血清中純化fviii。此外，血清純化的buche的生產(chǎn)受到可用血清體積的限制。lockridge,o.等人，(2005)j.med.chem.biol.radiol.def.3:nimhs5095。為了避免使用血清純化的buche，在大腸桿菌中生產(chǎn)重組buche(rbuche)。masson,p.(1992)inmultidisciplinaryapproachestocholinesterasefunctions,edsshafferman,a.,velan,b.(plenum，紐約)pp49-52。然而，產(chǎn)生的蛋白是無功能的。也可以在哺乳動物293t(altamirano，c.v.和lockridge，o.(1999)chem.biol.interact.119-120:53-60)和cho(millard，c.b.,lockridge，o.，和broomfield，c.a.(1995)biochemistry34:15925-15933)中生產(chǎn)rbuche。然而，哺乳動物表達系統(tǒng)不能產(chǎn)生足夠量的蛋白，使得可以消除對血漿純化的buche的需要。鑒于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)遇到的困難，產(chǎn)生轉基因山羊，其具有在山羊β-酪蛋白啟動子控制下的人buche基因，從而可以從山羊乳中純化產(chǎn)生的rbuche。huang,y.j.等人，(2007)recombinanthumanbutyrylcholinesterasefrommilkoftransgenicanimalstoprotectagainstorganophosphatepoisoning.proc.nat.acad.sci.104(34):13603-13608。然而，當在動物中測試轉基因山羊rbuche時，酶本身以及與peg綴合的酶的pk和生物利用度結果非常令人失望。轉基因山羊中產(chǎn)生的rbuche并不明顯具有與從血漿純化的天然人buche相似的停留時間以使其可以被研制為預防op中毒的藥劑。因此，仍然需要可以被大量生產(chǎn)并具有良好的pk性質的buche重組形式和相關生物清除劑。2.碘乙酰胺綴合由于第一種重組胰島素產(chǎn)品在1982年被批準，蛋白治療劑和肽治療劑已被成功地用作治療各種病理生理學疾病的非常有效的藥物。這些藥物的發(fā)展受到過去幾十年重組dna技術的進步的推動。蛋白治療劑通常分為兩類：(1)模擬天然蛋白并用作替代物的生物藥物，例如胰島素，和(2)用作各種途徑的激動劑或拮抗劑的單克隆抗體，例如雖然蛋白治療劑在疾病改善和銷售方面都取得了巨大的成功，但已觀察到許多治療劑具有次優(yōu)的物理化學性質和藥代動力學性質。蛋白治療劑的主要缺點是物理化學不穩(wěn)定性、溶解度有限、蛋白水解不穩(wěn)定、消除半衰期短、免疫原性和毒性。提高蛋白治療劑的藥代動力學性質的一種方法是蛋白與生物聚合物的綴合。在這方面，迄今為止已經(jīng)批準了十幾種聚乙二醇(peg)綴合物，例如已觀察到蛋白聚乙二醇化的各種益處，包括：改善藥物溶解度、降低劑量頻率而不降低功效且可能降低毒性、延長循環(huán)壽命、增加的藥物穩(wěn)定性以及對蛋白水解降解的抗性更高。還觀察到聚乙二醇化的商業(yè)利益，包括新的遞送形式和給藥方案的機會。此外，由于聚乙二醇化產(chǎn)生新的化學實體，因此存在更多專利保護的機會。歷史上，已經(jīng)開發(fā)了大多數(shù)peg化試劑以利用蛋白上易于獲得的胺官能團。根據(jù)定義氨基存在于所有蛋白質中(即氨基末端)，并且在絕大多數(shù)蛋白中存在多于一個氨基，例如lys貢獻的氨基。胺綴合的peg蛋白已獲得監(jiān)管部門的批準。alconel,s.n.s.,baas,a.s.和maynard,h.d.(2011)fda-approvedpoly(ethyleneglycol)-proteinconjugatedrugs.polym.chem.2(7),1442。至少兩種胺peg蛋白綴合物是一線療法。foster,g.r.(2010)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitisc:pharmacologicalandclinicaldifferencesbetweenpeginterferon-2aandpeginterferon-2b.drugs70(2),147-165；piedmonte,d.m.和treuheit,m.j.(2008)formulationofneulasta(pegfilgrastim).adv.drugdeliveryrev.60,50-58。然而，存在與胺共軛相關的許多問題。特定的與胺綴合的試劑通常是低效的，這是由于試劑(例如peg-n-羥基琥珀酰亞胺酯)的競爭水解反應或亞胺形成過程中的不利平衡，而亞胺形成是還原胺化綴合所必需的。wang,x.,kumar,s.和singh,s.(2011)disulfidescramblinginigg2monoclonalantibodies:insightsfrommoleculardynamicssimulations.pharm.res.28,3128-3143。此外，大多數(shù)蛋白具有可用于反應的幾個胺殘基。因此，胺peg綴合物往往不是位點特異性的，導致最終產(chǎn)物為不同peg-蛋白綴合物的非均勻混合物。veronese,f.(2001)peptideandproteinpegylationareviewofproblemsandsolutions.biomaterials22(5),405-17；luxon,b.a.,grace,m.,brassard,d.,和bordens,r.(2002)pegylatedinterferonsforthetreatmentofchronichepatitiscinfection.clin.ther.24(9)1363-1383。與通過蛋白質氨基的peg綴合相關的各種缺點導致開發(fā)通過半胱氨酸將蛋白peg化的方法。實際上，通過cys的聚合物綴合是今天研究人員采用的主要方法之一。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576；stenzel,m.h.(2012)bioconjugationusingthiols:oldchemistryrediscoveredtoconnectpolymerswithnature’sbuildingblocks.acsmacroletters2,14-18。蛋白質表面游離半胱氨酸的數(shù)量遠低于賴氨酸。如果缺乏游離半胱氨酸，則可以通過基因工程添加一個或多個游離半胱氨酸。goodson,r.j.和katre,n.v.(1990)site-directedpegylationofrecombinantinterleukin-2atitsglycosylationsite.biotechnology8,343-46。已經(jīng)開發(fā)了各種化學物質用于通過半胱氨酸將聚合物與蛋白綴合，包括烷基鹵化物、酯丙烯酸酯和乙烯基砜試劑。但最常見的共軛基團是馬來酰亞胺。roberts,m.j.,bentley,m.d.和harris,j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459。馬來酰亞胺試劑與硫醇基團有效反應以在中性ph下提供綴合物，降低與蛋白變性相關的風險。馬來酰亞胺綴合已用于臨床批準的peg藥物。goel,n.和stephens,s.(2010)certolizumabpegol.mabs2(2),137-47。馬來酰亞胺也被用于一些批準的非peg綴合物中。參見例如gualberto,a.(2012)brentuximabvedotin(sgn-35),anantibody-drugconjugateforthetreatmentofcd30-positivemalignancies.expertopin.invest.drugs21(2),205-16。雖然已經(jīng)批準了幾種基于馬來酰亞胺的產(chǎn)物，但已知一些馬來酰亞胺-硫醇綴合物是不穩(wěn)定的。在這方面，已觀察到基于馬來酰亞胺的綴合物可以進行交換反應。baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2011)tunabledegradationofmaleimide-thioladductsinreducingenvironments.bioconjugatechem.22(10),1946-53；baldwin,a.d.和kiick,k.l.(2012)reversiblemaleimide-thioladductsyieldglutathione-sensitivepoly(ethyleneglycol)-heparinhydrogels.polym.chem.4(1),133。此外，已經(jīng)檢測到有關內源性蛋白的交換產(chǎn)品。alley,s.c.,benjamin,d.r.,jeffrey,s.c.,okeley,n.m.,meyer,d.l.,sanderson,r.j.和senter,p.d.(2008)contributionoflinkerstabilitytotheactivitiesofanticancerimmunoconjugates.bioconjugatechem.19,759-65；shen,b.q.等人，(2012)conjugationsitemodulatestheinvivostabilityandtherapeuticactivityofantibody-drugconjugates.naturebiotechnol.30(2),184-89。由于已知馬來酰亞胺綴合物在某些情況下是不穩(wěn)定的，所以采用了替代綴合策略。roberts,m.j.和harris,b.j.m.(2002)chemistryforpeptideandproteinpegylation.adv.drugdel.rev.54,459-576。這些替代方法之一是使用以下所示的基于碘乙酰胺的綴合劑：peg-碘乙酰胺通過親核取代與游離硫醇反應，產(chǎn)生穩(wěn)定的硫醚鍵。硫醚連接比使用馬來酰亞胺化學制備的相應結構更穩(wěn)定。碘乙酰胺與硫醇的反應對ph具有依賴性。硫醇通常僅以硫醇鹽陰離子形式烷基化。lindley,h.(1960)astudyofthekineticsofthereactionbetweenthiolcompoundsandchloroacetamide.biochem.j.74,577-84。cys中硫醇的pk值一般在8.5+/-0.5左右，但是當硫醇與碘乙酰胺部分綴合時，該pk值取決于天然蛋白中cys的環(huán)境。kallis,g.和holmgren,a.(1980)differentialreactivityofthefunctionalsulfhydrylgroupsofcysteine-32andcysteine-35presentinthereducedformofthioredoxinfromescherichiacoli.j.bio.chem.255(21)10261-10266。kallis和holmgren觀察到具有約8.5的正常pk的cys殘基不容易用碘乙酰胺酰化或在中性ph下不容易用碘乙酸烷基化。僅在升高的ph值下觀察到這些正常硫醇的快速反應。本領域公知將蛋白暴露于高ph值通常導致蛋白變性。暴露于堿性或高ph值的蛋白的變性是高度蛋白依賴性的。幾種蛋白可以暴露于高ph下而不變性。然而，許多是永久變性的，從而導致活性和/或結合能力的喪失。因此，仍然需要在生理ph值下使用碘乙酰胺綴合將聚合物與蛋白綴合的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了綴合物，其包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，并且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op生物清除劑為選自芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)的催化生物清除劑。任選地，op生物清除劑為包含選自乙酰膽堿酯酶(ache)和丁酰膽堿酯酶(bche)的膽堿酯酶的化學計量的op生物清除劑。任選地，膽堿酯酶由血漿純化而來。任選地，膽堿酯酶通過重組dna技術制備。任選地，膽堿酯酶為丁酰膽堿酯酶。任選地，丁酰膽堿酯酶與非丁酰膽堿酯酶蛋白融合為融合蛋白。任選地，非丁酰膽堿酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)結構域。任選地，ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任選地，igg為igg1。任選地，ig結構域為igg-fc(seqidno.8)。任選地，fc結構域在選自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一個或多個位置處具有氨基酸取代。任選地，fc結構域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任選地，fc結構域還具有以下取代中的一種：q347c或l443c。任選地，取代為q347c。任選地，融合蛋白還包含丁酰膽堿酯酶和非丁酰膽堿酯酶蛋白之間的接頭。任選地，接頭選自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)，以及上述接頭的低聚物。任選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任選地，丁酰膽堿酯酶為羧基截短物。任選地，丁酰膽堿酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-561或由其組成。任選地，丁酰膽堿酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其組成。任選地，丁酰膽堿酯酶具有突變，其中seqidno.1的殘基94的c為y。任選地，丁酰膽堿酯酶融合物具有seqidno.2所示的氨基酸序列。在任何上述綴合物中，兩性離子基團可以包含磷酸膽堿。任選地，至少一種類型的單體單元包含2-(丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯。任選地，至少一種類型的單體單元包含2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯(hema-pc)。任選地，聚合物具有3個或更多個臂。任選地，聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。任選地，聚合物具有3、6或9個臂。任選地，綴合物的聚合物部分具有300,000-1,750,000道爾頓的峰值分子量。任選地，綴合物的聚合物部分具有500,000-1,000,000道爾頓的峰值分子量。任選地，綴合物的聚合物部分具有600,000-800,000道爾頓的峰值分子量。任選地，聚合物共價鍵合到所述膽堿酯酶的氨基、羥基、巰基和羧基中的至少一個。任選地，巰基來自膽堿酯酶中的半胱氨酸殘基。任選地，半胱氨酸殘基位于膽堿酯酶中天然無半胱氨酸存在的位置。任選地，膽堿酯酶為對應于seqidno.2的丁酰膽堿酯酶融合物，半胱氨酸殘基為氨基酸672處的半胱氨酸殘基。任選地，丁酰膽堿酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其組成。任選地，殘基94為酪氨酸。任選地，丁酰膽堿酯酶還包含通過重組dna工程引入的半胱氨酸殘基。任選地，根據(jù)權利要求41的丁酰膽堿酯酶包含seqidno.13。本發(fā)明還提供了包含丁酰膽堿酯酶和非丁酰膽堿酯酶蛋白的丁酰膽堿酯酶融合蛋白。任選地，非丁酰膽堿酯酶蛋白包含免疫球蛋白(ig)結構域。任選地，ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。任選地，igg為igg1。任選地，igg1結構域為igg1-fc(seqidno.8)。任選地，fc結構域在選自e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331的一個或多個位置具有氨基酸取代。任選地，fc結構域具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。任選地，fc結構域還具有以下取代之一：q347c或l443c。任選地，取代為q347c。任選地，融合蛋白需要丁酰膽堿酯酶和非丁酰膽堿酯酶蛋白之間的接頭。任選地，接頭選自g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及上述接頭的低聚物。任選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。任選地，丁酰膽堿酯酶為羧基截短物。任選地，丁酰膽堿酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-561或由其組成。任選地，丁酰膽堿酯酶包含seqidno.1的氨基酸29-562或由其組成。任選地，丁酰膽堿酯酶具有突變，其中seqidno.1的殘基94處的c為y。任選地，融合蛋白具有seqidno.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了治療或預防op中毒的方法，其包括向患者施用有效量的任一項前述權利要求中的任何綴合物或融合蛋白。任選地，綴合物通過靜脈內給藥、皮下給藥、肌內給藥、病灶內給藥或皮內給藥來施用。任選地，綴合物通過肌內給藥施用。本發(fā)明還提供了一種針對op中毒進行長期預防的方法，其包括在預期暴露于op化合物前至少7天施用綴合物，所述綴合物包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，并且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op化合物為op農藥或op神經(jīng)毒劑。任選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑之前至少14天施用。任選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑之前至少21天施用。任選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑之前至少30天施用。本發(fā)明還提供了一種用于快速預防op中毒的方法，其包括在預期暴露于op化合物之前至少12小時施用綴合物，所述綴合物包含選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物包含一種或多種類型的單體單元，并且其中至少一種類型的單體單元包含兩性離子基團。任選地，op化合物為op農藥或op神經(jīng)毒劑。任選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑之前至少24小時施用。任何上述方法可以包括施用選自氨基甲酸酯、抗毒蕈堿、膽堿酯酶再激活劑和抗驚厥藥物的另一種藥劑。本發(fā)明還提供了一種用于聚合物合成的引發(fā)劑，其包含其中l(wèi)1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l(wèi)1、l2和l3相同或不同，并且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環(huán)烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-、鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，并且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個堿性基團，其中堿性基團選自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，并且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。任選地，y為br。任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r4、r5和r6各自為任選地，l3為鍵，r2為h，r1為任選地，l2為-(ch2)1-6-。任選地，l2為-(ch2)3-。本發(fā)明還提供了一種聚合方法，其包括：在存在以下物質的條件下聚合一種或多種可自由基聚合的單體：包含可被自由基可轉移原子或基團均勻裂解的鍵的引發(fā)劑；過渡金屬化合物；和選自以下物質的配體：其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；其中所述配體與所述過渡金屬化合物配位，并且其中所述過渡金屬化合物和所述配體匹配以引發(fā)和促進(propagate)所述單體的聚合。任選地，配體與引發(fā)劑共價連接以形成單分子引發(fā)劑配體。任選地，所述單分子引發(fā)劑配體具有以下結構：其中l(wèi)1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l(wèi)1、l2和l3相同或不同，并且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環(huán)烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，并且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個堿性基團，其中堿性基團選自其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，并且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。任選地，y為br。任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r3、r4和r5各自為任選地，r4、r5和r6各自為任選地，l3為鍵，r2為h，r1為任選地，l2為-(ch2)1-6-或-(ch2)3-。任選地，可自由基聚合的單體為烯屬不飽和單體。任選地，不飽和單體包括hema-pc。任選地，過渡金屬為低價態(tài)過渡金屬或與至少一種不帶電配位配體配位的過渡金屬中的一種，并且其中過渡金屬包含抗衡離子。任選地，過渡金屬選自銅、鐵、鎳或釕。附圖說明圖1顯示來源于血漿的hbuche的隨時間變化的活性與儲存在食蟹猴血漿中的下述物質隨著時間變化的活性的對比：來自轉基因山羊乳的全長rhbuche、rbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)。圖2描繪了活性-時間曲線，其中在食蟹猴血漿中在4℃和37℃的條件下將與9臂750kdahema-pc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)與來源于人血漿的buche進行對比。圖3顯示未綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、與3臂500kdampc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)、與9臂750kdampc聚合物綴合的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)以及來源于血漿的hbuche在注入小鼠后隨時間(小時)變化的歸一化活性(個位×106)。圖4顯示了通過碘乙酰胺和馬來酰亞胺與mpc聚合物綴合的來自轉基因山羊乳的全長rhbuche的穩(wěn)定性曲線。圖5顯示了具有改性(r1)碘乙酰胺部分的3臂250kdampc聚合物。詳細描述i.綜述本發(fā)明提供具有親水基團或兩性離子的高分子量(mw)聚合物，例如磷酸膽堿。本發(fā)明還提供了用于制備高分子量聚合物的方法和新的起始物料。本發(fā)明還提供了高分子量聚合物和膽堿酯酶的綴合物。wo2011/130694和wo/2007/100902通過引用并入本文用于所有目的。ii.定義“膽堿酯酶”(che)是指參與神經(jīng)脈沖傳遞的一系列酶。膽堿酯酶催化乙酰膽堿在膽堿能突觸的水解。膽堿酯酶包括但不限于乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶。提及的膽堿酯酶(包括乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶)包括前體膽堿酯酶和成熟膽堿酯酶(例如其中信號序列已被除去的膽堿酯酶)，其具有活性的截短形式，并且包括等位基因變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，包括與引用的seqidno所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的或更高的序列同一性的多肽。變體表現(xiàn)出op滅活活性。膽堿酯酶還包括含有化學修飾或轉錄后修飾的膽堿酯酶，以及不含化學修飾或轉錄后修飾的膽堿酯酶。這些修飾包括但不限于聚乙二醇化、聚(hema-pc)的添加、白蛋白化(albumination)、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化和本領域已知的其他多肽修飾。截短的膽堿酯酶是其任何n-或c-末端縮短形式，特別是被截短并具有op失活活性的形式?！耙阴Ｄ憠A酯酶”(ache)是指能夠水解乙酰酯(包括乙酰膽堿)并且其催化活性被化學抑制劑bw284c51抑制的酶或多肽。乙酰膽堿酯酶包括但不限于來源于血漿的乙酰膽堿酯酶或重組乙酰膽堿酯酶。乙酰膽堿酯酶包括人乙酰膽堿酯酶和任何非人來源的乙酰膽堿酯酶，包括但不限于大鼠乙酰膽堿酯酶、小鼠乙酰膽堿酯酶、貓乙酰膽堿酯酶、雞乙酰膽堿酯酶、兔乙酰膽堿酯酶和牛乙酰膽堿酯酶。示例性人乙酰膽堿酯酶包括seqidno.3所示的人ache。乙酰膽堿酯酶可以是任何形式，包括但不限于單體、二聚體和四聚體形式。“丁酰膽堿酯酶”(buche)是指能夠水解乙酰膽堿和丁酰膽堿并且其催化活性被化學抑制劑四異丙基焦磷酰胺(iso-ompa)抑制的酶或多肽。丁酰膽堿酯酶包括但不限于來源于血漿的丁酰膽堿酯酶或重組丁酰膽堿酯酶。丁酰膽堿酯酶包括任何非人類來源的丁酰膽堿酯酶，其來源包括但不限于大鼠、小鼠、貓、馬、雞、豬、兔和牛。丁酰膽堿酯酶還包括人源的丁酰膽堿酯酶。示例性的人丁酰膽堿酯酶包括seqidno.1所示的人buche。丁酰膽堿酯酶可以是任何形式，包括但不限于單體、二聚體和四聚體形式。在本文中可互換使用的“有機磷化合物”、“有機磷酸酯化合物”、“op化合物”和“op”是指含有磷酰中心并且還含有一個或多個酯鍵的化合物。在一些方面，磷酰中心處的磷酸酯鍵和/或其他共價鍵的類型將有機磷化合物分類。有機磷化合物包括有機磷農藥和有機磷神經(jīng)毒劑。“有機磷神經(jīng)毒劑”、“有機磷酸酯神經(jīng)毒劑”或“op神經(jīng)毒劑”是指例如通過抑制乙酰膽堿酯酶的作用破壞生物體神經(jīng)系統(tǒng)功能的化合物。神經(jīng)毒劑通常通過化學合成制備，且如果被吸入、吸收、攝入或以其他方式遭遇，神經(jīng)毒劑具有高毒性，神經(jīng)毒劑可以是任何有機磷化合物，包括但不限于g型神經(jīng)毒劑和v型神經(jīng)毒劑。示范性有機磷神經(jīng)毒劑包括塔崩(ga)、沙林(gb)、梭曼(gd)、環(huán)沙林(gf)、vx、俄羅斯vx(vr)和分類的非傳統(tǒng)神經(jīng)毒劑(nta)?！坝袡C磷農藥”、“有機磷酸酯農藥”或“op農藥”是指可以用作農藥或殺蟲劑來消滅害蟲和昆蟲的有機磷化合物。有機磷農藥可以是任何有機磷農藥，包括但不限于乙酰甲胺磷、甲基谷硫磷、地散磷、硫線磷、氯氧磷(chlorethoxyfos)、毒死蜱、甲基毒死蜱、蟲螨磷、蠅毒磷、氯亞胺硫磷(dialifor)、二嗪磷(diazinon)、敵敵畏(ddvp)、百治磷(dierotophos)、樂果(dimethoate)、敵殺磷(dioxathion)、乙拌磷(disulfoton)、乙硫磷、滅克磷(ethoprop)、乙基對硫磷(ethylparathion)、克線磷(fenamiphos)、殺螟硫磷(fenitrothion)、倍硫磷(fenthion)、地蟲磷(fonofos)、甲基氯唑磷(isazophosmethyl)、異硫磷(isofenphos)、馬拉硫磷(malathion)、甲胺磷(methamidophos),殺撲磷(methidathion)、甲基對硫磷(methylparathion)、速滅磷(mevinphos)、久效磷(monocrotophos)、二溴磷(naled)、砜吸磷(oxydemetonmethyl)、甲拌磷(phorate)、伏殺磷(phosalone)、亞胺硫磷(phosmet)、磷胺(phosphamidon)、phostebupirim、安定磷(pirimiphosmethyl)、丙溴磷(profenofos)、烯蟲磷(propetamphos)、硫特普(sulfotepp)、硫丙磷(sulprofos)、雙硫磷(temephos)、特丁磷(terbufos)、殺蟲畏(tetraehlorvinphos)、脫葉磷(tribufos,jdef)和敵百蟲(trichlorfon)?！坝袡C磷中毒”或“op中毒”是指對暴露于有機磷化合物(例如有機磷神經(jīng)毒劑或有機磷農藥)的生物的有害或不良影響?！澳憠A能毒性”是指通過神經(jīng)毒劑對乙酰膽堿酯酶的抑制、神經(jīng)遞質乙酰膽堿的積累以及對副交感神經(jīng)、交感神經(jīng)、運動系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的伴隨作用而實現(xiàn)的毒性。膽堿能毒性可導致肌病、精神病、一般麻痹和死亡。暴露癥狀包括抽搐、顫抖、分泌過多、呼吸癱瘓、驚厥、最終死亡?？梢酝ㄟ^測量血漿中的循環(huán)(活性)膽堿酯酶水平來監(jiān)測膽堿能毒性。通常只有當由于神經(jīng)毒劑的結合，膽堿酯酶活性低于正常水平的20％時，才會發(fā)生致死?！坝袡C磷暴露相關損傷”是指例如由于膽堿能毒性對生理功能(如運動功能和認知功能)造成的短期(例如，暴露后幾分鐘至數(shù)小時)和長期(例如，暴露后一周至幾年)損傷。有機磷暴露相關損傷可以由以下臨床癥狀體現(xiàn)，臨床癥狀包括但不限于頭痛、彌漫性肌肉絞痛、虛弱、分泌過多、惡心、嘔吐和腹瀉。病情可能發(fā)展為癲癇發(fā)作、昏迷、麻痹、呼吸衰竭、遲發(fā)性神經(jīng)病、肌肉無力、震顫、驚厥，永久性腦部畸形、社會/行為缺陷和一般膽堿能危象(例如可以通過加重炎癥和低血細胞計數(shù)體現(xiàn))。極端情況可導致中毒患者死亡。“有機磷生物清除劑”或“有機磷酸酯生物清除劑”或“op生物清除劑”是能夠結合或水解有機磷化合物的酶，包括有機磷農藥和有機磷神經(jīng)毒劑。有機磷生物清除劑包括但不限于膽堿酯酶、芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)。有機磷生物清除劑可以是化學計量的有機磷生物清除劑或催化有機磷生物清除劑?！盎瘜W計量的有機磷生物清除劑”或“化學計量的op生物清除劑”是指下述的酶：該酶每個活性位點以1:1的化學計量比與有機磷化合物結合?；瘜W計量的op生物清除劑包括但不限于膽堿酯酶，如乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶?！按呋袡C磷生物清除劑”或“催化op生物清除劑”是指水解有機磷化合物的酶。催化op生物清除劑包括但不限于芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐和二異丙基磷酸酶(dfpases)，上述酶包括引入其中的重組突變以增加其水解op化合物的能力?！胺蓟榛姿崦浮笔侵甘褂袡C磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組酶。芳基二烷基磷酸酶(ec3.1.8.1)是一類能夠水解寬范圍的有機磷化合物的金屬依賴性op水解酶。芳基二烷基磷酸酶需要二價金屬離子(如zn2+、mn2+、co2+或cd2+)來實現(xiàn)其酶活性。芳基二烷基磷酸酶包括但不限于磷酸三酯酶或op水解酶(pte或oph)、對氧磷水解酶或對氧磷酶、對硫磷水解酶(ph)、opda、羧酸酯酶、三酯酶、磷酸三酯酶和芳基酯酶。芳基二烷基磷酸酶包括但不限于來自缺陷假單胞菌(pseudomonasdiminuata)mg、黃桿菌屬(flavobacteriumsp.)、鄰單胞菌屬(plesiomonassp.)菌株m6、變鉛鏈霉菌(streptomyceslividans)和放射性土壤桿菌(agrobacteriumradiobacter)的有機磷酸水解酶；來自伯克霍爾德氏桿菌屬jba3、缺陷假單胞菌mg、缺陷短波單胞菌(brevundiomonasdiminuta)、黃桿菌屬菌株atcc27552和嗜酸熱硫化葉菌(sulfolobusacidocaldarius)的對硫磷水解酶；和來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)wb800以及鄰單胞菌屬菌株m6的甲基對硫磷水解酶(mph)。示例性的芳基二烷基磷酸酶包括但不限于seqidno.5所示的芳基二烷基磷酸酶。提及的芳基二烷基磷酸酶包括芳基二烷基磷酸酶的具有活性的截短形式，并且包括等位基因變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與上述多肽和seqidno.5所示的多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的多肽。變異體顯示op滅活活性。對氧磷酶是指使有機磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組磷酶。對氧磷酶包括但不限于天然或重組對氧磷酶。非人對氧磷酶包括但不限于來自兔、小鼠、大鼠、豬、牛、雞、火雞和狗的對氧磷酶。示例性對氧磷酶包括但不限于人對氧磷酶，包括pon1(seqidno.6)。提及的對氧磷酶包括其具有活性的截短形式，并且包括等位變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與seqidno.6所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。變體表現(xiàn)出op滅活活性。對氧磷酶還包括那些含有化學修飾或翻譯后修飾的對氧磷酶和那些不含化學修飾或翻譯后修飾的對氧磷酶。這樣的修飾包括但不限于聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化和本領域已知的其他多肽修飾?！岸惐姿崦浮笔侵甘褂袡C磷化合物失活或水解的天然存在的酶或重組酶。二異丙基氟磷酸酶包括但不限于從來自歐洲烏賊(loligovulgaris)、交替單胞菌屬(alteromonassp.)、游海假交替單胞菌(pseudoalteromonashaloplanktis)、地中海海單胞菌(marinomonasmediterranea)、加州海兔(aplysiacalifornica)、歐洲章魚(octopusvulgaris)和大鼠衰老標記蛋白30的二異丙基氟磷酸酶；和來自分枝桿菌屬(streptomycessp)、地中海擬無枝酸菌(amycolatopsismediterranei)、天藍色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、鏈霉菌屬(streptomycessp)aa4)、sividus鏈霉菌(streptomycessividus)tk24、sviceus鏈霉菌(streptomycessviceus)和灰霉鏈霉菌(streptomycesgriseoalthiacus)m045的有機磷酸酐水解酶。示例性的二異丙基氟磷酸酶和有機磷酸酐水解酶包括但不限于來自歐洲烏賊的二異丙基氟磷酸酶，其示于seqidno.7。提及的二異丙基氟磷酸酶包括其具有活性的截短形式，并且包括等位變體和物種變體、由剪接變體編碼的變體和其他變體，其他變體包括與seqidno.7所示的多肽具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的多肽。變體表現(xiàn)出op滅活活性?！鞍被姿狨ァ笔侵缸鳛槟憠A酯酶的氨基甲酸酯抑制劑的任何化合物。示例性氨基甲酸酯為溴化吡啶斯的明?！翱苟巨A”是指作為毒蕈堿受體的競爭性拮抗劑的任何化合物，包括毒蕈堿型乙酰膽堿受體。示例性的抗毒蕈堿素是阿托品?！澳憠A酯酶再活化劑”是指從膽堿酯酶釋放結合的有機磷化合物的任何化合物。膽堿酯酶再活化劑包括膽堿再活化肟，包括吡啶鎓和雙吡啶鎓乙醛肟，包括但不限于磷定、雙解磷(trimedoxime)、雙復磷(obidoxime)和hi-6、甲肟和地西泮?！翱贵@厥”是指防止或逆轉癲癇的任何化合物?！熬Y合物”是指直接或間接連接至一個或多個化學部分(如聚合物)的多肽?！叭诤系鞍住笔侵赣砂瑏碜砸粋€核酸分子的編碼序列和來自另一核酸分子的編碼序列的核酸序列編碼的多肽，其中編碼序列在相同的閱讀框中，使得當融合構建體在宿主細胞中轉錄并翻譯時，產(chǎn)生含有兩種蛋白質的蛋白質。兩個分子可以在構建體中相鄰或由包含1、2、3或更多但通常少于25、20、15、10、9、8、7或6個氨基酸的接頭多肽分離。由融合構建體編碼的蛋白質產(chǎn)物稱為融合多肽或蛋白質。融合蛋白可以具有在兩種蛋白質之間連接的肽或蛋白質?！鞍胨テ凇被颉跋胨テ凇被颉皌1/2”是指任何指定的性質或活性減少一半所需的時間。例如，半衰期是指物質(例如有機磷生物清除劑)失去其原始水平的活性的一半所花費的時間。因此，可以通過測量血漿中物質的活性來確定半衰期，或者可以通過測量血漿中物質的血漿水平來確定半衰期。例如，半衰期可以被確定為通過各種身體過程將藥物減少到身體內原始水平的一半所需的時間。半衰期越長，物質或藥物從身體中清除的時間越長。半衰期的單位通常為時間單位，如小時、分鐘或天?！拔铡笔侵杆幬镞M入血流中的運動。“生物利用度”是指達到體循環(huán)的藥物的給藥劑量的分數(shù)。生物利用度是藥物吸收到血流中的函數(shù)?！皠┝俊笔侵赋鲇谥委熁蝾A防目的向個體施用的藥物的量或數(shù)量?！昂怂帷卑╠na、rna及其類似物，包括肽核酸(pna)及其混合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的。當涉及任選地標記的探針或引物(例如具有可檢測標記，例如熒光或放射性標記)時，可考慮單鏈分子。這樣的分子通常具有這樣的長度，使得它們的靶標在統(tǒng)計學上是唯一的或具有低拷貝數(shù)(通常小于5，一般小于3)以探測或引發(fā)文庫。通常，探針或引物含有與感興趣的基因互補或相同的序列的至少14、16或30個連續(xù)核苷酸。探針和引物的長度可以為10、20、30、50、100或更多的核酸?！岸嚯慕宇^”或“接頭”是包含通過肽鍵連接的兩個或多個氨基酸殘基的多肽，其用于連接兩個多肽(例如，vh和vl結構域或vh結構域和細胞外陷阱區(qū)段)。這樣的接頭多肽的實例是本領域公知的(參見例如holliger等人(1993)proc.natl.acad.sci.usa90:6444-6448；poljak等人(1994)structure2:1121-1123)。示例性的接頭包括g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)和這些接頭的寡聚體(例如，ggggsggggs(seqidno.4)和ggggsggggsggggsggggsg(seqidno.26))?！熬酆衔铩笔侵高B接在一起的一系列單體基團。高分子量聚合物由包括但不限于丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、苯乙烯、乙烯基吡啶、乙烯基吡咯烷酮和乙烯基酯(如乙酸乙烯酯)的單體制備。其他的單體可用于本發(fā)明的高分子量聚合物。當使用兩種不同的單體類型時，兩種單體類稱型為“共聚單體”，這意味著不同單體類型共聚形成單一聚合物。聚合物可以是直鏈或支鏈的。當聚合物為支鏈聚合物時，每個聚合物鏈被稱為“聚合物臂”。與引發(fā)劑部分連接的聚合物臂的末端是近端，聚合物臂的生長鏈末端是遠端。在聚合物臂的生長鏈端上，聚合物臂端基可以是自由基清除劑或另一種基團?！耙l(fā)劑”是指能夠引發(fā)使用單體或共聚單體的聚合反應的化合物。聚合可以是常規(guī)的自由基聚合或優(yōu)選的受控/“活性(living)”自由基聚合，例如原子轉移自由基聚合(atrp)、可逆加成斷裂終止(raft)聚合或硝基氧介導聚合(nmp)。聚合可以是“假”受控聚合，例如退化轉移。當引發(fā)劑適用于atrp時，其包含可以被均一裂解以形成引發(fā)劑片段i和自由基清除劑i'的不穩(wěn)定鍵，i是能夠引發(fā)自由基聚合的自由基，i'與生長的聚合物鏈的自由基反應從而可逆地終止聚合。自由基清除劑i'通常是鹵素，但也可以是有機部分，例如腈。“接頭”是指將兩個基團連接在一起的化學部分。接頭可以是可裂解的或不可裂解的?？闪呀饨宇^可以是可水解接頭、可酶促裂解接頭、ph敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭或二硫化物接頭等。其他接頭包括同雙功能和異雙功能接頭。“連接基團”是能夠與生物活性劑形成由一個或多個鍵組成的共價連接的官能團。非限制性實例包括表1中所示的那些。本文所用的術語“反應性基團”是指能夠與另一個化學基團反應形成共價鍵的基團，即在合適的反應條件下具有共價反應性，通常代表與另一種物質的連接點。反應性基團是本發(fā)明化合物上的部分，例如馬來酰亞胺或琥珀酰亞胺酯，其能夠與不同化合物上的官能團進行化學反應以形成共價鍵。反應性基團通常包括親核體、親電體和可光活化基團。“功能劑”被定義為包括生物活性劑或診斷劑?！吧锘钚詣北欢x為包括靶向特定生物學位置(靶向劑)和/或提供可在體內或體外證明的一些局部或全身生理或藥理作用的任何藥劑、藥物、化合物或其混合物。非限制性實例包括藥物、疫苗、抗體、抗體片段、scfv、雙抗體、高親和性多聚體(avimers)、維生素和輔因子、多糖、碳水化合物、類固醇、脂質、脂肪、蛋白質、肽、多肽、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸和核酸(例如mrna、trna、snrna、rnai、dna、cdna、反義構建體、核酶等)。“診斷劑”被定義為包括能夠檢測或成像組織或疾病的任何試劑。診斷劑的實例包括但不限于放射性標記、熒光團和染料?！爸委熜缘鞍踪|”是指包括其全部或部分構成藥物的氨基酸序列并可用于人或動物藥物應用的肽或蛋白質，而不管長度如何。許多治療性蛋白質是已知的，包括但不限于本文公開的那些?！傲柞Ｄ憠A”也稱為“pc”，是指以下結構：其中*表示連接點。“含磷酰膽堿的聚合物”是含有磷酰膽堿的聚合物?！昂瑑尚噪x子的聚合物”是指含有兩性離子的聚合物。含有聚(丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿)的聚合物是指含有2-(丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基銨)乙基磷酸酯作為單體的聚合物。含有聚(甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿)的聚合物是指含有2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2-(三甲基銨)乙基磷酸酯作為單體的聚合物。通過引用特定單體類型定義的聚合物可以是均聚物，即僅存在指定類型的單體，或共聚物，在這種情況下，指定類型的單體與其他單體類型一起存在。如果優(yōu)選共聚物，至少50％、75％或90％的單體分子為所述指定類型的。聚合物上下文中的“分子量”可以表示為數(shù)均分子量或重均分子量或峰值分子量。除非另有說明，本文中所有提到的分子量都是指峰值分子量?？梢允褂贸叽缗抛枭V法或其他液相色譜技術測定這些分子量，即數(shù)均分子量(mn)、重均分子量(mw)和峰值(mp)分子量。還可以使用其他測量分子量值的方法，例如使用端基分析或測定依數(shù)性性質(如凝固點下降、沸點升高或滲透壓)以確定數(shù)均分子量，或使用光散射技術、超速離心或粘度測定來確定重均分子量。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，通過sec-mals(尺寸排阻色譜法-多角度光散射)測量分子量。本發(fā)明的聚合物試劑通常是多分散的(即聚合物的數(shù)均分子量和重均分子量不相等)，優(yōu)選具有例如按照凝膠滲透色譜法測定的小于約1.5的低多分散指數(shù)(pdi)值。在其他實施方案中，多分散性更優(yōu)選約1.4至約1.2，更優(yōu)選小于約1.15，更加優(yōu)選小于約1.10，還更優(yōu)選小于約1.05，最優(yōu)選地小于1.03。本文所用的短語“一種(“a”或“an”)”實體是指一種或多種那個實體；例如，一種化合物是指一種或多種化合物或至少一種化合物。因此，術語一種(“a”或“an”)、“一種或多種”和“至少一種”在本文中可以互換使用。本文所用的“約”是指在使用不同儀器、樣品和樣品制備進行的測量中可能看到的變化?！氨槐Ｗo的”、“被保護的形式”、“保護基團”和“保護性基團”是指存在防止或阻止分子中特定的化學反應性官能團在某些反應條件下反應的基團(即，保護基團)。保護基團根據(jù)被保護的化學反應性基團的類型以及將要使用的反應條件和分子中存在其他的反應性或保護基團而變化(如果存在的話)。合適的保護基團包括諸如greene等人,“protectivegroupsinorganicsynthesis,”第三版,johnwiley和sons,inc.,紐約,1999論文中發(fā)現(xiàn)的那些?！巴榛笔侵妇哂兄付ㄌ荚訑?shù)的直鏈或支鏈的、飽和的、脂族基團。例如，c1-c6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、己基等。其他烷基包括但不限于庚基、辛基、壬基、癸基等。烷基可以包括任何數(shù)量的碳，例如1-2,1-3,1-4,1-5,1-6,1-7,1-8,1-9,1-10,2-3,2-4,2-5,2-6,3-4,3-5,3-6,4-5,4-6和5-6。烷基通常是一價的，但可以是二價的，例如當烷基連接兩個部分時其為二價的。上文和下文中與有機基團或化合物有關的術語“低級”分別定義了可以具有多達7個并包括7個，優(yōu)選多達4個并包括4個和(作為非支鏈的)一個或兩個碳原子的支鏈或非支鏈的化合物或基團。“亞烷基”是指如上定義的連接至少兩個其他基團的烷基，即二價烴基。與亞烷基連接的兩個部分可以連接到亞烷基的相同原子或不同原子。例如，直鏈亞烷基可以是二價基團(ch2)n，其中n為1、2、3、4、5或6。亞烷基包括但不限于亞甲基、亞乙基、亞丙基、亞異丙基、亞丁基、亞異丁基、亞仲丁基、亞戊基和亞己基。烷基和雜烷基(包括通常稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團)的取代基可以是選自以下的各種基團：-or’、＝o、＝nr’、＝n-or’、-nr’r”、-sr’、-鹵素、-sir’r”r”’、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr’-c(o)nr”r”’、-nr”c(o)2r’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-cn和-no2，其數(shù)量范圍為0至(2m’+1)，其中m'為這種基團中碳原子的總數(shù)。r’、r”和r”’各自獨立地表示氫、未取代的(c1-c8)烷基和雜烷基、未取代的芳基、被1-3個鹵素取代的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基(c1-c4)烷基。當r’和r”連接到相同的氮原子時，它們可以與氮原子結合形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。例如，nr’r”意在包括1-吡咯烷基和4-嗎啉基。術語“烷基”包括諸如鹵代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和酰基(例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)的基團。優(yōu)選地，取代的烷基和雜烷基具有1-4個取代基，更優(yōu)選1、2或3個取代基。例外是那些全鹵代烷基(例如五氟乙基等)，其也是本發(fā)明所優(yōu)選和預期的。烷基和雜烷基(包括通常稱為亞烷基、烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基的那些基團)的取代基可以是選自以下的多種基團：-or’、＝o、＝nr’、＝n-or’、-nr’r”、-sr’、-鹵素、-sir’r”r”’、-oc(o)r’、-c(o)r’、-co2r’、-conr’r”、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr’-c(o)nr”r”’、-nr”c(o)2r’、-nr-c(nr’r”r’”)＝nr””、-nr-c(nr’r”)＝nr’”、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-nrso2r’、-cn和-no2，其數(shù)量范圍為0至(2m’+1)，其中m'為這種基團中碳原子的總數(shù)。r’、r”、r”’和r””各自獨立地表示氫、取代或未取代的雜烷基，取代或未取代的芳基，例如被1-3個鹵素取代的芳基，取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。當本發(fā)明的化合物包含多于一個r基團時，例如，當存在這些基團中的多于一個時，每個r基團各自獨立地選自r’、r”、r”’和r””基團。當r’和r”連接到相同的氮原子時，它們可以與氮原子結合形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。例如，nr’r”意在包括但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。術語“烷基”包括與氫基以外的基團結合的碳原子，例如鹵代烷基(例如-cf3和-ch2cf3)和?；?例如-c(o)ch3、-c(o)cf3、-c(o)ch2och3等)?！巴檠趸笔侵妇哂醒踉拥耐榛?，該氧原子將烷氧基連接到連接點或被連接到烷氧基的兩個碳原子。烷氧基包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、2-丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、己氧基等。烷氧基可進一步被本文所述的各種取代基取代。例如，烷氧基可被鹵素取代以形成“鹵代烷氧基”基團?！棒然榛笔侵副霍然〈耐榛?如本文所定義)。術語“羧基環(huán)烷基”是指被羧基取代的環(huán)烷基(如本文所定義)。術語烷氧基烷基是指被烷氧基取代的烷基(如本文所定義)。本文所用的術語“羧基”是指羧酸及其酯?！胞u代烷基”是指如上定義的烷基，其中一些或全部氫原子被鹵素原子取代。鹵素(鹵素)優(yōu)選表示氯或氟，但也可以是溴或碘。例如，鹵代烷基包括三氟甲基、氟甲基、1,2,3,4,5-五氟苯基等。術語“全氟”定義了所有可用氫被氟取代的化合物或基團。例如，全氟苯基是指1,2,3,4,5-五氟苯基，全氟甲基是指1,1,1-三氟甲基，全氟甲氧基是指1,1,1-三氟甲氧基?！胺〈耐榛笔侵钙渲幸粋€、一些或全部氫原子被氟代替的烷基?！碍h(huán)烷基”是指含有約3-12個、3-10個或3-7個環(huán)內碳原子的環(huán)狀烴基。環(huán)烷基包括稠合結構、橋環(huán)結構和螺環(huán)結構?！碍h(huán)內”是指構成部分環(huán)狀結構的原子或原子團?！碍h(huán)外”是指與環(huán)狀結構連接但不限定環(huán)狀結構的原子或原子團?！碍h(huán)烷基醚”是指具有3或4個環(huán)內碳原子和1個環(huán)內氧原子或硫原子的4元或5元環(huán)狀烷基(例如氧雜環(huán)丁烷、硫雜環(huán)丁烷、四氫呋喃、四氫噻吩)；或具有1或2個環(huán)內氧原子或硫原子的6-7元環(huán)狀烷基(例如，四氫吡喃、1,3-二噁烷、1,4-二噁烷、四氫噻喃、1,3-二噻烷、1,4-二噻烷、1,4-氧硫雜環(huán)戊烷)?！跋┗笔侵妇哂兄辽僖粋€雙鍵的2-6個碳原子的直鏈或支鏈烴。烯基的實例包括但不限于乙烯基、丙烯基、異丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、異丁烯基、丁二烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、異戊烯基、1,3-戊二烯基、1,4-戊二烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、1,3-己二烯基、1,4-己二烯基、1,5-己二烯基、2,4-己二烯基或1,3,5-己三烯基。烯基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6個碳。烯基通常是一價的，但可以是二價的，例如當烯基將兩個部分連接在一起時，其為二價的?！皝喯┗笔侵高B接至少兩個其他基團的如上定義的烯基，即二價烴基。與亞烯基連接的兩個部分可以連接到亞烯基的相同原子或不同的原子。亞烯基包括但不限于亞乙烯基、亞丙烯基、亞異丙烯基、亞丁烯基、亞異丁烯基、亞仲丁烯基、亞戊烯基和亞己烯基?！叭不笔侵妇哂兄辽僖粋€三鍵的、2-6個碳原子的直鏈或支鏈烴基。炔基的實例包括但不限于乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、異丁炔基、仲丁炔基、丁二炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、異戊炔基、1,3-戊二炔、1,4-戊二炔基、1-己炔基、2-己炔基、3-己炔基、1,3-己二炔基、1,4-己二炔基、1,5-己二炔基、2,4-己二炔基或1,3,5-己三炔。炔基也可以具有2-3、2-4、2-5、3-4、3-5、3-6、4-5、4-6和5-6個碳。炔基通常是一價的，但可以是二價的，例如當炔基將兩個部分連接在一起時，其為二價的?！皝喨不笔侵高B接至少兩個其他基團的如上所定義的炔基，即二價烴基。與亞炔基連接的兩個部分可以連接到亞炔基的相同原子或不同的原子。亞炔基包括但不限于亞乙炔基、亞丙炔基、亞丁炔基、亞仲丁炔基、亞戊炔基和亞己炔基?！碍h(huán)烷基”是指含有3-12個環(huán)原子或指定數(shù)目的原子的飽和或部分不飽和的單環(huán)、稠合雙環(huán)或橋連多環(huán)組合。單環(huán)包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)辛基。雙環(huán)和多環(huán)包括例如降冰片烷、十氫萘和金剛烷。例如，c3-8環(huán)烷基包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)辛基和降冰片烷?！皝啳h(huán)烷基”是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的環(huán)烷基，即二價烴基。與亞環(huán)烷基連接的兩個部分可以連接到亞環(huán)烷基的相同原子或不同原子。亞環(huán)烷基包括但不限于亞環(huán)丙基、亞環(huán)丁基、亞環(huán)戊基、亞環(huán)己基和亞環(huán)辛基?！半s環(huán)烷基”是指具有3個環(huán)成員至約20個環(huán)成員和1至約5個諸如n、o和s雜原子的環(huán)系。也可以使用其他雜原子，包括但不限于，b、al、si和p。這些雜原子也可被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)2-。例如，雜環(huán)包括但不限于四氫呋喃基、四氫噻吩基、嗎啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、哌啶基、二氫吲哚基、奎寧環(huán)基和1,4-二氧雜-8-氮雜螺[4.5]-8-癸基?！皝嗠s環(huán)烷基”是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的雜環(huán)烷基。連接到亞雜環(huán)烷基的兩個部分可以連接到亞雜環(huán)烷基的相同原子或不同原子?！胺蓟笔侵负?-16個環(huán)碳原子的單環(huán)或稠合雙環(huán)、三環(huán)或更大的芳族環(huán)組合。例如，芳基可以是苯基、芐基或萘基，優(yōu)選苯基?！皝喎蓟笔侵秆苌苑蓟亩r基團。芳基可以是被一個、兩個或三個下述基團單取代、二取代或三取代的芳基：烷基、烷氧基、芳基、羥基、鹵素、氰基、氨基、氨基烷基、三氟甲基、亞烷基二氧和氧-c2-c3亞烷基。所有這些都可以任選地進一步被取代，例如如上所定義；或1-萘基或2-萘基；或1-菲基或2-菲基。亞烷基二氧基是連接到苯基的兩個相鄰碳原子的二價取代基，例如亞甲二氧或亞乙二氧。氧-c2-c3-亞烷基也是連接到苯基的兩個相鄰碳原子的二價取代基，例如，氧亞乙基或氧亞丙基。氧-c2-c3亞烷基苯基的實例是2,3-二氫苯并呋喃-5-基。優(yōu)選芳基為萘基、苯基或被下述基團單取代或二取代的苯基：烷氧基、苯基、鹵素、烷基或三氟甲基，特別為苯基或被烷氧基、鹵素或三氟甲基單取代或二取代的苯基，尤其為苯基。作為r的、取代的苯基的實例是例如4-氯苯-1-基、3,4-二氯苯-1-基、4-甲氧基苯-1-基、4-甲基苯-1-基、4-氨基甲基苯-1-基、4-甲氧基乙基氨基甲基苯-1-基、4-羥乙基氨基甲基苯-1-基、4-羥乙基-(甲基)-氨基甲基苯-1-基、3-氨基甲基苯-1-基、4-n-乙酰氨基甲基苯-1-基、4-氨基苯-1-基、3氨基苯-1-基、2-氨基苯-1-基、4-苯基苯-1-基、4(咪唑-1-基)苯基、4-(咪唑-1-基甲基)苯-1-基、4(嗎啉-1-基)苯-1-基、4-(嗎啉-1-基甲基)苯-1-基、4-(2-甲氧基乙基氨基甲基)苯-1-基和4-(吡咯烷-1-基甲基)苯-1-基、4-(噻吩基)苯-1-基、4-(3-噻吩基)苯-1-基、4(4-甲基哌嗪-1-基)苯-1-基和4-(哌啶基)苯基和4-(吡啶基)苯基，上述基團任選地在雜環(huán)上取代?！皝喎蓟笔侵高B接至少兩個其他基團的如上所定義的芳基。與亞芳基連接的兩個部分連接到亞芳基的不同原子上。亞芳基包括但不限于亞苯基。“亞芳基氧”是指如上定義的亞芳基，其中與亞芳基連接的部分之一通過氧原子連接。亞芳基氧包括但不限于亞苯基基。類似地，芳基和雜芳基的取代基是變化的并且選自：-鹵素、-or’、-oc(o)r’、-nr’r”、-sr’、-r’、-cn、-no2、-co2r’、-conr’r”、-c(o)r’、-oc(o)nr’r”、-nr”c(o)r’、-nr”c(o)2r’、,-nr’-c(o)nr”r”’、-nh-c(nh2)＝nh、-nr’c(nh2)＝nh、-nh-c(nh2)＝nr’、-s(o)r’、-s(o)2r’、-s(o)2nr’r”、-n3、-ch(苯基)2、全氟(c1-c4)烷氧基和全氟(c1-c4)烷基，其數(shù)量范圍為0至芳族環(huán)系上的開放化合價總數(shù)；并且其中r’、r”和r”’獨立地選自氫、(c1-c8)烷基和雜烷基、未取代的芳基和雜芳基、(未取代的芳基)(c1-c4)烷基和(未取代的芳基)氧(c1-c4)烷基。芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-t-c(o)(ch2)q-u-的取代基取代，其中t和u獨立地是-nh-、-o-、-ch2或單鍵，并且q是0-2的整數(shù)?；蛘撸蓟螂s芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可以任選地被式-a-(ch2)rb的取代基取代，其中a和b獨立地是-ch2-、-o-、-nh-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、-s(o)2nr’-或單鍵，r是1-3的整數(shù)。如此形成的環(huán)的單鍵之一可任選地被雙鍵替代?；蛘?，芳基或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-(ch2)s-x-(ch2)t-的取代基取代，其中s和t獨立地為0-3的整數(shù)，x是-o-、-nr’-、-s-、-s(o)-、-s(o)2-、or-s(o)2nr’-。nr'和s(o)2nr'中的取代基r'選自氫或未取代的(c1-c6)烷基?！半s芳基”是指含有5-16個環(huán)原子的單環(huán)或稠合雙環(huán)或三環(huán)芳環(huán)，其中1-4個環(huán)原子是n、o或s的雜原子。例如，雜芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、異喹啉基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、呋喃基、吡咯基、噻唑基、苯并噻唑基、噁唑基、異唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基，或被烷基、硝基或鹵素取代的，特別是單取代或二取代的，任意其他基團。吡啶基表示2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基，有利的是2-吡啶基或3-吡啶基。噻吩基表示2-噻吩基或3-噻吩基。喹啉基優(yōu)選表示2-喹啉基、3-喹啉基或4-喹啉基。異喹啉基優(yōu)選表示1-異喹啉基、3-異喹啉基或4-異喹啉基。苯并吡喃基、苯并噻喃基優(yōu)選分別表示3-苯并吡喃基或3-苯并噻喃基。噻唑基優(yōu)選表示2-噻唑基或4-噻唑基，最優(yōu)選4-噻唑基。三唑基優(yōu)選為1-(1,2,4-三唑基)、2-(1,2,4-三唑基)或5-(1,2,4-三唑基)。四唑基優(yōu)選為5-四唑基。優(yōu)選地，雜芳基是吡啶基、吲哚基、喹啉基、吡咯基、噻唑基、異噁唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、呋喃基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、異喹啉基、苯并噻吩基、噁唑基、吲唑基，或取代的(特別是單取代或二取代)的任意所述基團。如本文所用，術語“雜烷基”是指具有1-3個諸如n、o和s雜原子的烷基。也可以使用其他雜原子，包括但不限于b、al、si和p。雜原子也可以被氧化，例如但不限于-s(o)-和-s(o)2-。例如，雜烷基可以包括醚、硫醚、烷基胺和烷基硫醇。如本文所用，術語“雜亞烷基”是指連接至少兩個其他基團的如上所定義的雜烷基。與雜亞烷基連接的兩個部分可以連接到雜亞烷基的相同原子或不同原子?！坝H電體”是指具有親電中心(即尋找電子的、能夠與親核體反應的中心)的離子或原子或可以是離子性的原子集合。親電體(或親電試劑)是通過接受來自反應配偶體(親核體)的兩個成鍵電子而與反應配偶體形成鍵的試劑。“親核體”是指具有親核中心(即尋找親電中心的或能夠與親電體反應的中心)的離子或原子或可以是離子性的原子集合。親核體(或親核試劑)是通過供給兩個成鍵電子而與其反應配偶體(親電體)形成鍵的試劑?！坝H核基團”是指與反應性基團反應后的親核體。非限制性實例包括氨基、羥基、烷氧基、鹵代烷氧基等。“馬來酰亞胺基”是指具有以下結構的吡咯-2,5-二酮-1-基：其與巰基(例如硫代烷基)反應時形成具有以下結構的-s-馬來酰亞胺基，其中“·”表示馬來酰亞胺基團的連接點，表示硫醇的硫原子與原始的具有巰基的基團的剩余部分的連接點。對于本發(fā)明的目的，蛋白質和多肽中發(fā)現(xiàn)的“天然存在的氨基酸”是l-丙氨酸、l-精氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸、l-谷氨酰胺、l-谷氨酸、l-甘氨酸、l-組氨酸、l-異亮氨酸、l-亮氨酸、l-賴氨酸、l-甲硫氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、l-蘇氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸和/或l-纈氨酸。在蛋白質中發(fā)現(xiàn)的“非天然存在的氨基酸”是除了作為天然存在的氨基酸所記載的氨基酸之外的任何氨基酸。非天然存在的氨基酸包括但不限于天然存在的氨基酸的d異構體(混合物會被更準確地描述為一些天然氨基酸和一些非天然氨基酸)。雖然在天然存在的蛋白質中發(fā)現(xiàn)了其他氨基酸，如4-羥脯氨酸、鎖鏈素、異鎖鏈素、5-羥基賴氨酸、ε-n-甲基賴氨酸、3-甲基組氨酸，但為了本發(fā)明的目的，將其認為是蛋白質中發(fā)現(xiàn)的非天然存在的氨基酸，因為它們通常通過mrna的核糖體翻譯之外的方式引入。“線性”與聚合物的幾何結構、架構或整體結構有關，其是指具有單個聚合物臂的聚合物。“支鏈的”與聚合物的幾何結構、架構或整體結構有關，其是指具有從引發(fā)劑延伸的2個或更多個聚合物“臂”的聚合物。引發(fā)劑可以用于原子轉移自由基聚合(atrp)反應。支鏈聚合物可以具有2個聚合物鏈(臂)、3個聚合物臂、4個聚合物臂、5個聚合物臂、6個聚合物臂、7個聚合物臂、8個聚合物臂、9個聚合物臂、10個聚合物臂、11個聚合物臂、12個聚合物臂或更多。每個聚合物臂從聚合物引發(fā)位點延伸。每個聚合物引發(fā)位點都能夠作為通過添加單體實現(xiàn)聚合物鏈生長的位點。例如但不限于使用atrp，引發(fā)劑上的每個聚合物引發(fā)位點通常是經(jīng)歷由過渡金屬化合物(如鹵化亞銅)催化的可逆的氧化還原過程的有機鹵化物。優(yōu)選地，鹵化物是溴化物。“藥學上可接受的”組合物或“藥物組合物”是指包含本發(fā)明化合物和一種或多種藥學上可接受的賦形劑的組合物。“藥學上可接受的賦形劑”和“藥學上可接受的載體”是指可以包括在本發(fā)明的組合物中的、對患者沒有引起顯著的不良毒理作用的并被fda批準或可批準用于治療用途(特別是對人的治療用途)的賦形劑。藥學上可接受的賦形劑的非限制性實例包括水、nacl、生理鹽水溶液、乳酸林格氏素、標準蔗糖、標準葡萄糖等。“患者”或“有需要的個體”是指患有或易于患有可通過施用本文提供的藥物組合物預防或治療的病癥的活生物體。非限制性實例包括人、其他哺乳動物和其他非哺乳動物。綴合物優(yōu)選以分離形式提供。分離意味著目標物質至少部分地從與其天然相關污染物或在其制造中使用的污染物分離，但不一定排除旨在與分離的物質聯(lián)合起作用的其他成分的存在，例如藥用賦形劑。優(yōu)選地，綴合物是存在于組合物樣品中的主要大分子物質(即以摩爾為基準)，并且通常包含存在的所有大分子物質的至少約50％(基于摩爾數(shù))。通常，分離的綴合物包含存在于組合物中的所有大分子物質的80％、90％、95％或99％。最優(yōu)選地，綴合物被純化至基本均勻(即，通過常規(guī)檢測方法不能在組合物中檢測到污染物質)，使得組合物基本上由單一大分子物質組成。盡管在蛋白質部分上的糖基化以及與綴合物的不同分子連接的聚合物部分中的單體數(shù)目可能存在差異，但具有相同的重鏈和輕鏈的綴合物被認為是相同的物質?！坝行Я俊笔侵赣糜谥委?、改善或預防確定的疾病或病癥或用于表現(xiàn)出可檢測的治療或抑制作用的藥物組合物或綴合的功能劑的量?？梢栽趩蝹€患者中相對于治療前的基線測量檢測該作用或通過確定治療組和對照組之間的結果的統(tǒng)計學上的顯著性差異檢測該作用。同樣地，有效的方案是指有效減少、抑制或延遲疾病的至少一種病征或癥狀的本文所述的任何綴合物、融合蛋白或其他藥劑的給藥量、給藥頻率和給藥途徑的組合。物質的“生物半衰期”是藥代動力學參數(shù)，其規(guī)定了在將物質引入生物體后將一半物質從生物體中除去所需的時間。序列同一性可以通過使用默認間隙參數(shù)并使用在wisconsingeneticssoftwarepackagerelease7.0，geneticscomputergroup，575sciencedr.，madison，wi中的諸如bestfit、fasta和tfasta的算法進行序列比對來確定，或者通過檢查和最佳比對(即，導致比較窗口中序列相似度的最高百分比)來確定。通過以下步驟計算序列同一性的百分比：比較兩個比較窗口中的兩個最佳比對序列，確定兩個序列中存在的相同殘基的位置數(shù)以產(chǎn)生匹配位置數(shù)，將匹配位置數(shù)除以在比較窗口中的位置總數(shù)(即窗口尺寸)，并將結果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分比。如果為全長成熟蛋白質提供具體的seqidno.，從成熟蛋白質的第一殘基(即，不考慮任何信號肽的殘基)的1位開始對殘基進行連續(xù)編號。seqidno.的變體或片段中的殘基通過與seqidno.進行最大比對并為對齊的殘基分配相同的數(shù)字來編號。術語“蛋白質”以其最廣泛的含義用于指兩個或多個亞單位，即氨基酸、氨基酸類似物或模擬肽。亞單位可以通過肽鍵連接。在另一個實施方案中，亞基可以通過其他鍵(例如酯，醚等)連接。蛋白質或肽必須含有至少兩個氨基酸，并且對氨基酸的最大數(shù)量沒有限制，其可以包含蛋白質或肽的序列。如果肽鏈短，則三個或更多個氨基酸的肽通常稱為寡肽。如果肽鏈長，則肽通常稱為多肽或蛋白質。蛋白質的非限制性實例包括酶、細胞因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗體、肽、激素、dna結合蛋白、適體、疫苗、毒素、白細胞介素-1(il-1α)、il-1β、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-11、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-31、il-32、il-33、集落刺激因子-1(csf-1)、巨噬細胞集落刺激因子、葡糖腦苷脂酶(glucocerobrosidase)、促甲狀腺激素、干細胞因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、粒細胞集落刺激因子(g-csf)、epo、干擾素-α(ifn-α)、復合干擾素(consensusinterferon)-β(ifn-β)、干擾素-(ifn-)、干擾素-ω(ifn-ω)、血小板生成素(tpo)、血管生成素-1(ang-1)、ang-2、ang-4、ang-y、血管生成素樣多肽1(angptl1)、血管生成素樣多肽2(angptl2)、血管生成素樣多肽3(angptl3)、血管生成素樣多肽4(angptl4)、血管生成素樣多肽5(angptl5)、血管生成素樣多肽6(angptl6)、血管生成素樣多肽7(angptl7)、玻連蛋白、血管內皮生長因子(vegf)、血管生成素、激活素a、激活素b、激活素c、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-5、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-6、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-8、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-10、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-11、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-12、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白14、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ia、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ib、骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ii、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、心肌營養(yǎng)素-1、睫狀中性白細胞因子、睫狀中性白細胞因子受體、cripto、隱性細胞因子誘導的嗜中性粒細胞趨化因子1、細胞因子誘導的嗜中性粒細胞、趨化因子2α、乙型肝炎疫苗、丙型肝炎疫苗、drotrecoginalfa、細胞因子誘導的嗜中性粒細胞趨化因子2β、內皮細胞生長因子、內皮素1、表皮生長因子(egf)、epigen、上皮調節(jié)蛋白、上皮衍生的嗜中性粒細胞引誘劑、成纖維細胞生長因子4、成纖維細胞生長因子5、成纖維細胞生長因子6、成纖維細胞生長因子7、成纖維細胞生長因子8、成纖維細胞生長因子8b、成纖維細胞生長因子8c、成纖維細胞生長因子9、成纖維細胞生長因子10、成纖維細胞生長因子11、成纖維細胞生長因子12、成纖維細胞生長因子13、成纖維細胞生長因子16、成纖維細胞生長因子17、成纖維細胞生長因子19、成纖維細胞生長因子20、成纖維細胞生長因子21、酸性成纖維細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、神經(jīng)膠質細胞系衍生的中性粒細胞因子受體α1、神經(jīng)膠質細胞系衍生的中性粒細胞因子受體、生長相關蛋白、生長相關蛋白a、igg、ige、igm、iga和igd、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、dnase、胎球蛋白、促黃體激素、阿替普酶、雌激素、胰島素、白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、轉鐵蛋白、血小板生成素、尿激酶、整聯(lián)蛋白、凝血酶因子ix(fix)、因子viii(fviii)、因子viia(fviia)、血管性血友病因子(vwf)、因子fv(fv)、因子x(fx)、因子xi(fxi)、因子xii(fxii)、因子xiii(fxiii)、凝血酶(fii)、蛋白c、蛋白s、tpa、pai-1、組織因子(tf)、adamts13蛋白酶、生長相關蛋白β、生長相關蛋白、肝素結合表皮生長因子、肝細胞生長因子、肝細胞生長因子受體、肝細胞源性生長因子、胰島素樣生長因子i、胰島素樣生長因子受體、胰島素樣生長因子ii、胰島素樣生長因子結合蛋白、角質細胞生長因子、白血病抑制因子、生長激素、抗血友病因子、培門冬酶(pegaspargase)、orthocloneokt3、腺苷脫氨酶、阿糖腦苷酶(alglucerase)、伊米苷酶(imiglucerase)、白血病抑制因子受體α、神經(jīng)生長因子受體、neuropoietin、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4、制瘤素m(osm)、胎盤生長因子、胎盤生長因子2、血小板衍生的內皮細胞生長因子、血小板衍生生長因子、血小板衍生生長因子a鏈、血小板衍生生長因子aa、血小板衍生生長因子ab、血小板衍生生長因子b鏈、血小板衍生生長因子bb、血小板衍生生長因子受體α、血小板衍生生長因子受體β、前b細胞生長刺激因子、干細胞因子(scf)、干細胞因子受體、tnf、tnf0、tnf1、tnf2、轉化生長因子α、胸腺基質淋巴生成素(tslp)、i型腫瘤壞死因子受體、ii型腫瘤壞死因子受體、尿激酶型纖溶酶原激活物受體、磷脂酶活化蛋白(pup)、胰島素、凝集素蓖麻毒素、催乳素、絨毛膜促性腺激素、促卵泡激素、甲狀腺刺激激素、組織纖溶酶原激活物(tpa)、瘦蛋白、enbrel(依那西普、etanercept)。在一些實施方案中，蛋白質是抗體。如本文所用，“抗體”包括但不限于完整抗體和任何抗原結合片段，抗原結合片段包括但不限于fab或其單鏈。因此，術語“抗體”包括但不限于包含具有與抗原結合的生物學活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的、任何含蛋白質或肽的分子。其實例可包括重鏈或輕鏈的互補決定區(qū)或其配體結合部分、重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)或輕鏈恒定區(qū)、框架(fr)區(qū)，或其任何部分，或結合蛋白的至少一部分?！翱贵w”還包括單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w的實例包括但不限于英夫利昔單抗(infliximab)、貝伐珠單抗(infliximab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿托續(xù)單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿夫妥珠單抗(afutuzumab)、阿珠單抗(alacizumab)、培化阿珠單抗(alacizumabpegol)、ald518、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿里若庫單抗(alirocumab)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿妥莫單抗(altumomab)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)、麻安莫單抗(anatumomabmafenatox)、安蘆珠單抗(anrukinzumab)、阿泊珠單抗(apolizumab)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿賽珠單抗(aselizumab)、altinumab、阿利珠單抗(atlizumab)、atorolimiumab、托珠單抗(tocilizumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、巴利昔單抗(basiliximab)、巴維昔單抗(bavituximab)、貝妥莫單抗(bectumomab)、貝利木單抗(belimumab)、貝那珠單抗(benralizumab)、柏替木單抗(bertilimumab)、貝索單抗(besilesomab)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝茲羅圖單抗(bezlotoxumab)、比西單抗(biciromab)、比伐單抗(bivatuzumab)、比伐單抗美登素(bivatuzumabmertansine)、博納吐單抗(blinatumomab)、布索珠單抗(blosozumab)、妥昔單抗維多汀(brentuximabvedotin)、布拉吉單抗(briakinumab)、巴羅達魯單抗(brodalumab)、康納單抗(canakinumab)、坎托珠單抗美登素(cantuzumabmertansine)、坎托珠單抗美坦新、卡普拉西珠單抗(caplacizumab)、卡羅單抗噴地肽(capromabpendetide)、卡魯單抗、卡妥索單抗(catumaxomab)、cc49、西利珠單抗、培化賽托珠單抗(certolizumabpegol)、西妥昔單抗、泊西他土珠單抗(citatuzumabbogatox)、西妥木單抗(cixutumumab)、克拉扎珠單抗(clazakizumab)、克立昔單抗、替坦司可利妥珠單抗(clivatuzumabtetraxetan)、可那妥木單抗(conatumumab)、克雷內珠單抗(crenezumab)、cr6261、達西妥珠單抗(dacetuzumab)、達利珠單抗(daclizumab)、達洛妥珠單抗(dalotuzumab)、達拉妥木單抗(daratumumab)、德美西珠單抗(demcizumab)、地諾單抗(denosumab)、地莫單抗(detumomab)、阿托度單抗(dorlimomabaritox)、卓齊妥單抗(drozitumab)、度利戈妥單抗(duligotumab)、度匹魯單抗(dupilumab)、依美昔單抗(ecromeximab)、依庫珠單抗(eculizumab)、埃巴單抗、依決洛單抗、依法珠單抗、依夫單抗(efungumab)、依洛妥珠單抗(elotuzumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、依納伐妥珠單抗(enavatuzumab)、培化恩莫單抗、依諾珠單抗(enokizumab)、依諾替庫單抗(enoticumab)、恩西妥昔西單抗(ensituximab)、西依匹妥莫單抗(epitumomabcituxetan)、依帕珠單抗、厄利珠單抗(erlizumab)、厄馬索單抗(ertumaxomab)、伊瑞西珠單抗(etaracizumab)、依托珠單抗(etroiizumab)、艾韋單抗(exbivirumab)、法索單抗(fanolesomab)、法拉莫單抗、法勒珠單抗(farletuzumab)、法西奴單抗(fasinumab)、fbta05、非維珠單抗、非扎奴單抗(fezakinumab)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)、芬妥木單抗(figitumumab)、弗拉伏妥單抗(flanvotumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、佛拉魯單抗(foralumab)、佛拉韋蘆單抗(foravirumab)、夫蘇木單抗(fresolimumab)、弗拉奴單抗(fulranumab)、弗妥昔單抗(futuximab)、加利昔單抗(galiximab)、甘尼妥單抗(ganitumab)、甘特蘆單抗(gantenerumab)、加韋莫單抗(gavilimomab)、吉妥珠單抗-奧佐米星(gemtuzumabozogamicin)、吉沃珠單抗(gevokizumabvedotin)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)、格列姆巴妥木單抗-維多汀(glembatumumab)、戈利木單抗(golimumab)、戈米昔單抗(gomiliximab)、gs6624、伊巴珠單抗(ibalizumab)、伊莫單抗-替坦(ibritumomabtiuxetan)、伊克蘆庫單抗(icrucumab)、伊戈伏單抗、英西單抗、英加妥珠單抗(imgatuzumab)、英克勒庫單抗(inclacumab)、英達妥昔單抗-拉夫坦辛(indatuximabravtansine)、英利昔單抗、英特妥木單抗(intetumumab)、伊諾莫單抗、伊諾妥珠單抗-奧佐米星(inotuzumabozogamicin)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊拉妥木單抗(iratumumab)、伊托珠單抗(itolizumab)、伊克塞珠單抗(ixekizumab)、凱利昔單抗、拉貝妥珠單抗(labetuzumab)、來金珠單抗(lebrikizumab)、來馬索單抗(lemalesomab)、樂地單抗、來沙妥木單抗(lexatumumab)、利韋單抗(libivirumab)、利格珠單抗(ligelizumab)、林妥珠單抗、利利單抗(lirilumab)、美登素洛妥珠單抗(lorvotuzumabmertansine)、魯卡妥木單抗(lucatumumab)、魯米昔單抗(lumiliximab)、馬帕妥木單抗(mapatumumab)、馬司莫單抗、馬利木單抗(mavriiimumab)、馬妥珠單抗(matuzumab)、美泊利單抗、美特木單抗(metelimumab)、米拉珠單抗(milatuzumab)、明瑞莫單抗、米妥莫單抗、莫加木珠單抗(mogamulizumab)、莫羅木單抗、莫他韋珠單抗(motavizumab)、莫西妥莫單抗(moxetumomab)-假單胞菌外毒素(pasudotox)、莫羅單抗(muromonab)-0)3、他那可單抗(nacolomabtafenatox)、那米魯單抗(namilumab)、他那莫單抗(naptumomabestafenatox)、納那妥單抗(narnatumab)、那他珠單抗、奈巴庫單抗、奈昔妥木單抗(necitumumab)、奈瑞莫單抗、耐斯伐庫單抗(nesvacumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼伏魯單抗(nivolumab)、諾莫單抗-默噴坦(nofetumomabmerpentan)、奧卡拉妥珠單抗(ocaratuzumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、奧度莫單抗、奧法木單抗(ofatumumab)、奧拉妥單抗(olaratumab)、奧洛珠單抗(olokizumab)、奧馬佐單抗、奧納妥珠單抗(onartuzumab)、莫-奧珠單抗(oportuzumabmonatox)、奧戈伏單抗(oregovomab)、奧替庫單抗(orticumab)、奧特利昔珠單抗(otelixizumab)、奧昔魯單抗(oxelumab)、奧扎尼珠單抗(ozanezumab)、奧左拉珠單抗(ozoralizumab)、帕吉昔單抗(pagibaximab)、帕利珠單抗、帕尼單抗(panitumumab)、帕諾巴庫單抗(panobacumab)、巴薩妥珠單抗(parsatuzumab)、帕考珠單抗(pascolizumab)、帕特克珠單抗(pateclizumab)、帕曲妥單抗(patritumab)、培妥莫單抗(pemtumomab)、培拉珠單抗(perakizumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、培克珠單抗(pexelizumab)、皮地珠單抗(pidilizumab)、平妥莫單抗(pintumomab)、普拉庫魯單抗(placulumab)、泊尼珠單抗(ponezumab)、普立昔單抗、普立妥木單抗(pritumumab)、pro140、奎利珠單抗(quilizumab)、雷妥莫單抗(racotumomab)、雷得妥單抗(radretumab)、瑞非韋魯(rafivirumab)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、瑞西巴庫(raxibacumab)、瑞加韋單抗、瑞利珠單抗(reslizumab)、利妥木單抗(rilotumumab)、利妥昔單抗、羅妥木單抗(robatumumab)、羅度單抗(roledumab)、羅莫索珠單抗(romosozumab)、羅利珠單抗(rontalizumab)、羅維珠單抗、魯利單抗、沙馬珠單抗(samalizumab)、沙里魯單抗(sarilumab)、沙妥莫單抗-噴地肽(satumomabpendetide)、司庫奴單抗(secukinumab)、司韋單抗、西羅珠單抗(sibrotuzumab)、西法木單抗(sifalimumab)、西妥昔單抗(siltuximab)、西妥珠單抗(simtuzumab)、西利珠單抗(siplizumab)、西蘆庫單抗(sirukumab)、索蘭珠單抗(solanezumab)、索利托單抗(solitomab)、索耐珠單抗(sonepcizumab)、松妥珠單抗(sontuzumab)、司他木魯單抗(stamulumab)、硫索單抗、蘇韋珠單抗(suvizumab)、他巴魯單抗(tabalumab)、替坦司他卡妥珠單抗(tacatuzumabtetraxetan)、他度珠單抗(tadocizumab)、他利珠單抗(talizumab)、他尼珠單抗(tanezumab)、帕-他莫單抗(taplitumomabpaptox)、替非珠單抗(tefibazumab)、阿替莫單抗(telimomabaritox)、替妥莫單抗(tenatumomab)、替奈昔單抗(teneliximab),替利珠單抗(teplizumab)、替妥木單抗(teprotumumab)、tgn1412、曲美木單抗(tremelimumab)、替昔木單抗(ticilimumab)、替拉珠單抗(tildrakizumab)、替加珠單抗(tigatuzumab)、tnx-650、托珠單抗(＝阿利珠單抗)、托拉珠單抗(toralizumab)、托西莫單抗、特拉羅奴單抗(tralokinumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、trbs07、曲加珠單抗(tregalizumab)、曲美木單抗、妥可妥珠單抗(tucotuzumab)-西莫白介素、妥韋單抗、優(yōu)利妥昔單抗(ublituximab)、優(yōu)瑞魯單抗(urelumab)、優(yōu)托珠單抗(urtoxazumab)、優(yōu)特克單抗(ustekinumab)、伐利昔單抗(vapaliximab)、伐特珠單抗(vatelizumab)、維多珠單抗(vedolizumab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、維帕莫單抗、維森庫單抗(vesencumab)、維西珠單抗(visilizumab)、伏洛昔單抗(volociximab)、伏司妥珠單抗(vorsetuzumab)-馬佛多汀(mafodotin)、伏妥莫單抗、扎魯妥木單抗(zalutumumab)、扎諾木單抗(zanolimumab)、扎妥昔單抗(zatuximab)、齊拉木單抗(ziralimumab)和阿左莫單抗(zolimomabaritox)。對于上述每一個，本發(fā)明預期使用其fab以及全抗體。iii.生物清除劑綴合物和構建體從人血清中分離的buche是分子量為340kda的球狀四聚體分子。haupth,heidek,zwislero和schwickhg.1966.isolierunundphysikalischchemisclecharakterisierungdercholinesteraseaushumanserum.blut.14:65-75。酶的四個亞基中的每一個長度為574個氨基酸。每條鏈都有九個asn連接的碳水化合物鏈。lockridgeo,bartelscf,vaughanta,wongck,nortonse,johnsonll.1987.completeaminoacidsequenceofhumanserumcholinesterase.jbiolchem.262:549-557。進行了各種嘗試以制備重組型buche。然而，證明在血漿中觀察到的主要四聚體形式只是由重組dna技術制備的蛋白質的次要組分。例如，rhbuche在中國倉鼠卵巢(cho)細胞中的表達產(chǎn)生蛋白質的混合物：二聚體(不穩(wěn)定)(50-55％)、單體(15-40％)和相對小百分比的四聚體(10-30％)。blongrm,bedowse,lockridgeo.1997.tetramerizationdomainofhumanbutyrylcholinesteraseisatthec-terminus.biochemj.327:747-757。已確定hbuche的c末端負責四聚化。c末端缺失的蛋白質的表達導致單體的唯一生產(chǎn)。此外，blong等人報道說可以除去c-末端多達50個氨基酸而不損失酶活性(如上所述，僅能檢測到單體形式)。然而，從c-末端缺失51個氨基酸產(chǎn)生保留在細胞中的蛋白質的無活性形式(即不分泌)。人丁酰膽堿酯酶(p06276.1)的602氨基酸序列示于seqidno.1。前28個氨基酸(mhskvtiicirflfwflllcmligksht(seqidno.27))構成hbuche的天然前導序列。因此，成熟酶以序列eddiii(seqidno.28)開始。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了丁酰膽堿酯酶(buche)酶。優(yōu)選地，丁酰膽堿酯酶為人類酶(hbuche)。更優(yōu)選地，酶為重組人類酶(rhbuche)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，丁酰膽堿酯酶具有一個或多個缺失和/或氨基酸取代。優(yōu)選地，將66位的半胱氨酸殘基(從成熟體的n末端開始)變?yōu)槠渌烊换蚍翘烊话被幔鼉?yōu)選，將c66變換為酪氨酸或異亮氨酸，最優(yōu)選c66變換為酪氨酸(c66y)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了rhbuche的c末端缺失。優(yōu)選從rhbuche的c末端缺失不多于50個的氨基酸。更優(yōu)選地，從rhbuche的c末端缺失50個氨基酸，得到構建體rhbuche524(指524n末端保留的氨基酸)。更優(yōu)選地，從rhbuche的c末端缺失40個氨基酸，得到構建體rhbuche534。優(yōu)選地，缺失突變具有上述c66突變中的一個或多個。更優(yōu)選地，缺失突變具有c66y突變。在本發(fā)明的最優(yōu)選方面，具有c66y突變的524缺失的蛋白質序列(rhbche524(c66y))示于seqidno.11。在本發(fā)明的另一個最優(yōu)選的方面，具有c66y突變的534缺失的蛋白質序列(rhbche534(c66y))示于seqidno.10。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，聚合物可以與buche綴合。優(yōu)選地，使用馬來酰亞胺將聚合物與cys殘基綴合。cys殘基可能是一個天然存在的半胱氨酸。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案中，半胱氨酸殘基可以加入到rhbuche的c末端缺失體之一中，使得蛋白質可以與聚合物綴合。優(yōu)選地，將半胱氨酸加入到缺失后的rhbuche的c末端。在更優(yōu)選的實施方案中，通過ggc或gggc(seqidno.20)肽向c末端添加半胱氨酸。在更優(yōu)選的實施方案之一中，將肽gggc(seqidno.20)加入到rhbuche524(c66y)酶的c末端(見seqidno.12)。在另一個更優(yōu)選的實施方案中，將肽ggc加入到rhbuche534(c66y)的c末端(見seqidno.13)。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了具有丁酰膽堿酯酶片段和非丁酰膽堿酯酶蛋白片段的丁酰膽堿酯酶融合蛋白。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，丁酰膽堿酯酶蛋白片段是非丁酰膽堿酯酶片段的n-末端。優(yōu)選地，非丁酰膽堿酯酶蛋白是免疫球蛋白(ig)結構域。更優(yōu)選ig結構域選自igg-fc、igg-ch和igg-cl。更優(yōu)選地，ig結構域來自igg1(seqidno.8)。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施方案中，igg1fc序列可以以各種方式進行修飾，例如調節(jié)補體結合和效應子功能。任選地，igg1fc結構域具有一個或多個突變以降低效應子功能。任選地，突變是以下氨基酸位置中的一個或多個(eu編號)：e233、l234、l235、g236、g237、a327、a330和p331。在這方面，優(yōu)選地，igg1fc具有以下取代：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。fc結構域c末端的賴氨酸殘基有時可以通過翻譯后處理來使其缺失。因此，當fc結構域的seqid以賴氨酸終止時，賴氨酸可以省略也可以不省略。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可以引入fc區(qū)的修飾以提供聚合物綴合的位點。例如，可以加入半胱氨酸殘基，該半胱氨酸殘基可以是聚合物綴合位點。優(yōu)選地，fc結構域具有選自q347c和l443c的突變。更優(yōu)選地，突變?yōu)閝347c。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，融合蛋白優(yōu)選在丁酰膽堿酯酶和非丁酰膽堿酯酶蛋白之間含有多肽接頭。優(yōu)選地，接頭為g、gg、ggggs(seqidno.22)、gggs(seqidno.23)和ggges(seqidno.24)以及前述接頭的低聚物。更優(yōu)選地，接頭選自gggsgggsgggs(seqidno.21)和ggsgggsgggs(seqidno.25)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，融合蛋白的丁酰膽堿酯酶為融合物n末端的、具有優(yōu)選的c66y突變的上述c末端截短體之一(rhbuche524(c66y)或rhbuche534(c66y))，接著是接頭以及c末端的非丁酰膽堿酯酶蛋白序列。在本發(fā)明的更優(yōu)選方面，從n末端開始，融合蛋白由上述的具有c66y突變的524或534c-末端截短體、與其融合的接頭gggsgggsgggs(seqidno.21)以及隨后的具有以下突變的igg1fc序列組成：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。在本發(fā)明最優(yōu)選的實施方案中，融合蛋白的丁酰膽堿酯酶截短體為rhbuche534(c66y)。該構建體的蛋白質序列示于seqidno.15。在本發(fā)明的另一個非常優(yōu)選的實施方案中，融合物的fc區(qū)具有q347c或l443c突變。最優(yōu)選地，融合物的fc區(qū)具有q347c突變和l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。該優(yōu)選實施方案的蛋白質序列示于seqidno.2。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了具有共價結合至聚合物的op生物清除劑(即催化op生物清除劑或化學計量的op生物清除劑)的蛋白質-聚合物綴合物。優(yōu)選地，聚合物為兩性離子聚合物，該聚合物具有一個或多個單體單元，其中至少一個單體單元具有兩性離子。催化op生物清除劑通常為選自芳基二烷基磷酸酶、有機磷酸酯水解酶(oph)、羧酸酯酶、三酯酶(triesterase)、磷酸三酯酶、芳基酯酶、對氧磷酶(pon)、有機磷酸酐酶和二異丙基氟磷酸酶(dfpases)的酶。在本發(fā)明的一個方面，op生物清除劑是化學計量的op生物清除劑。優(yōu)選地，化學計量的op清除劑是選自乙酰膽堿酯酶(ache)和丁酰膽堿酯酶的膽堿酯酶。優(yōu)選地，膽堿酯酶是buche。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，膽堿酯酶(包括丁酰膽堿酯酶)可以根據(jù)已知技術從血清中純化而來。因此，如果希望根據(jù)本發(fā)明的一個方面制備用于施用于人的綴合物，則人血清可以用作膽堿酯酶的來源?；蛘?，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，使用重組dna技術制備膽堿酯酶以及與催化op生物清除劑相關的各種酶。根據(jù)本發(fā)明的某些方面，膽堿酯酶(或與催化op生物清除劑相關的酶)的生產(chǎn)包括本領域已知的任何用于以下操作的方法：(i)通過基因工程生產(chǎn)重組dna，(ii)通過例如但不限于轉染、電穿孔或顯微注射將重組dna引入原核或真核細胞，(iii)培養(yǎng)所述轉化細胞，(iv)表達蛋白質，例如組成型表達或誘導型表達，和(v)分離蛋白質，例如從培養(yǎng)基中或通過收獲轉化的細胞分離蛋白，以(vi)獲得純化的蛋白質。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，通過在合適的原核或真核宿主系統(tǒng)中表達產(chǎn)生蛋白質，其特征在于產(chǎn)生藥理學上可接受的蛋白質分子。真核細胞的實例是哺乳動物細胞，例如cho、cos、hek293、bhk、sk-hip和hepg2。在另外的方面，多種載體用于制備蛋白質，其選自真核和原核表達載體。用于原核表達的載體的實例包括質粒，例如但不限于preset、pet和pad，其中用于原核表達載體的啟動子包括lac、trc、trp、reca或arabad中的一個或多個。用于真核表達的載體的實例包括：(i)用于在酵母中表達的載體，例如但不限于pao、ppic、pyes或pmet，其使用例如但不限于aox1、gap、gal1或aug1的啟動子；(ii)用于在昆蟲細胞中表達的載體，例如但不限于pmt、pac5、pib、pmib或pbac，其使用諸如但不限于ph、p10、mt、ac5、opie2、gp64或polh的啟動子，以及(iii)用于在哺乳動物細胞中表達的載體，例如但不限于psvl、pcmv、prc/rsv、pcdna3或pbpv，以及一方面來源于病毒系統(tǒng)的載體，例如但不限于牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或逆轉錄病毒，其使用例如但不限于cmv、sv40、ef-1、ubc、rsv、adv、bpv和β-肌動蛋白的啟動子。buche的測定法在本領域中是已知的，buche高效地催化乙酰硫代膽堿(atch)—酶的天然底物的硫類似物的水解?？梢允褂闷渌虼寄憠A底物，包括s-丁酰硫基膽堿(btch)碘化物。在水解時，該底物類似物產(chǎn)生乙酸鹽和硫代膽堿。硫代膽堿在高反應性二硫代二硝基苯甲酸(dtnb)離子存在下產(chǎn)生黃色，其是可見的并且可以通過在405nm的分光光度吸收進行定量監(jiān)測。這些技術在以下文獻中描述，所有這些文獻都通過引用并入本文：g.l.ellman,k.d.courtney,v.andres和r.m.featherstone,“anewandrapidcolorimetricdeterminationofacetylcholinesteraseactivity,”biochemicalpharmacology,vol.7,no.2,pp.8895,1961；m.a.gordon,d.e.carpenter,h.w.barrett和i.b.wilson,“determinationofthenormalityofcholinesterasesolutions,”analyticalbiochemistry,vol.85,no.2,pp.519527,1978；以及v.gorun,i.proinov,v.baltescu,g.balaban,和o.barzu,“modifiedellmanprocedureforassayofcholinesterasesincrudeenzymaticpreparations,”analyticalbiochemistry,vol.86,no.1,pp.324326,1978。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，hbuche的內源性前導肽可用于蛋白質的重組表達。然而，更優(yōu)選地，應選擇前導肽以最大化蛋白質表達的水平。在優(yōu)選實施方案中，使用ctla4前導肽。最優(yōu)選地，優(yōu)選seqidno.18所示的前導肽。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，兩性離子聚合物由具有磷酸膽堿基團的單體形成。優(yōu)選單體是2-(丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯。更優(yōu)選地，單體是2-(甲基丙烯酰氧基乙基)-2'-(三甲基銨乙基)磷酸酯(hema-pc)。綴合于生物清除劑的聚合物優(yōu)選具有至少2個聚合物臂，更優(yōu)選3個或更多個臂。一些聚合物具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。更優(yōu)選地，聚合物具有3、6或9個臂。最優(yōu)選地，聚合物具有9個臂。優(yōu)選地，聚合物具有300,000-1,750,000da的峰值分子量。更優(yōu)選地，聚合物具有500,000-1,000,000da的峰值分子量。更優(yōu)選地，聚合物具有600,000-800,000da的峰值分子量。除非另有說明，支鏈聚合物的分子量是指所有臂的總分子量。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，可用于綴合聚合物的、蛋白質上的親核基團(包括抗體)包括但不限于：(i)n-末端胺基，(ii)側鏈胺基，例如賴氨酸，(iii)側鏈巰基，例如半胱氨酸，和(iv)糖羥基或氨基，在此處蛋白被糖基化。胺、硫醇和羥基是親核的并且能夠與接頭部分和接頭試劑上的親電子基團反應形成共價鍵，該連接到聚合物上的接頭部分和接頭試劑包括：(i)活性酯如nhs酯、hobt酯、鹵代甲酸酯和酰鹵；(ii)烷基和芐基鹵化物，例如鹵代乙酰胺；(iii)醛、酮、羧基和馬來酰亞胺基團。許多包括抗體在內的蛋白質都具有潛在地用于綴合的半胱氨酸硫醇基團。優(yōu)選地，通過重組dna技術加入半胱氨酸殘基用于綴合。許多半胱氨酸殘基是可還原的鏈間二硫鍵，即半胱氨酸橋的形式。通常不能獲得二硫化物形式的半胱氨酸殘基以與諸如馬來酰亞胺的試劑反應。半胱氨酸殘基也可以是游離的或未配對的。然而，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)游離半胱氨酸殘基被各種培養(yǎng)基中的一種或多種試劑“封端(capped)”，并且也不可用于綴合?？梢酝ㄟ^用諸如dtt(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(tcep)的還原劑處理使半胱氨酸殘基具有與諸如馬來酰亞胺的接頭試劑綴合的反應性，使得蛋白質被完全或部分還原。因此，每個半胱氨酸橋理論上將形成兩個反應性硫醇親核試劑。在游離半胱氨酸的情況下，通過還原形成一種硫醇親核試劑。根據(jù)所使用的條件，被tcep或dtt還原可導致適當?shù)牡鞍踪|折疊的喪失并伴隨著活性的喪失。然而，通過允許在適當條件下的蛋白質重折疊可以恢復活性。可以通過賴氨酸殘基的修飾將另外的親核基團引入抗體，例如通過使賴氨酸殘基與2-亞氨基四氫噻吩(traut's試劑)反應，使得胺轉化為硫醇。通過引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱氨酸殘基(例如通過制備包含一個或多個非天然半胱氨酸氨基酸殘基的變體)，可將反應性硫醇基團引入蛋白質。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，丁酰膽堿酯酶融合物對應于seqidno.2，用于與聚合物綴合的cys殘基是在氨基酸672處的cys殘基。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提出了一種用于治療或預防op中毒的方法，其中在有效的方案中將本發(fā)明的綴合物或融合蛋白施用于有需要的患者。關于預防，與從普通公眾中隨機選擇的個體的對照群相比，將要或可能以統(tǒng)計學上顯著較高的頻率暴露于op化合物(op農藥或op神經(jīng)毒劑)的個體會需要本發(fā)明。例如，在戰(zhàn)場或犯罪背景下可能暴露于op神經(jīng)毒劑的士兵或執(zhí)法辦公室人員可能需要本發(fā)明。類似地，參與向農作物施用op農藥的工人可能需要本發(fā)明，負責處理農藥或神經(jīng)毒劑意外泄漏的工作人員也可能需要本發(fā)明。雖然可能有防護服和防毒面具來防止暴露，但這種保護措施可能無法提供保護。在這種情況下，可以采用本預防方法。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，綴合物或融合蛋白通過靜脈內給藥、皮下給藥、肌內給藥、病灶內給藥或皮內給藥來施用。優(yōu)選地，通過肌內給藥施用。在本發(fā)明的另一方面，提出了一種針對op中毒進行長期預防的方法，其中在預期暴露于op化合物前至少7天施用綴合物，所述綴合物具有選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物具有一種或多種類型的單體單元，并且其中至少一種類型的單體單元具有兩性離子基團。換句話說，這種預防性施用的綴合物對可能的暴露于op中毒保持至少七天有效。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑前至少14天施用。更優(yōu)選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑前至少21天施用。更優(yōu)選地，綴合物在預期暴露于op神經(jīng)毒劑之前至少30天施用?；蛘邠Q句話說，針對可能的暴露于op，綴合物提供至少14、21或30天的有效保護。在本發(fā)明的另一方面，提出了一種用于快速預防op中毒的方法，其中在預期暴露于op化合物之前至少12小時施用綴合物，所述綴合物具有選自化學計量的有機磷(op)生物清除劑和與兩性離子聚合物共價結合的催化op生物清除劑的有機磷生物清除劑，其中所述聚合物具有一種或多種類型的單體單元，并且其中至少一種類型的單體單元具有兩性離子基團。更優(yōu)選地，綴合物在預期暴露于op化合物之前至少24小時施用。換句話說，綴合物保持至少12或24小時的有效保護。本發(fā)明的藥物組合物還可以包含藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體。適于口服給藥的藥物組合物可以作為離散單元例如膠囊、溶液、糖漿或懸浮液(在水性或非水性液體中)提供，或作為可食用泡沫或泡沫狀物提供，或作為乳劑提供。用于片劑或硬膠囊的合適的賦形劑包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。與軟明膠膠囊一起使用的合適的賦形劑包括例如植物油、蠟、脂肪、半固體或液體多元醇等。為了制備溶液和糖漿，可以使用的賦形劑包括例如水、多元醇和糖。為了制備懸浮液，可以使用油(例如植物油)來提供水包油或油包水懸浮液。其中載體是固體的適于鼻腔給藥的藥物組合物包括具有例如20-500微米范圍內的粒度的粗粉末，其以攝取鼻煙的方式施用，即通過從被保持靠近鼻子的粉末容器經(jīng)由鼻通道快速吸入。其中載體為液體的、作為鼻噴霧劑或鼻滴劑給藥的合適的組合物包括活性成分的水溶液或油溶液。適于通過吸入給藥的藥物組合物包括可以通過各種類型的劑量計量加壓氣噴器、噴霧器或吹入器產(chǎn)生的細顆粒粉末或霧。適于腸胃外給藥的藥物組合物包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質，其使制劑基本上與預期接受者的血液等滲；以及可以包含懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無菌懸浮液?？捎糜诳勺⑸淙芤旱馁x形劑包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。組合物可以在單位劑量或多劑量容器中提供，例如密封的安瓿瓶和小瓶中，并且可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲存，其僅需在使用前加入無菌液體載體，例如用于注射液的水即可。臨場注射溶液和懸浮液可以由無菌粉劑、顆粒劑和片劑制備。藥物組合物可以是基本上等滲的，意味著約250-350mosm/kg水的重量摩爾滲透壓濃度(osmolality)。通常，藥物組合物可以含有防腐劑、增溶劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、氣味劑、鹽(本發(fā)明的物質本身可以以藥學上可接受的鹽的形式提供)、緩沖劑、包衣劑或抗氧化劑。除了本發(fā)明的物質之外，它們還可以含有治療活性劑。本發(fā)明的藥物組合物可以與藥學上可接受的稀釋劑、佐劑或載體組合使用。這樣的賦形劑可以包括但不限于鹽水、緩沖鹽水(例如磷酸鹽緩沖鹽水)、葡萄糖、脂質體、水、甘油、乙醇及其組合。藥物組合物可以以對治療患者疾病有效的任何有效方便的方式施用，包括例如通過口服、靜脈內、皮下、肌內、骨內、鼻內途徑等施用。在治療中或作為預防劑，活性劑可作為可注射組合物施用于個體，例如作為無菌水性分散體，優(yōu)選等滲無菌水性分散體。對于施用于哺乳動物，特別是人，預期活性劑的日劑量為0.01mg/kg體重，通常為約1mg/kg。無論如何，醫(yī)生將根據(jù)包括個體的年齡、體重、性別和反應在內的因素確定最適合個體的實際劑量。上述劑量是平均情況的示例。當然，可以存在使用更高或更低劑量的實例，并且這些在本發(fā)明的范圍內。根據(jù)待治療的疾病或病癥、待治療的個體的年齡和狀況等，本發(fā)明物質的劑量可以在寬的范圍內變化，并且醫(yī)師將最終確定適當?shù)膭┝?。該劑量可以按適當?shù)念l率重復。如果發(fā)生副作用，可以根據(jù)正常的臨床實踐減少劑量的量和/或頻率。在一個實施方案中，藥物組合物可以每1-3天施用一次。本發(fā)明的藥物組合物可以單獨使用或與其他化合物結合使用，其他化合物例如治療性化合物或分子，例如氨基甲酸酯、抗毒蕈堿、膽堿酯酶活化劑和抗驚厥藥?？梢耘c其他化合物同時地、分開地或順序地施用。組分可以以試劑盒的形式制備，試劑盒可以視情況包括說明書。優(yōu)選地，將本發(fā)明的藥物組合物和其他治療性化合物直接(相對于什么？)施用于有需要的患者。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的藥物組合物和包含但不限于用于口服給藥的膠囊、用于肺部給藥的吸入劑和用于腸胃外給藥的可注射溶液的給藥載體的成套試劑盒。如本文所用，術語“治療”包括可以使人或非人動物受益的任何方案。“非人動物”的治療延伸到對家畜的治療，家畜包括馬和寵物(例如貓和狗)以及農場/農業(yè)動物，農場/農業(yè)動物包括綿羊、犬、豬、牛和馬家族的成員。治療可以是針對任何現(xiàn)有的病癥或疾病，或者可以是預防性的(預防性治療)。治療可以針對遺傳疾病或后天疾病。治療可以針對急性或慢性疾病。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種制備綴合物的方法，其具有在合適的條件下使聚合物試劑與包含游離巰基殘基的生物活性劑接觸從而提供綴合物的步驟，其中聚合物試劑具有以下結構：其中p為支鏈或非支鏈的水溶性聚合物；l1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l(wèi)1、l2和l3相同或不同，并且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環(huán)烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；x選自f、cl、br和i；r1和r2相同或不同，并且選自h(條件為r1和r2不都是h)和一個或多個堿性基團，其中堿性基團選自其中r3、r4、r5、r6和r7相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r8和r9相同或不同，并且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r10、r11、r12、r13和r14相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基。優(yōu)選地，生物活性劑選自治療性蛋白質和適體。更優(yōu)選地，生物活性劑是治療性蛋白質。治療性蛋白質優(yōu)選為細胞因子、酶、抗體和抗體片段。更優(yōu)選地，治療性蛋白質是fab。最優(yōu)選地，fab是igg1。當生物活性劑是治療性蛋白質時，游離巰基優(yōu)選由蛋白質的半胱氨酸殘基貢獻。在本發(fā)明的某些方面，半胱氨酸殘基是天然存在的半胱氨酸殘基?；蛘?，通過重組dna技術引入半胱氨酸殘基。p優(yōu)選為聚(環(huán)氧烷)、聚(mpc)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉或聚(n-丙烯?；鶈徇?。更優(yōu)選地，p是聚(環(huán)氧烷)。更優(yōu)選地，p是聚(環(huán)氧乙烷)，其更常被稱為聚乙二醇或peg。其中p是peg，peg優(yōu)選是支鏈的。優(yōu)選地，分支peg具有兩個臂。每個臂優(yōu)選在約5kda至約40kda之間。更優(yōu)選地，每個臂具有約20kda的peg的分子量。對于水溶性聚合物，本發(fā)明的聚合物試劑還包含至少一種水溶性聚合物片段。具有2至約2000個單體單元的、非肽的且水溶性的水溶性聚合物在本發(fā)明中特別有利。合適的水溶性聚合物的實例包括但不限于聚(亞烷基二醇)，例如聚(乙二醇)(“peg”)、具有水溶性的乙二醇和丙二醇的共聚物、聚(烯醇)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚(羥烷基甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸羥烷基酯)、聚(糖)、聚(α-羥基酸)、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚噁唑啉、聚(mpc)和聚(n-丙烯?；鶈徇?，例如第5,629,384號美國專利中所述，該文獻通過引用并入本文。在需要相對高的水溶性的一些應用中，水溶性聚合物不是聚(環(huán)氧丙烷)。在本發(fā)明的另一方面，p是聚(mpc)。聚(mpc)優(yōu)選具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個臂。更優(yōu)選地，聚(mpc)具有3、6或9個臂。最優(yōu)選地，聚(mpc)具有9個臂。根據(jù)本發(fā)明的一個方面，聚(mpc)優(yōu)選具有300,000-1,750,000道爾頓，更優(yōu)選500,000-1,000,000道爾頓，更加優(yōu)選600,000-800,000道爾頓的峰值分子量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面，l3為鍵，r2為h，r1為優(yōu)選的，l2為-(ch2)1-6-。更優(yōu)選地，l2為-(ch2)3-。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于聚合物合成的引發(fā)劑，其具有以下結構：其中l(wèi)1為第一接頭，l2為第二接頭，l3為第三接頭，其中l(wèi)1、l2和l3相同或不同，并且各自選自-c1-c12烷基-、-c3-c12環(huán)烷基-、(-(ch2)1-6-o-(ch2)1-6-)1-12-、(-(ch2)1-4-nh-(ch2)1-4)1-12-、-(ch2)1-12o-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-、-(ch2)1-12-(co)-o-、-(ch2)1-12-(co)-nh-、-(ch2)1-12-o-(co)-、-(ch2)1-12-nh-(co)-、(-(ch2)1-4-o-(ch2)1-4)1-12-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-o-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-(co)-nh-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-o-(co)-(ch2)1-12-、-(ch2)1-12-nh-(co)-(ch2)1-12-、-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c1-c8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-、-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-(c1-8烷基)-(c3-c12環(huán)烷基)-(c1-8烷基)-、-nh-(ch2ch2-o-)1-20-nh-(ch2ch2-o-)1-20-和-(ch2)0-3-芳基-(ch2)0-3-，鍵以及以上的任意組合；r1和r2相同或不同，并且選自h(條件為r1和r2不都是h)，和一個或多個堿性基團，其中堿性基團選自其中r17和r18是c1-6烷基，優(yōu)選其中r17和r18都是甲基，其中r6、r7、r8、r9和r10相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6；其中r11和r12相同或不同，并且選自鍵、h、芳基6-12和烷基1-6；其中r13、r14、r15、r16和r17相同或不同，并且選自鍵、h、氨基、芳基6-12和烷基1-6以及一個或多個精氨酸殘基；且r3、r4和r5相同或不同，并且選自：其中y為ncs、f、cl、br或i。優(yōu)選地，y為br。r3、r4和r5優(yōu)選各自為更優(yōu)選地，r3、r4和r5各自為更加優(yōu)選地，r4、r5和r6各自為在本發(fā)明的一個方面，l3為鍵，r2為h，r1為l2優(yōu)選為-(ch2)1-6-。更優(yōu)選的，l2為-(ch2)3-。iv.實施例實施例1.rbuche截短物通過在524位(指成熟蛋白)上截短hbuche酶來制備op生物清除劑(rhbuche524)。此外，引入突變c66y。rhbuche524(c66y)的蛋白質序列示于seqidno.10。如果希望將聚合物與rhbuche524(c66y)綴合，則可以在末端加入ggc或gggc序列(seqidno.20)。rhbuche524gggc(c66y)的蛋白質序列示于seqidno.12(公開的“gggc”示于seqidno.20)。另一種生物清除劑是通過在位置534(指成熟蛋白)上截短hbuche來制備的。rhbuche534(c66y)的序列示于seqidno.10。對于使用半胱氨酸與聚合物的綴合，任選地將ggc加入到末端。rhbuche534ggc(c66y)的蛋白質序列為seqidno.13。實施例2.rbuche融合蛋白借助重組基因工程，通使用上述534截短物并將其融合到igg1的fc區(qū)來制備rhbuche融合蛋白，其中在兩個蛋白質片段之間具有gs接頭(gggsgggsgggs)(seqidno.21)。rhbuche534-fc序列顯示于seqidno.16。具有c66y突變的融合構建體(rhbuche534(c66y)-fc)顯示于seqidno.17。在另一個形式中，引入了各種效應子功能突變：l234a、l235e、g237a、a330s和p331s。hbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s和p331s)融合物顯示于seqidno.15?？梢怨こ袒M入蛋白質的fc部分的另一個突變是q347c，其可用于將諸如poly(mpc)的聚合物與蛋白質綴合。rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的蛋白質序列示于seqidno.2。使用用于真核基因表達的合適的dna構建體在cho-k1細胞中表達各種蛋白質構建體。盡管內源性hbuche前導序列可用于構建體(參見seqidno.1)的重組表達，但優(yōu)選ctla4前導序列，其序列示于seqidno.18。用于表達rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的dna序列示于seqidno.9。實施例3.構建體的瞬時表達在expi293表達系統(tǒng)(gibco)中進行瞬時表達分析。檢查了許多rhbuche524截短物的表達。一般來說，rhbuche524構建體未被表達或與相應的rhbuche534構建體一樣未被表達。關于rhbuche534構建體，發(fā)現(xiàn)c66y構建體通常比沒有這種改變的構建體更好地被表達。534構建體的瞬時表達數(shù)據(jù)總結于下表：表1實施例4.穩(wěn)定的轉染子基于瞬時表達分析的結果，由rhbuche534ggc(c66y)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)制備穩(wěn)定的轉化體。用于fc融合的穩(wěn)定轉染子使用seqidno.18所示的ctla4前導序列，該前導序列在seqidno.2所示的蛋白質的n-末端融合。該構建體的dna序列示于seqidno.9。實施例5.buche-fc融合蛋白與mpc聚合物的綴合seqidno.2的人buche-fc融合蛋白用tcep變性(如以下實施例6中所述)，以在fc鏈的347位提供游離半胱氨酸硫醇，然后進行有限的復性。然后將經(jīng)tcep處理的buche-fc與750kda的聚合物綴合，其中使用相對于蛋白質過量15-50倍的聚合物，從而生成如下所示的綴合物。實施例6.buche-fc的脫帽和重折疊在室溫下，在edta的存在下，用30倍摩爾過量的tcep將buche-fc融合物還原數(shù)小時。在該還原之后，對蛋白質進行通過uf/df洗滌tcep的步驟以將tcep濃度降低至約8倍摩爾過量。進一步進行uf/df和稀釋以將tcep降低至小于1μm。然后使還原的buche-fc復性，在復性過程(通過單體buche-fc的消失和二聚體buche-fc的出現(xiàn)觀察)后進行sds-page。復性后，如上所述進行蛋白質與聚合物的綴合。實施例7.聚合物r5743的合成對下面所示的聚合物r5743進行如下合成：按照如下步驟合成具有以下結構的tfa/胺鹽引發(fā)劑(化合物l)。化合物l首先，合成具有以下結構的化合物k：化合物k在氮氣下向200ml圓底燒瓶中加入化合物j(1.9g，2.67mmol，3.3當量)化合物j和化合物e(0.525g，0.81mmol，1.0當量)(參見以下結構)，化合物e接著加入二甲基甲酰胺(10ml)，然后加入二異丙基乙胺(2.5ml，14.6mmol，18當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在約6分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，2.5ml，4.04mmol，5當量)。將反應物升溫至室溫并攪拌15分鐘。通過加入水(20ml)、飽和碳酸氫鈉水溶液(20ml)和乙酸乙酯(100ml)淬滅反應。分離有機層，用乙酸乙酯(75ml)萃取水層。將合并的有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液(30ml)、0.5m檸檬酸水溶液(40ml)、水(25ml)和飽和氯化鈉水溶液(40ml)洗滌，然后干燥(硫酸鈉)、過濾并在真空下濃縮。得到無需進一步純化即可使用的殘余物，即2.0g(0.80mmol，99％)化合物k。1hnmr(400mhzdmso-d6):δ＝1.36(s,9h,occh3),1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.98(d,j＝5.6hz,6h,cch2nh),3.04(q,j＝6.0hz,2h,och2ch2nh),3.18(s,2h,och2c),3.3-3.37(m,8h,ch2),3.47-3.55(m,12h,ch2),3.58(s,6h,och2c),3.87(s,6h,d)。在室溫下進行30分鐘，將反應物在真空下濃縮，用二氯甲烷(10ml)稀釋，并真空濃縮。使用乙腈(10ml)溶解殘余物，通過針筒式過濾器(acrodisccr25，pn4225t)過濾，并上樣至制備hplc柱，用60％乙腈水溶液(含0.1％三氟乙酸)至98％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脫。合并含有產(chǎn)物的試管，真空濃縮，冷凍并置于冷凍干燥器上，得到990mg(0.4mmol，兩步產(chǎn)率50％)化合物l，其為白色粉末。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.31(t,j＝7.2hz,6h,cch2ch2nh),2.97-3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.17(s,2h,och2c),3.3(q,6h,ch2ch2nhc＝o),3.4-3.59(m,20h,ch2),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.69-7.84(m,9h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c84h136br9n7o33+2h)/2的計算值＝1196.6；實驗值1197.4。按照如下步驟合成具有以下結構的tfa/胺鹽引發(fā)劑(化合物p)：化合物p向20ml的小瓶中加入化合物l(430mg，0.172mmol，1.0當量)(見上文)和α-叔丁氧基羰基氨基-ω-羧基十二(乙二醇)(154mg，0.215mmol，1.25當量)，然后加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)，然后加入n,n-二異丙基乙胺(0.18ml，1.03mmol，6當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在1分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt.％的乙酸乙酯溶液，0.215ml，0.343mmol，2當量)。將反應物升溫至室溫并攪拌30分鐘。通過加入水、飽和碳酸氫鈉水溶液和乙酸乙酯淬滅反應。分離有機層，用乙酸乙酯萃取水層。合并的有機層用飽和碳酸氫鈉水溶液、0.5m檸檬酸水溶液、水和飽和氯化鈉水溶液洗滌，然后干燥(硫酸鈉)、過濾并真空濃縮。得到無需進一步純化即可使用的殘余物，即0.6g(0.194mmol)如下所示的化合物n。lc-ms(es,m/z):[(m+2h-boc)/2]+(c111h189br9n8o46+2h-boc)/2計算值＝1496.3；實驗值1497.2。化合物n在氮氣下向100ml圓底中加入化合物n(0.6g)和二氯甲烷(4ml)然后加入三氟乙酸(3ml)。將反應物在室溫下攪拌15分鐘。將反應物在真空下濃縮。殘余物用乙腈(3ml)溶解，通過針筒式過濾器(acrodisccr25，pn4225t)過濾，并上樣至制備hplc柱，用50％乙腈(含0.1％三氟乙酸)在50％水(含0.1％三氟乙酸)中的溶液至90％乙腈(含0.1％三氟乙酸)洗脫。合并含有產(chǎn)物的試管，真空濃縮，冷凍并置于冷凍干燥器上，得到200mg(0.064mmol，兩步產(chǎn)率37％)化合物p。1hnmr(400mhzdmso-d6):＝1.90(s,54h,cc(ch3)2br),2.3(brt,8h,cch2ch2nh和ch2ch2c＝o),3.0(m,8h,cch2nh和och2ch2nh),3.1-3.6(m,84h,och2c),3.87(s,6h,o＝cch2o),4.27(s,18h,cch2oc＝o),7.6-7.8(m,10h,ch2nhc＝o和nh3+)。lc-ms(es,m/z):[(m+2h)/2]+(c106h181br9n8o44+2h)/2計算值＝1496.3；實驗值1496.6。實施例8.兩性離子聚合物的制備通常將引發(fā)劑制備為約100mg/ml的dmf中的儲備溶液。將引發(fā)劑和配體(2,2'-聯(lián)吡啶)引入schlenk管中。使用干冰/丙酮混合物將所得溶液冷卻至-78℃，并在真空下脫氣10分鐘。將管在氬氣下再填充，并將保持在氬氣下的催化劑(cubr，除非另有說明)引入到schlenck管中(引發(fā)劑/催化劑(cubr)/配體上的溴原子的摩爾比保持在1/1/2)。溶液立即變成深棕色。將schlenk管密封并立即通過施加短循環(huán)真空/氬氣凈化。通過將限定量的單體與200美制酒精度(proof)的脫氣乙醇混合來制備hema-pc溶液，其中所述單體是在保持在氮氣下的手套箱中制備的。將單體溶液逐滴加入schlenk管(經(jīng)由套管)。溫度保持在-78℃。對反應混合物施加徹底的真空至少10-15分鐘直到溶液不再冒泡。然后將管用氬氣再次填充并加熱至室溫。攪拌溶液，隨著聚合反應的進行，溶液變粘。3-8小時后或過夜后，通過直接暴露于空氣以將cu(i)氧化為cu(ii)使反應猝滅，混合物變成藍綠色，使混合物通過硅膠柱以除去銅催化劑。通過旋轉蒸發(fā)濃縮收集的溶液，將所得混合物用四氫呋喃沉淀或用水透析，然后冷凍干燥，得到自由流動的白色粉末。表2列出了根據(jù)本發(fā)明制備的示例性聚合物。表2表3實施例9.馬來酰亞胺9-臂可綴合聚合物的制備按照如下步驟合成具有以下結構的馬來酰亞胺可綴合的9-臂聚合物(q)：聚合物q可綴合聚合物q的制備如下：向20ml小瓶中加入編號160(表2)的聚合物(540mg，0.0007mmol，1.0當量)，并用水(4ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氫二鈉水溶液(0.4ml)。在單獨的小瓶中將3-馬來酰亞胺基丙酸nhs酯(0.93mg，0.0035mmol，5當量)溶解在四氫呋喃(1ml)中。在室溫下約2分鐘內將nhs酯溶液加入到聚合物溶液中，將所得溶液攪拌30分鐘。將反應物用水(約15ml)稀釋，通過針筒式過濾器(acrodiscsupor，pn4612)過濾，并均勻地放入3個amicon離心膜透析管(30,000mwco)中。將管中物料稀釋并與水(各約5ml)混合，置于離心機(rpm3000)中離心30分鐘。移除濾液并對濾液進行分析，同時將保留物稀釋并與水(約10ml/管)混合。將離心程序再重復5次，之后取出保留物并置于小瓶中。將amicon膜管用水沖洗(每個管2×約2ml)，并與保留物合并。通過針筒式過濾器(acrodiscsupor，pn4612)過濾保留物溶液，冷凍并置于冷凍干燥器上，得到508mg(94％)聚合物q，其為白色粉末。實施例10.馬來酰亞胺9-臂共軛聚合物的制備使用與所述的可綴合聚合物q相同的技術合成具有以下結構的馬來酰亞胺可綴合9-臂聚合物(r)：聚合物r實施例11.綴合物的活性測量如下表1所示的綴合的蛋白質和未綴合的蛋白質的buche酶活性。在表1中，rbuche534(c66y)為rhbuche534ggc，rbuche534fc為rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)：表4樣品酶活性(eu/mg)s.d.(％)δ活性rbuche534(cho-k1)7244-rbuche534fc(cho-k1)7885-rbuche534-9a750khema-pc620414％rbuche534fc-9a750khema-pc74835％buche(人血漿)(對照)6404-rbuche(山羊乳)(對照)4235-rbuche(山羊乳)是指在轉基因山羊中產(chǎn)生的rhbuche?？傊?，buche-fc融合蛋白保持良好的活性。此外，在與聚合物綴合之后，活性保持良好。對于fc構建體，與mpc聚合物綴合后的活性損失僅為5％。實施例12.buche的血漿穩(wěn)定性為了確定rbuche534ggc(c66y)(seqidno.13)和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(seqidno.2)是否克服了與轉基因山羊rbuche相關的穩(wěn)定性問題，我們測試了在食蟹猴(cyno)血漿中這些構建體相比于人血漿來源的buche和轉基因山羊rhbuche(全長)的穩(wěn)定性。將樣品引入市售的食蟹猴血漿中，隨著時間推移取等量試樣并通過埃爾曼氏測定法測定酶活性。圖1顯示在cyno血漿中于37℃下保存近35天后，rbuche534ggc(c66y))和rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)的活性都能很好的保持。這兩種構建體都比金標準人血漿純化而得的buche表現(xiàn)更好。相比之下，轉基因山羊酶的活性隨著時間的推移迅速下降，在研究結束時接近小于5％。還測定了與聚合物的綴合是否影響酶的穩(wěn)定性。圖2顯示了活性-時間曲線，其中在4℃和37℃的條件下將與9臂750kda的hema-pc聚合物綴合的蛋白質rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)與來源于人血漿的buche進行對比。盡管與聚合物綴合的蛋白質的活性隨時間有所下降，但其下降幅度不超過所觀察到的來源于人血漿的酶。實施例13.神經(jīng)毒劑對buche的體外抑制為了確定本發(fā)明的rbuches是否對神經(jīng)毒劑具有活性，使用上述的埃爾曼氏測定法在下述op試劑存在下測定了綴合的和未綴合的不同buche批次：ga(塔崩(二甲氨基氰磷酸乙酯))、gb(沙林(甲氟膦酸異丙酯))、gd(梭曼(甲氟磷酸3,3-二甲基-2-丁基酯))、gf(環(huán)沙林(甲氟膦酸環(huán)己酯))、vx(v系神經(jīng)毒劑(({2-[雙(2-丙基)胺基]乙基}磺?；?(甲基)膦酸乙酯)和vr(v系列神經(jīng)毒劑(n,n-二乙基-2-(甲基-(2-甲基丙氧基)磷酰基)磺酰乙胺)。表2顯示了人血漿rbuche、rbuche534＝rbuche534ggc(c66y)、rbuche534-fc＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)和rbuche534-fc-聚合物＝rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)-9臂750kda的hema-pc聚合物對各種神經(jīng)毒劑的抑制常數(shù)ki。表5神經(jīng)毒劑的ki(m-1min-1)從表中可以看出，包括綴合物在內的每個構建體非常接近標準人血漿buche。實施例14.buche構建體的體內藥代動力學為了確定本發(fā)明的rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s和q347c)(和相應的綴合物)的體內藥代動力學性質，將構建體注射給藥至c57bl/6背景的、羧酸酯酶es1敲除的純合子小鼠(-/-)。duysen,e.g.,等人，productionofes1plasmacarboxylesteraseknockoutmicefortoxicitystudies(2011)chem.res.toxicol.24(11)1891-1898。這些es1ko小鼠完全缺乏血漿羧酸酯酶活性。據(jù)報道，相對于人，血漿羧酸酯酶升高小鼠中神經(jīng)毒劑的ld50。duysen等人。按照上述的測試猴血清中血清穩(wěn)定性的方法，在小鼠血清(c57bl/6)中測試下述各種構建體和綴合物的血清穩(wěn)定性。結果相似(數(shù)據(jù)未顯示)。在時間0(零)點將各種構建體和綴合物靜脈內注射到4-6只小鼠的組中。然后在注射后的不同時間從動物中取出血液等份試樣，并如上所述測量buche的活性。以下是注射入ko小鼠的試驗物質的總結。表6在ko小鼠中體內pk研究的設計在取出的血液樣品中監(jiān)測buche酶活性，并根據(jù)上述活性數(shù)據(jù)進行歸一化。表1中列出的各種構建體的pk數(shù)據(jù)示于圖3中。實施例15.37℃下buche綴合物的緩沖液穩(wěn)定性比較使用馬來酰胺或碘乙酰胺將從轉基因山羊的乳中純化的全長rhbuche經(jīng)由天然半胱氨酸與聚合物綴合。在圖4中比較了這兩種不同綴合物的穩(wěn)定性。為了評估綴合物穩(wěn)定性，將基于馬來酰亞胺和碘乙酰胺的綴合物在磷酸鹽緩沖鹽水中在37℃、ph7.0的條件下孵育30天。取出等份試樣，并通過sdspage分析游離蛋白質。結果見圖1。碘代乙酰胺綴合物在30天內非常穩(wěn)定，其曲線保持在時間零點設定的基線附近。相比之下，基于馬來酰亞胺的綴合物迅速地從時間零點設定的基線跳離。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以看出對于一些蛋白質基于碘乙酰胺的綴合物比馬來酰亞胺綴合物在本質上更穩(wěn)定。馬來酰亞胺綴合物的不穩(wěn)定性取決于蛋白質。許多馬來酰亞胺綴合物相當穩(wěn)定。實施例16.與來源于山羊的rhbuche綴合的馬來酰亞胺750kda的mpc聚合物對于馬來酰亞胺綴合，使用可熱去保護的馬來酰亞胺引發(fā)劑將mpc聚合物與buche綴合。如pct/us2012/060301所述合成具有上述結構的引發(fā)劑，即化合物aa(參見實施例6)：如pct/us2012/060301的實施例11所述進行mpc聚合物的合成以產(chǎn)生約750kda的6臂mpc聚合物。如第us61/875,099號美國臨時申請所述，通過熱去保護制備聚合物以用于綴合。將所得經(jīng)熱去保護的聚合物在tris緩沖鹽水中在ph7.5、4℃的條件下與經(jīng)tcep處理的buche綴合過夜。通過sdspage測定綴合。通過deae色譜從游離蛋白質和聚合物中純化綴合物。實施例17.與山羊來源的rhbuche綴合的碘乙酰胺3臂250kda的mpc聚合物對具有以下結構的tfa/胺鹽引發(fā)劑(化合物b)進行如下合成。首先，對具有以下結構的boc保護的3臂引發(fā)劑，即化合物a：進行如下制備：在氮氣下向25ml圓底燒瓶中加入2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酸叔丁酯(66mg，0.26mmol，1.2當量)和(2,2,2-三(2-溴-2-甲基-丙酰氧基甲基)-乙氧基)-乙酸(按照pct/us2012/060301中所述的制備產(chǎn)品4.5的方法制備，該文獻通過引用并入本文)(142mg，0.22mmol，1.0當量)，隨后加入n,n-二甲基甲酰胺(2ml)，然后加入n,n-二異丙基乙胺(0.19ml，1.1mmol，5.0當量)。將燒瓶用冰浴冷卻至0℃。在1分鐘內向其中加入丙基膦酸酐溶液(50wt％的乙酸乙酯溶液，0.16ml，0.26mmol，1.2當量)。將反應物升溫至室溫并攪拌1.5小時。通過加水淬滅反應，然后用水和乙酸乙酯對其進行分配。分離有機層，水層用乙酸乙酯萃取。合并的有機層用水、飽和碳酸氫鈉水溶液、水、0.5m檸檬酸水溶液、水洗滌，然后干燥(硫酸鈉)、過濾并真空濃縮。將殘余物加到硅膠柱(60ml)上，用70％乙酸乙酯和30％己烷洗脫。合并含有產(chǎn)物的試管，真空濃縮，得到150mg(0.17mmol，77％)化合物a?；衔颽被去保護以生成化合物b，操作如下：在氮氣下向20ml圓底中加入化合物a(120mg，0.14mmol，1當量)、二氯甲烷(2ml)，然后加入三氟乙酸(2ml，26.9mmol，192當量)。將反應物在室溫下攪拌30分鐘。將反應物用己烷二氯甲烷(20ml)稀釋并在真空下濃縮。將反應物用己烷(50ml)稀釋并真空濃縮(兩次)，得到2.2g(2.73mmol，(含有殘余二氯甲烷))化合物b。對具有以下結構的聚合物b2進行如下制備。將聚合物103(280mg，0.00123mmol，1.0當量)放入20ml小瓶中，并用水(2ml)溶解。向其中加入0.5m磷酸氫二鈉(0.2ml)。在單獨的小瓶中溶解碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯(1.6mg，0.00548mmol，4.5當量)的四氫呋喃(0.5ml)溶液。將nhs酯溶液在室溫下在約2分鐘內加入到聚合物溶液中，將所得溶液攪拌75分鐘。將反應物用4:1的水:四氫呋喃(4ml)稀釋，并置于amicon離心膜透析管(30,000mwco)中，將管置于離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液進行分析，同時將保留物稀釋并與4:1的水:四氫呋喃(6ml)混合，并將管置于離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液進行分析，同時將保留物物稀釋并與水(8ml)混合，置于離心機(rpm3000)中處理30分鐘。移出濾液用于分析，同時將保留物稀釋并與水(8ml)混合。重復3次以上該離心程序，然后取出保留物并置于小瓶中。用水(2×約2ml)沖洗amicon膜管，將沖洗液與保留物合并，將所得混合物冷凍并置于冷凍干燥機上，得到270mg(96％)聚合物b2，其為白色粉末。將聚合物b2與按照以上所述制備的經(jīng)tcep處理的rhbuche綴合。使用相對于rhbuche約5倍摩爾過量比例的聚合物b2，在室溫下在約ph8.5的碳酸鈉緩沖液中過夜。通過deae色譜從游離聚合物和蛋白質中純化綴合物。實施例18.通過堿性基團增強與3臂-250kda的碘乙酰胺mpc聚合物的綴合將各種堿性基團置于碘乙酰胺官能團附近，并測定其增強與rbuche綴合的能力。表7與來自山羊乳的rhbuche的綴合實施例19.聚合物r4341的合成首先，合成具有以下結構的r4163：具有如下所示結構的化合物r3329購自jstarresearch。在室溫下將6gr3329與2.8gn-boc-2,2'-(亞乙二氧基)二乙胺在thf中混合。向其中加入8.2ml二異丙基乙胺，然后加入7.7ml丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室溫下孵育30分鐘后，用etoacmbe和水對反應混合物進行分配。然后用0.5m檸檬酸×1、飽和碳酸氫鈉和飽和nacl洗滌。產(chǎn)物用硫酸鎂干燥。r4163通過lcms被證實。接下來，從r4613中除去boc基團。將9.4gr4163溶于60ml二氯甲烷中。向其中加入60ml三氟乙酸。在室溫下孵育10分鐘。將溶液干燥。將固體物質溶于水/乙腈中，并通過rp-hplc純化如下所示的r4180。接下來，制備具有以下結構的化合物r4203：將200mgr4180與43mgboc-l-ala-oh在2ml乙腈中混合。向其中加入200μl二異丙基乙胺，然后加入175μl丙基膦酸酐溶液(1.6m)。在室溫下孵育20分鐘后，加入水，將溶液攪拌5分鐘。然后將溶液用乙酸酸化并在甲醇中稀釋。通過rv-hplc純化r4203。通過使用三氟乙酸除去boc官能團以制備tfa鹽來制備用于聚合物合成的引發(fā)劑。將171mgr4203溶解在500μl三氟乙酸中，并在室溫下孵育幾分鐘。通過rv-hplc純化如下所示的r4235，r4235通過lcms和nmr被證實。然后使用r4235引發(fā)mpc聚合物合成以產(chǎn)生如下所示的化合物r4258：在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入47.7μl的引發(fā)劑(r4235)在dmf中的儲備溶液(6.3mg的引發(fā)劑在63ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mgcubr，脫氣，然后逐滴加入單體(甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷酰膽堿(pc))在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色(browncoloration)：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。最后，通過將碘乙酸酯基團放在單一伯胺上合成r4341。將聚合物r4258(100mg)溶于添加有磷酸鹽緩沖液的水中。向其中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的thf溶液。5分鐘后，再加入100μl酯，反應混合物在室溫下孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥：產(chǎn)品：mp：221.9kda，pdi1.10。實施例20.聚合物r4118的合成聚合物r4118如下所示：首先，按照上述步驟合成r4180。然后將r4180用于以下反應以制備rxxx1：將200mgr4180和107mgrxxx1溶于乙腈(2ml)中。向其中加入200微升n,n'-二異丙基乙胺和175微升丙基丙酸酐(50％乙酸乙酯溶液)。將該反應混合物在室溫下孵育約3小時。加入3ml水，將溶液攪拌5分鐘。將溶液用乙酸酸化并用1ml甲醇稀釋。通過rv-hplc純化rxxx1。用tfa除去boc保護基，得到tfa鹽。將140mgrxxx1溶于1.5ml二氯甲烷中。向其中加入1.5ml的tfa。將該溶液在室溫下孵育約2小時45分鐘。真空除去tfa和二氯甲烷，將固體物質溶于水/乙腈。如下所示的化合物r4037通過rv-hplc純化，并通過lcms得到證實。接下來，使用r4037作為引發(fā)劑制備mpc聚合物。向10mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入57.7μl的引發(fā)劑(r4037)于dmf中的儲備溶液(6.2mg的引發(fā)劑在62ul的dmf中)中。將儲備溶液脫氣，然后加入2.9mgcu(i)br，脫氣，然后逐滴加入單體(甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷酰膽堿(pc))在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下過夜(20小時)。然后對如下所示的聚合物r4053進行sec/mals，發(fā)現(xiàn)其pdi為1.073，mp為213.7kda。然后通過使r4053與碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯反應制備化合物r4118。將150mg的聚合物在水中攪拌直到溶解并加入磷酸鹽緩沖液。將3mg碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯溶于450μl的thf中。加入兩份150μl的等份的nhs酯溶液，兩次加入相隔5分鐘。在室溫下攪拌30分鐘。用水稀釋至約10ml，離心并透析(截留分子量為30kda)。用約10ml水重新透析5次。將上清液溶解在約10ml水中，過濾并冷凍干燥：sec/mals：mp215.3kda，pdi1.1。實施例21.聚合物r4440的合成首先，使r4180(如下)按照以下所示進行反應以產(chǎn)生boc保護的引發(fā)劑：將r4180(200mg)和r4247(111mg)溶于2ml乙腈中。加入200μln,n'-二異丙基乙胺，然后加入175μl丙基膦酸酐。將該溶液在室溫下孵育25分鐘。加水，接著加入乙酸，然后加入甲醇。通過rp-hplc純化r4302。通過lcms證實產(chǎn)物身份。接下來，通過tfa從r4302中除去boc基團以產(chǎn)生如下所示的r4315。將173mgr4302溶于500μltfa中，并在室溫下孵育80分鐘。將溶液用水/乙腈稀釋，產(chǎn)物通過rp-hplc純化。用lcms和nmr證實產(chǎn)物身份。將化合物4315作為引發(fā)劑用于聚合物合成以制備mpc聚合物(r4367，如下所示)。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入56.2μl引發(fā)劑(r4315)在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發(fā)劑在63ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，加入2.8mgcu(i)br，脫氣，然后逐滴加入單體({2-[(2-甲基-2-丙烯?；?氧基]乙氧基}[2-(三甲基氨基)乙氧基]次膦酸)在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。通過sec/mals分析所得聚合物，結果為：pdi1.1和mp200.7kda。最后，通過將碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯偶聯(lián)至r4367制備如下所示的化合物r4440。將100mgr4367溶于800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4磷酸鈉緩沖液。向緩沖溶液中加入100μl的6.5mg/ml碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。在室溫下孵育5分鐘，然后再加入100μl，并在室溫下再孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/mals分析：mp206kda，pdi1.1。實施例22.聚合物r4342的合成首先，將r4180(參見上文)與boc-his(3-me)-oh反應以制備r4176，如下面的反應方案所示：將165mgr4180和50mgboc-his(3-me)-oh懸浮于乙腈中。r4180溶解但boc-his(3-me)-oh未溶解。加入165μl的n,n-二異丙基乙胺，酸溶解。隨后，加入144μl多聚膦酸酐溶液，將反應混合物孵育約1小時。再加入80μl多膦酸酐溶液，將反應混合物靜置45分鐘。然后將反應混合物用乙酸酸化并用甲醇稀釋。r4176通過rp-hplc純化。接下來，通過tfa除去r4176的boc基團，得到如下所示的化合物r4182。將117mgr4176溶于500μl的tfa中，并在室溫下孵育10分鐘。然后將反應混合物用水/乙腈稀釋，通過rv-hplc純化r4182。將化合物r4182用作mpc聚合物合成的底物以制備化合物r4259。在25mlschlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入57.1μl的引發(fā)劑(r4182)在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發(fā)劑在68ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mgcubr，脫氣，然后滴加單體甲基丙烯酸2-羥乙酯(hema)磷酰膽堿(pc)在乙醇中的溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。sec/mals：pdi＝1.1和mp＝225.7kda。最后，使化合物r4259與碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯反應，得到如下所示的化合物r4342。將100mg聚合物r4259溶解800μl水。向其中加入50μl的0.5m、ph7.4磷酸鈉緩沖液中加入。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的thf溶液。將該溶液在室溫下孵育5分鐘。再加入100μl的6.5mg/mlnhs酯/thf溶液。在室溫下再孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心并透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/mals：mp227.7kda，pdi1.1。實施例23.聚合物r4439的合成首先，將r4180(如上所示)與2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸鹽進行如下所示的反應，得到化合物r4301。將200mgr4180溶于2ml乙腈中。將該溶液加入130mg溶解的2-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-5-(二甲基氨基)戊酸三氟乙酸鹽。加入300μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)，然后加入175μl丙基膦酸酐(t3p溶液)。將反應混合物在室溫下靜置約30分鐘。再加入200μl的dipea和100μl的t3p，將反應混合物靜置15分鐘?；旌衔镉盟?、乙酸和甲醇稀釋。r4301通過rp-hplc純化，并通過lcms證實。接下來，通過tfa從r4301中除去boc保護部分，得到化合物r4314。將93mg的r4301溶于500μl的tfa中。將反應混合物在室溫下靜置20分鐘。此后，將反應混合物用水/乙腈稀釋，通過rv-hplc對r4314進行純化。然后將r4314用作mpc聚合物制備的底物以制備r4366。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-聯(lián)吡啶基，然后加入56.9μl的引發(fā)劑(r4314)在dmf中的儲備溶液(9.2mg的引發(fā)劑在92ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mgcubr，脫氣，然后逐滴加入單體的乙醇溶液(1g在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。sec/mals：pdi＝1.1，mp＝233.4kda。最后，r4366與碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯反應生成r4439(如下所示)。將100mg聚合物r4366溶于800μl水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩沖液。向其中加入100μl6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯的thf溶液。將反應混合物在室溫下靜置5分鐘，此時再加入100μl的酯。將反應混合物在室溫下靜置30分鐘。用水稀釋至～10ml，過濾，離心并透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至～10ml，過濾并冷凍干燥：sec/mals：mp233.4kda，pdi1.1。實施例24.r4441的合成首先，將r4108(參見上文)與boc-dab(me2)-oh，tfa鹽反應以制備r4308，如下方案所示：將200mg的r4180溶解在2ml乙腈中。然后將該溶液用于溶解106mg的boc-dab(me2)-oh，tfa鹽。加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和265μl的丙基膦酸酐(t3p)。在室溫下孵育15分鐘。加入200μl的dipea和175μl的t3p，再孵育15分鐘。加水，然后加乙酸。用甲醇稀釋，通過rv-hplc純化r4308。通過lcms進行證實。接下來，通過tfa除去boc保護基以提供r4331。將135mg的r4308溶于500μl的tfa中。將反應混合物靜置15分鐘。r4331通過rv-hplc純化。然后將r4331用作聚合物合成的引發(fā)劑以提供聚合物r4368。在25mlschlenk管中加入4.8mg2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入56.2μl的引發(fā)劑在dmf中的儲備溶液(7.1g的引發(fā)劑在71μl的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mg的cubr，脫氣，然后逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。將反應混合物至少放置1小時，在3psi的ar下密封，并使反應在室溫下進行20小時。當進行棕色顯色時，將反應淬滅，進行取樣、轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)進行純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。sec/mals分析：pdi1.1，mp256.6kda。最后，r4368與碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯反應，得到如下所示的r4441。將100mgr4368溶于800μl水中。加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩沖液。加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液。在室溫下放置5分鐘，再加入100μl。靜置(sit)30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心，透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/malsr4441mp256.6kda，pdi1.1。實施例25.聚合物r4320的合成首先，將r4108(參見上文)與boc-lys(me2)-oh反應以制備r4196。將200mg的r4180和74mg的boc-l-lys(me2)-oh溶于2ml乙腈中。向其中加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和204μl的丙基膦酸酐(t3p)。使反應混合物在室溫下靜置15分鐘。然后將反應混合物用水稀釋并攪拌5分鐘。最后，將反應混合物用乙酸酸化并用甲醇稀釋。r4196通過rv-hplc純化，產(chǎn)物通過lcms證實。接下來，通過tfa除去r4196上的boc基團，得到如下所示的化合物r4211。將153mg的r4196溶于500μl的tfa中。溶液在室溫下靜置15分鐘。用水/乙腈稀釋。通過rv-hplc進行純化。通過lcms和nmr對結構進行證實。接下來，r4211用作mpc聚合物制備的底物以制備聚合物r4255。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入57.7μl的引發(fā)劑在dmf中的儲備溶液(8mg引發(fā)劑在80ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mg的cubr，脫氣，然后逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(截留分子量為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。sec/mals：pdi1.076，mp205.3。最后，通過將聚合物r4255偶聯(lián)到碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯來制備聚合物r4320(如下所示)。將100mg的r4255溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩沖液。加入100μl的6.5mg/mlnhs酯的thf溶液。攪拌5分鐘，再加入100μl的nhs酯溶液。在室溫下放置30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心并透析(截留分子量為30kda)。稀釋至～10ml，再透析4次。稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/mals：mp：225.7kda，pdi：1.1。實施例26.聚合物r4438的合成首先，將r4180(如上所示)與boc-dap(me2)-ohtfa鹽反應以制備如下所示的化合物r4300。將200mg的r4180和86mg的boc-dap(me2)-ohtfa鹽溶解在2ml乙腈中。加入200μl的n,n-二異丙基乙胺(dipea)和175μl丙基膦酸酐溶液(t3p)，將溶液在室溫下孵育約15分鐘。加入40mg或更多的boc-dap(me2)-ohtfa鹽，再加入200μl的dipea和100μl的t3p，然后在室溫下再孵育10分鐘。用水稀釋，用乙酸酸化，然后用甲醇稀釋。r4300通過rv-hplc純化并通過lcms得到證實。接下來，通過tfa除去r4300上的boc基團，得到如下所示的r4307：將118mg的r4300溶于500μl的tfa中，將反應混合物靜置20分鐘。加入水/乙腈，化合物4307通過rf-hplc純化并通過lcms得到證實。接下來，將r4307用作mpc聚合物合成的引發(fā)劑。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶基，然后加入55.5μl的引發(fā)劑在dmf中的儲備溶液(6.8mg的引發(fā)劑在68ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mgcubr，脫氣，然后逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為1kda)純化，洗滌4次，之后冷凍干燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。最后，向r4307中加入碘乙酰胺官能團以制備化合物r4438(如下所示)。將100mg的r4307溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩沖液。然后加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，然后在室溫下孵育5分鐘。再加入100μl的6.5mg/ml的nhs酯溶液，并在室溫下孵育約40分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心并透析(截留分子量為30kda)。再透析4次。用水稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/mals：mp230.8kda，pdi1.1。實施例27.聚合物r4451的合成首先，將r4180(參見上文)與boc-高精氨酸·hcl(boc-homoarg-oh·hcl)反應以產(chǎn)生如下所示的r4366：將200mg的r4180溶于2ml乙腈中。將該溶液加入到80mg的可部分溶解的boc-高精氨酸·hcl中。加入175μl二異丙基乙胺(dipea)，似乎全部boc-高精氨酸·hcl都沉淀出來。然而，當加入200μl的丙基膦酸酐溶液(t3p)時，所有固體都溶解。將該反應混合物在室溫下孵育40分鐘。再加入81mg的boc-高精氨酸·hcl，然后加入200μl或更多的dipea和175μl的t3p。將反應混合物再孵育50分鐘。將反應混合物用水稀釋，r4366通過rv-hplc進行純化，并通過lcms證實。接下來，除去boc基團以制備如圖所示的化合物r4354：將90mg的r4366溶于500μl的tfa中。在室溫下反應30分鐘。加入水/乙腈。通過rv-hplc純化，并通過lcms和nmr證實。接下來，將r4354用作mpc聚合物合成的底物以制備r4386。在25ml的schlenk管中加入4.8mg的2,2'-聯(lián)吡啶，然后加入58.3μl的引發(fā)劑(r4354)在dmf中的儲備溶液(7.4mg的引發(fā)劑在74ul的dmf中)。將儲備溶液脫氣，然后加入2.8mg的cubr，脫氣，然后逐滴加入單體的乙醇溶液(1g單體在4ml乙醇中)。至少將反應混合物脫氣1小時，并在3psi的ar下密封。使反應在室溫下進行20小時。棕色顯色：猝滅，取樣以進行轉化和mw分析。通過透析(mwco為3.5kda)進行純化，之后進行冷凍干燥的步驟。sec/malspdi1.1，mp258.4kda。最后，向r4386中加入碘乙酰胺官能團以制備r4551(如下所示)。將100mg的r4386溶于800μl的水中。向其中加入80μl的0.5m、ph7.4的磷酸鈉緩沖液。加入100μl的6.5mg/ml的碘乙酸n-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。在室溫下孵育5分鐘，再加入100μl的nhs酯。在室溫下孵育30分鐘。用水稀釋至約10ml，過濾，離心并透析(截留分子量為30kda)。從水中再透析4次。稀釋至約10ml，過濾并冷凍干燥。sec/mals：mp258.4kda，pdi1.1。實施例28.peg試劑的合成peg試劑通過nhs酯與胺的偶合方便地制備。以胺官能團結尾的分支peg是可商購獲得的。例如，根據(jù)本發(fā)明可以使用以下peg碘乙酰胺試劑：其中n為peg單元的數(shù)量。peg試劑r500通過以下反應方便地合成：實施例29rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)的哺乳動物表達載體、細胞系和表達優(yōu)化。將含有rhbuche534(c66y)-fc(l234a、l235e、g237a、a330s、p331s、q347c)構建體的dna片段克隆到編碼嘌呤霉素抗性基因的哺乳動物表達載體中。插入的序列示于seqidno.9。將具有插入的buche-fc融合物的表達載體稱為構建體14。將構建體14轉染到cho細胞中并構建穩(wěn)定的轉染池。將穩(wěn)定池進行細胞系發(fā)育，分離穩(wěn)定轉染的克隆，稱為c98。進行搖瓶研究以確定使用什么培養(yǎng)基和條件來最大化產(chǎn)生的蛋白質的量。每個燒瓶的接種密度為0.4×106個細胞/ml。結果列于下表2中：表8搖瓶實驗實施例30.單分子引發(fā)劑共價連接到先前的atrp引發(fā)劑的堿性基團(例如，胍或叔胺)的引入導致了當添加配體(2,2'-聯(lián)吡啶，bpy)時在atrp聚合過程中由于鹵化銅物質(cubr)與這些堿性基團可能絡合而引起的可能的干擾。該實施例測試本發(fā)明所要求保護的這種堿性基團是否也可以作為atrp方法中的配體，并且當旨在使用這種引發(fā)劑獲得定制的聚合物時能夠不使用這些化合物。已在苯乙烯聚合中報道了含有共價連接的叔胺基團的單分子atrp引發(fā)劑(polym.printrint201243(2)，第245頁)。在乙烯基單體(苯乙烯、甲基丙烯酸甲酯)的atrp系統(tǒng)中使用這種引發(fā)劑的目的僅僅是通過將胺共價連接到引發(fā)劑上以抑制外部試劑的使用，而不是為了與生物活性化合物有關的綴合目的。單分子引發(fā)劑的研究僅在需要加熱的苯乙烯和mma上在有機溶劑(甲苯)中進行。根據(jù)作者所述，分子量得到適度控制。在更廣泛的分布范圍內實現(xiàn)了高分子量。報道了在atrp方法中使用胍分子作為配體，胍分子是作為胍-吡啶衍生物(二甲基亞乙基胍)亞甲基吡啶(dmegpy)或(四甲基胍)亞甲基吡啶(tmgpy)使用的。不使用這些結構作為苯乙烯和甲基丙烯酸甲酯控制聚合的atrp方法中的配體。僅獲得低分子量聚合物(低于10,000da)。該實施例測試新引入引發(fā)劑的基團是否不干擾上述傳統(tǒng)的atrp方法，并檢查其在atrp聚合方法中用作配體的能力。在不引入任何bpy的條件下合成第一嵌段聚(hema-pc)(步驟1)，以檢查聚合物的形成和分子量的控制。此步驟之后為引入bpy并逐漸添加單體(步驟2)，以檢查根據(jù)以下圖式的擴鏈反應和系統(tǒng)活性?；衔飏4235用作參照。使用的所有其他化合物的結構如下所述：對于所有的引發(fā)劑，使用的方案都是相同的：未使用bpy作為配體的聚合方案。新鮮制備100mg/ml的引發(fā)劑的dmf溶液作為儲備溶液。分配溶液以在schlenk管中引入5×10-6mol的引發(fā)劑。將溶液脫氣，然后加入2.48mg的cubr(1.7×10-5mol)(未變色)。滴加hema-pc的乙醇溶液(1g，4ml)。將反應混合物置于3psi，并在室溫下聚合20小時反應保持無色，并在每種情況下取等份試樣以分析轉化率和分子量(參見下表第1步)。在步驟2中，將bpy加入到步驟1的粗混合物中，隨后向反應混合物中逐漸加入溶液形式的單體(hema-pc)(1g單體在2ml乙醇中)和4.8mg的bpy(3.1×10-5mol)(立即呈現(xiàn)棕色)。將反應密封，徹底脫氣，均化，并使其在室溫下進行直到變粘，然后進行最后猝滅。結果顯示在下表9中：表9在參照物(化合物r4235)不存在bpy的情況下，在bpy存在下無聚合物形成。僅當將聯(lián)吡啶作為配體引入反應混合物內時聚合反應才得以進行從而達到所需分子量和高轉化率。對于表中列出的所有其他引發(fā)劑(化合物r4315、r4334、r4037、r4354、r4314、r4211和r4182)，在未向步驟1的反應中引入任何bpy配體的條件下，所有實例都進行了聚合反應。獲得受控分子量和低pdi(1.2以下)。當在步驟2加入bpy并逐漸添加的hema-pc單體時，立即呈現(xiàn)棕色，表明銅物質與bpy的重新絡合。在所有情況下，通過步驟1中獲得的聚合物的擴鏈，聚合反應繼續(xù)進行，得到所需的分子量和窄的多分散性。新引入的基團不僅參與中性ph下的綴合，而且還可以作為atrp中的有效配體。對于這種聚合，不需要使用外部配體(例如bpy)。上述或下文引用的所有專利申請、網(wǎng)站、其他出版物、登錄號等的全部內容通過引用并入本文用于所有目的，其程度如同明確并單獨地指出將每個單獨文獻如此通過引用并入。如果序列的不同版本與不同時間的登錄號碼相關聯(lián)，則意旨與在本申請的有效申請日期的登錄號相關聯(lián)的版本。有效申請日期是指比引用該登錄號(如果適用)的優(yōu)先申請的實際提交日期或提交日期早的時間。同樣，如果不同版本的出版物、網(wǎng)站等在不同時間被公開，則意指在申請的有效申請日期內最近公布的版本，除非另有說明。本發(fā)明的任何特征、步驟、要素、實施方案或方面可以與任何其他組合使用，除非另有特別說明。盡管出于清楚和理解的目的已經(jīng)通過說明和示例的方式對本發(fā)明進行了詳細的描述，但顯而易見的是，可以在所附權利要求的范圍內實施某些改變和修改。序列表seqidno.1(人丁酰膽堿酯酶p06276.1)天然前導序列，c66y突變和碳末端移除的結構域用下劃線表示。seqidno.2(優(yōu)選的rbuche534(c66y)-gs10-fc(w/突變)融合物)通過使用gs接頭與igg1-fc連接(下劃線)而結合的buche以及與野生型相比的氨基酸改變用下劃線表示。seqidno.3(人acheaaa68151.1)前導肽用下劃線表示。seqidno.5(芳基二烷基磷酸酶[巴士脫硫孤菌(desulfarculusbaarsii)dsm2075；adk83762.1])seqidno.6(人pon1,p27169.3)seqidno.7(來自歐洲烏賊(loligovulgaris)的二異丙基氟磷酸酶q7sig4.1)seqidno.8(人igg1)seqidno.9(優(yōu)選的dna序列buche-gs10-fc(w/突變)融合物)seqidno.10(rbuche534)seqidno.11(rbuche524截短物w/c66y)seqidno.12(rbuche524gggc截短物w/c66y)seqidno.13(rbuche534ggc截短物w/c66y)seqidno.14(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.15(rbuche534(c66y)-gs10-fc(無q347cw/效應子功能突變)融合物)gs接頭和效應子功能突變用下劃線表示。seqidno.16(rbuche534-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.17(rbuche534(c66y)-gs10-fc(wt)融合物)gs接頭用下劃線表示。seqidno.18(前導肽)maclgfqrhkaqlnlatrtwpctllffllfipvfckaseqidno.19(hbuche成熟蛋白質序列)序列表<110>kodiaksciencesinc.<120>丁酰膽堿酯酶兩性離子聚合物綴合物<130>057768-470678<150>pct/us2015/056112<151>2015-10-16<150>62/065,471<151>2014-10-17<160>28<170>patentinversion3.5<210>1<211>602<212>prt<213>智人<400>1methisserlysvalthrileilecysileargpheleuphetrpphe151015leuleuleucysmetleuileglylysserhisthrgluaspaspile202530ileilealathrlysasnglylysvalargglymetasnleuthrval354045pheglyglythrvalthralapheleuglyileprotyralaglnpro505560proleuglyargleuargphelyslysproglnserleuthrlystrp65707580seraspiletrpasnalathrlystyralaasnsercyscysglnasn859095ileaspglnserpheproglyphehisglyserglumettrpasnpro100105110asnthraspleusergluaspcysleutyrleuasnvaltrpilepro115120125alaprolysprolysasnalathrvalleuiletrpiletyrglygly130135140glypheglnthrglythrserserleuhisvaltyraspglylysphe145150155160leualaargvalgluargvalilevalvalsermetasntyrargval165170175glyalaleuglypheleualaleuproglyasnproglualaprogly180185190asnmetglyleupheaspglnglnleualaleuglntrpvalglnlys195200205asnilealaalapheglyglyasnprolysservalthrleuphegly210215220gluseralaglyalaalaservalserleuhisleuleuserprogly225230235240serhisserleuphethrargalaileleuglnserglyserpheasn245250255alaprotrpalavalthrserleutyrglualaargasnargthrleu260265270asnleualalysleuthrglycysserarggluasngluthrgluile275280285ilelyscysleuargasnlysaspproglngluileleuleuasnglu290295300alaphevalvalprotyrglythrproleuservalasnpheglypro305310315320thrvalaspglyasppheleuthraspmetproaspileleuleuglu325330335leuglyglnphelyslysthrglnileleuvalglyvalasnlysasp340345350gluglythralapheleuvaltyrglyalaproglypheserlysasp355360365asnasnserileilethrarglysglupheglngluglyleulysile370375380phepheproglyvalserglupheglylysgluserileleuphehis385390395400tyrthrasptrpvalaspaspglnargprogluasntyrarggluala405410415leuglyaspvalvalglyasptyrasnpheilecysproalaleuglu420425430phethrlyslyspheserglutrpglyasnasnalaphephetyrtyr435440445phegluhisargserserlysleuprotrpproglutrpmetglyval450455460methisglytyrgluilegluphevalpheglyleuproleugluarg465470475480argaspasntyrthrlysalaglugluileleuserargserileval485490495lysargtrpalaasnphealalystyrglyasnproasngluthrgln500505510asnasnserthrsertrpprovalphelysserthrgluglnlystyr515520525leuthrleuasnthrgluserthrargilemetthrlysleuargala530535540glnglncysargphetrpthrserphepheprolysvalleuglumet545550555560thrglyasnileaspglualaglutrpglutrplysalaglyphehis565570575argtrpasnasntyrmetmetasptrplysasnglnpheasnasptyr580585590thrserlyslysglusercysvalglyleu595600<210>2<211>772<212>prt<213>人工序列<220><223>人工序列描述:合成多肽<400>2gluaspaspileileilealathrlysasnglylysvalargglymet151015asnleuthrvalpheglyglythrvalthralapheleuglyilepro202530tyralaglnproproleuglyargleuargphelyslysproglnser354045leuthrlystrpseraspiletrpasnalathrlystyralaasnser505560cystyrglnasnileaspglnserpheproglyphehisglyserglu65707580mettrpasnproasnthraspleusergluaspcysleutyrleuasn859095valtrpileproalaprolysprolysasnalathrvalleuiletrp100105110iletyrglyglyglypheglnthrglythrserserleuhisvaltyr115120125aspglylyspheleualaargvalgluargvalilevalvalsermet130135140asntyrargvalglyalaleuglypheleualaleuproglyasnpro145150155160glualaproglyasnmetglyleupheaspglnglnleualaleugln165170175trpvalglnlysasnilealaalapheglyglyasnprolysserval180185190thrleupheglygluseralaglyalaalaservalserleuhisleu195200205leuserproglyserhisserleuphethrargalaileleuglnser210215220glyserpheasnalaprotrpalavalthrserleutyrglualaarg225230235240asnargthrleuasnleualalysleuthrglycysserarggluasn245250255gluthrgluileilelyscysleuargasnlysaspproglngluile260265270leuleuasnglualaphevalvalprotyrglythrproleuserval275280285asnpheglyprothrvalaspglyasppheleuthraspmetproasp290295300ileleuleugluleuglyglnphelyslysthrglnileleuvalgly305310315320valasnlysaspgluglythralapheleuvaltyrglyalaprogly325330335pheserlysaspasnasnserileilethrarglysglupheglnglu340345350glyleulysilephepheproglyvalserglupheglylysgluser355360365ileleuphehistyrthrasptrpvalaspaspglnargprogluasn370375380tyrargglualaleuglyaspvalvalglyasptyrasnpheilecys385390395400proalaleugluphethrlyslyspheserglutrpglyasnasnala405410415phephetyrtyrphegluhisargserserlysleuprotrpproglu420425430trpmetglyvalmethisglytyrgluilegluphevalpheglyleu435440445proleugluargargaspasntyrthrlysalaglugluileleuser450455460argserilevallysargtrpalaasnphealalystyrglyasnpro465470475480asngluthrglnasnasnserthrsertrpprovalphelysserthr485490495gluglnlystyrleuthrleuasnthrgluserthrargilemetthr500505510lysleuargalaglnglncysargphetrpthrserphepheprolys515520525valleuglumetthrglyglyglyserglyglyglyserglyglygly530535540serasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaglu545550555560glyalaproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleu565570575metileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalser580585590hisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalglu595600605valhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthr610615620tyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasn625630635640glylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuproserser645650655ileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluprocys660665670valtyrthrleuproproserargaspgluleuthrlysasnglnval675680685serleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealaval690695700glutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpro705710715720provalleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthr725730735valasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysserval740745750methisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleu755760765serproglylys770<210>3<211>614<212>prt<213>智人<400>3metargproproglncysleuleuhisthrproserleualaserpro151015leuleuleuleuleuleutrpleuleuglyglyglyvalglyalaglu202530glyarggluaspalagluleuleuvalthrvalargglyglyargleu354045argglyileargleulysthrproglyglyprovalseralapheleu505560glyileprophealagluproprometglyproargargpheleupro65707580progluprolysglnprotrpserglyvalvalaspalathrthrphe859095glnservalcystyrglntyrvalaspthrleutyrproglypheglu100105110glythrglumettrpasnproasnarggluleusergluaspcysleu115120125tyrleuasnvaltrpthrprotyrproargprothrserprothrpro130135140valleuvaltrpiletyrglyglyglyphetyrserglyalaserser145150155160leuaspvaltyraspglyargpheleuvalglnalagluargthrval165170175leuvalsermetasntyrargvalglyalapheglypheleualaleu180185190proglyserargglualaproglyasnvalglyleuleuaspglnarg195200205leualaleuglntrpvalglngluasnvalalaalapheglyglyasp210215220prothrservalthrleupheglygluseralaglyalaalaserval225230235240glymethisleuleuserproproserargglyleuphehisargala245250255valleuglnserglyalaproasnglyprotrpalathrvalglymet260265270glyglualaargargargalathrglnleualahisleuvalglycys275280285proproglyglythrglyglyasnaspthrgluleuvalalacysleu290295300argthrargproalaglnvalleuvalasnhisglutrphisvalleu305310315320progl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