本申請(qǐng)根據(jù)35u.s.c.§119，要求2014年12月9日提交的序列號(hào)為62/089333的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，本文以該申請(qǐng)為基礎(chǔ)并將其全文通過(guò)引用結(jié)合于此。

本公開(kāi)一般涉及用于核酸純化的方法和試劑盒，更具體地，涉及用于純化轉(zhuǎn)染級(jí)別質(zhì)粒dna的基于磁性顆粒的試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

核酸純化(如dna或rna的分離)可以是多種生物化學(xué)和診斷過(guò)程中的重要步驟。質(zhì)粒dna(pdna)可用于許多應(yīng)用中，從制備載體用于克隆到產(chǎn)生模板用于轉(zhuǎn)錄或偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄/翻譯反應(yīng)。在能夠進(jìn)行其他加工步驟(如克隆、轉(zhuǎn)染、測(cè)序、擴(kuò)增、雜交和/或合成等)之前，需要從其中常發(fā)現(xiàn)核酸的復(fù)雜混合物(例如組織、細(xì)胞、流體等)中分離出核酸。污染物質(zhì)(例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和/或碳水化合物)的存在可能阻礙或阻止這些過(guò)程中的許多過(guò)程。例如，在分離期間攜帶的雜質(zhì)可降低產(chǎn)量和/或防止酶系統(tǒng)合成感興趣的產(chǎn)物。另外，dna還可能污染rna應(yīng)用，反之亦然。因此，從各種不同的起始物質(zhì)中有效地分離出核酸以確保所需的最終用途功能可以是重要的。

在一些情況下，所選用于純化核酸的方法影響分離的產(chǎn)物的多種特性，包括核酸樣品的產(chǎn)量、質(zhì)量和/或純度。雖然已開(kāi)發(fā)了許多用于核酸純化的方法，但這些方法可能具有一種或多種缺點(diǎn)，包括例如成本高、復(fù)雜程度高、速度低、產(chǎn)量低、純度低、污染、毒性和/或低效。先前已經(jīng)用磁性顆粒在各種純化方法中結(jié)合和分離核酸。這些方法可以具有一些優(yōu)勢(shì)，如消除了離心和/或真空處理步驟，得到了較高純度的產(chǎn)物和/或提高了操作者的安全性。然而，使用磁性顆粒的方法仍然可能具有各種缺點(diǎn)，例如速度慢、復(fù)雜程度高和/或總產(chǎn)量低。

因此，將會(huì)有利的是提供可以更快、復(fù)雜程度更低、更便宜和/或使產(chǎn)品純度和/或產(chǎn)量提高的，用于核酸純化的基于磁性顆粒的方法和試劑盒。所形成的經(jīng)純化的核酸可用于各種各樣的生物化學(xué)和診斷應(yīng)用，例如聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)、克隆、轉(zhuǎn)染、限制性消化和臨床診斷。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在各個(gè)實(shí)施方式中，本公開(kāi)涉及用于純化核酸的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種核酸的樣品與懸浮緩沖液結(jié)合以形成懸浮液，(b)將所述懸浮液與裂解緩沖液結(jié)合以形成裂解液，(c)將所述裂解液與結(jié)合緩沖液結(jié)合以形成溶液；(d)將所述溶液與至少一種磁性顆粒結(jié)合以形成合并溶液，所述合并溶液包含與至少一種核酸可逆結(jié)合的至少一種修飾的磁性顆粒，(e)從所述合并溶液中分離所述至少一種修飾的磁性顆粒，(f)用第一洗滌緩沖液和第二洗滌緩沖液洗滌所述至少一種修飾的磁性顆粒，以及(g)將修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液結(jié)合。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，懸浮緩沖液可包含至少一種離子螯合劑，其存在的濃度范圍為約1mm至約10mm；和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為約10mm至約100mm。裂解緩沖液可包含至少一種去垢離液劑，其存在的濃度范圍為，以重量計(jì)，約1％至約10％；和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度為大于或等于約0.2m。在非限定性的實(shí)施方式中，結(jié)合緩沖液可包含至少一種離液劑，其存在的濃度范圍為約4m至約6m；任選地，至少一種鹽，其存在的濃度范圍為約0.1m至約2m；至少一種醇，以體積計(jì)，其存在的濃度范圍為約1％至約5％和至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為，以重量計(jì)，約0.25％至約3％。根據(jù)其他實(shí)施方式，第一洗滌緩沖液可包含至少一種離液劑，其存在的濃度范圍為約4m至約6m；至少一種離子螯合劑，其存在的濃度范圍為約1mm至約10mm；至少一種緩沖化合物，其存在的濃度范圍為約10mm至約100mm和至少一種醇，其存在的濃度范圍為，以體積計(jì)，約30％至約50％。在另外的實(shí)施方式中，第二洗滌緩沖液可以包含至少一種醇和任選的至少一種鹽。磁性顆?？蛇x自，例如，羧基包被的磁性顆粒、基于二氧化硅的磁性顆粒及其組合。本文還公開(kāi)了一種核酸純化試劑盒，其包含這些緩沖液和磁性顆粒。

在以下的詳述中給出了本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，其中的部分特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)所作描述就可以容易地看出，或者通過(guò)實(shí)施包括以下詳述、權(quán)利要求書(shū)和附圖在內(nèi)的本文所述的本發(fā)明而被認(rèn)識(shí)。

應(yīng)理解，前面的一般性描述和以下的發(fā)明詳述都顯示了本公開(kāi)的多種實(shí)施方式，并旨在提供用于理解權(quán)利要求的性質(zhì)和特性的總體評(píng)述或框架。包括的附圖提供了對(duì)本公開(kāi)的進(jìn)一步的理解，附圖結(jié)合于本說(shuō)明書(shū)中并構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分。附圖例示了本公開(kāi)的各種實(shí)施方式，并與說(shuō)明書(shū)一起用來(lái)解釋本發(fā)明的原理和操作。

附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

結(jié)合以下附圖閱讀，便可以最好地理解下文中的詳述，圖中相同的結(jié)構(gòu)用相同的附圖標(biāo)記表示，其中：

圖1為示出了根據(jù)本公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方式的核酸純化方法的流程圖；

圖2為與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，示出了根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方式的方法的pdna產(chǎn)量圖；

圖3為與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，示出了根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方式的方法的轉(zhuǎn)染效率圖；

圖4示出了使用根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方式的方法和使用現(xiàn)有技術(shù)方法純化的pdna(使用或未使用ecori切割)的瓊脂糖凝膠電泳分析；

圖5為與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，示出了根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方式的方法的pdna產(chǎn)量圖；和

圖6為與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，示出了根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)實(shí)施方式的方法的轉(zhuǎn)染效率圖。

詳述

方法

本文公開(kāi)了用于核酸純化的方法，所述方法包括(a)將包含至少一種核酸的樣品與懸浮緩沖液結(jié)合以形成懸浮液，(b)將所述懸浮液與裂解緩沖液結(jié)合以形成裂解液，(c)將所述裂解液與結(jié)合緩沖液結(jié)合以形成溶液，(d)將所述溶液與至少一種磁性顆粒結(jié)合以形成合并溶液，所述合并溶液包含與至少一種核酸可逆結(jié)合的至少一種修飾的磁性顆粒，(e)從所述合并溶液中分離所述至少一種修飾的磁性顆粒，(f)用第一洗滌緩沖液和第二洗滌緩沖液洗滌所述至少一種修飾的磁性顆粒，以及(g)將所述至少一種修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液結(jié)合。

參考圖1將對(duì)本公開(kāi)的實(shí)施方式進(jìn)行討論，圖1示出了根據(jù)本公開(kāi)的非限定性實(shí)施方式的核酸純化方法的流程圖。以下總體說(shuō)明旨在提供權(quán)利要求所主張方法的概述，并將參考非限定性實(shí)施方式在整個(gè)公開(kāi)中對(duì)多個(gè)方面進(jìn)行更具體地討論，這些實(shí)施方式在下文所討論的通用方法的上下文中可彼此互換。

如在圖1中所示，在步驟s中，包含至少一種核酸的樣品(例如細(xì)菌)105可懸浮在懸浮緩沖液中。然后，在步驟l中可以裂解樣品以生成裂解液，該裂解液包含pdna120和各種污染物110，該污染物110包括不期望的核酸115(例如rna和基因組dna)。裂解液還可與結(jié)合/中和緩沖液結(jié)合和孵育，并且在步驟c中通過(guò)離心分離出附聚物或大分子125進(jìn)行處理。接著可將磁性顆粒130加入到剩余溶液中。在步驟b中，從樣品(細(xì)菌)105中釋放出來(lái)的pdna120可以可逆地結(jié)合至磁性顆粒130的表面。磁體135可用于吸引磁性顆粒130并且將它們從剩余溶液中分離出來(lái)。在步驟w中，通過(guò)使用一種或多種洗滌緩沖液洗滌磁性顆粒130，可除去未結(jié)合的污染物110。接著，在步驟e中，使用洗脫緩沖液可從磁性顆粒中洗脫并分開(kāi)pdna120。在步驟p中，例如使用磁體，可從溶液中除去磁性顆粒130以生成經(jīng)純化的pdna產(chǎn)物，其接著可用于各種應(yīng)用。

本文所用術(shù)語(yǔ)“包含至少一種核酸的樣品”及其變化形式旨在表示從生物或環(huán)境樣品中獲得的任何材料(如試樣或培養(yǎng)物)，其可以含有至少一種核酸，例如dna分子、rna分子或dna/rna雜交分子。所述至少一種核酸可包括，例如，基因組dna、染色體dna(cdna)、質(zhì)粒dna(pdna)、總rna、信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉(zhuǎn)運(yùn)rna(trna)和/或rna/dna雜交體。生物樣品可包括人和動(dòng)物樣品，例如細(xì)胞、組織和體液，所述體液如尿、全血和源自血液的流體(如血清和血漿)。舉例來(lái)說(shuō)，環(huán)境樣品可包括植物組織(例如瓊脂糖)和細(xì)菌樣品。在各個(gè)實(shí)施方式中，樣品可包括細(xì)菌培養(yǎng)物。例如，細(xì)菌培養(yǎng)物可在o.d.600濃度大致等于1(8x10⁸細(xì)胞/ml)下過(guò)夜制備。根據(jù)另外的實(shí)施方式，待純化的所述至少一種核酸可為dna，例如，pdna。

包含所述至少一種核酸的樣品可結(jié)合于(例如懸浮于)懸浮緩沖液(s1)中(參見(jiàn)圖1中的步驟s)。在各個(gè)實(shí)施方式中，懸浮緩沖液s1可包含至少一種離子螯合劑(ic1)和至少一種緩沖化合物(b1)。懸浮緩沖液s1還可包含rna酶，其濃度在約10μg/ml至約1,000μg/ml的范圍內(nèi)，如約50μg/ml至約500μg/ml，或約100μg/ml至約250μg/ml，包括其間所有范圍和子范圍。在某些實(shí)施方式中，可將rna酶先加入到懸浮緩沖液s1中再與樣品結(jié)合。

所述至少一種離子螯合劑ic1可以一定的濃度范圍存在于懸浮緩沖液s1中，例如約1mm至約10mm，如約2mm至約9mm、約3mm至約8mm、約4mm至約7mm或約5mm至約6mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，ic1濃度可為約1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種離子螯合劑ic1可選自：乙二胺四乙酸(edta)及其異構(gòu)體，例如乙二胺-n,n’-二琥珀酸(edds)；環(huán)己烷-1,2-二胺四乙酸(cdta)；亞氨基二琥珀酸(ids)；聚天冬氨酸(pasa)；甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；l-谷氨酸n,n-二乙酸,四鈉鹽(glda)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic1可選自edta及其異構(gòu)體。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic1還可用作蛋白酶抑制劑。

所述至少一種緩沖化合物b1可以一定的濃度存在于懸浮緩沖液s1中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內(nèi)，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b1濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種緩沖化合物b1可選自tris、tris-hcl、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)，及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b1可選自tris(三羥甲基氨基甲烷)和tris-hcl。

在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b1在約25℃下的pka可以在約7至約9的范圍內(nèi)，例如約7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b1可包括在懸浮緩沖液s1中，其量足以將ph調(diào)節(jié)到約7至約10范圍內(nèi)的值，如約7.5至約9.5、約8.5至約9、約8至約8.3，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s1的ph可以等于約7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10，包括其間所有范圍和子范圍。

懸浮后，可加入裂解緩沖液s2以形成來(lái)自懸浮樣品的裂解液(參見(jiàn)例如圖1中的步驟l)。在各個(gè)實(shí)施方式中，裂解緩沖液s2可包含至少一種去垢離液劑(dc)和至少一種緩沖化合物(b2)。懸浮液和裂解緩沖液s2可以本領(lǐng)域已知的任何方式結(jié)合，例如，可將裂解緩沖液s2加入到懸浮液中并且例如通過(guò)顛倒進(jìn)行混合。在某些實(shí)施方式中，可以將混合物顛倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。通過(guò)顛倒結(jié)合可確保最佳的細(xì)胞裂解效率和/或最終的核酸產(chǎn)量。另外，懸浮液可任選地在裂解緩沖液s2中孵育足以裂解樣品的一段時(shí)間。該時(shí)間段可在例如約30秒至約10分鐘的范圍內(nèi)，例如約1分鐘至約8分鐘、約2分鐘至約5分鐘、或約3分鐘至約4分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

所述至少一種去垢離液劑dc可以一定濃度存在于裂解緩沖液s2中，所述濃度例如以重量計(jì)在約1％至約10％的范圍內(nèi)，如約2％至約9％、約3％至約8％、約4％至約7％或約5％至約6％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，dc濃度以重量計(jì)可為約1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％、3％、3.25％、3.5％、3.75％、4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％、6％、6.25％、6.5％、6.75％、7％、7.25％、7.5％、7.75％、8％、8.25％、8.5％、8.75％、9％、9.25％、9.5％、9.75％或10％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種去垢離液劑dc可選自陽(yáng)離子、陰離子、非離子和兩性離子去垢劑或表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉(sds)、十二烷基苯磺酸鈉(sdbs)、月桂基硫酸銨(als)、十二烷基硫酸鉀(pds)、肉豆蔻醇聚醚硫酸鈉、辛基酚乙氧基化物(例如triton^tmx-100或x-114)、聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯(例如20、40或80)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種去垢離液劑dc可選自sds和sdbs。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種去垢離液劑dc可用于破壞細(xì)胞膜和/或使樣品中的脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)變性。

所述至少一種緩沖化合物b2可以大于或等于0.2m的濃度存在于裂解緩沖液s2中，所述濃度例如大于或等于約0.25m、0.3m、0.35m、0.4m、0.45m、0.5m、0.55m、0.6m、0.65m、0.7m、0.75m、0.8m、0.85m、0.9m、0.95m、1m或更高，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種緩沖化合物b2可選自氫氧化物，例如氫氧化鈉(naoh)、氫氧化鋰(lioh)、氫氧化鉀(koh)、氫氧化銣(rboh)、氫氧化銫(csoh)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b2可為naoh。

在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b2在約25℃下的pkb可以在約0.1至約2的范圍內(nèi)，例如約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b2可包括在懸浮緩沖液s2中，其量足以將ph調(diào)節(jié)到約10至約13范圍內(nèi)的值，如約10.5至約12.5或約11至約12，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s2的ph可等于約10、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9或13，包括其間所有范圍和子范圍。

裂解后，可向裂解液中加入結(jié)合(或中和)緩沖液(s3)以形成溶液。結(jié)合緩沖液s3可包含至少一種離液劑(c1)、至少一種醇(a1)、任選至少一種鹽(z1)和至少一種緩沖化合物(b3)。裂解液和結(jié)合緩沖液s3可以本領(lǐng)域已知的任何方式結(jié)合，例如，可將裂解緩沖液s3加入到裂解液中并例如通過(guò)顛倒進(jìn)行混合。在某些實(shí)施方式中，可以將混合物顛倒多次，如至少五次、至少十次或者更多次。任選地，裂解液可在結(jié)合緩沖液s3中孵育一段時(shí)間，所述一段時(shí)間足以中和樣品和/或促進(jìn)不需要的污染物的聚集形成(其可表現(xiàn)為云狀顆粒)。該時(shí)間段可在例如約1分鐘至約30分鐘的范圍內(nèi)，如約2分鐘至約25分鐘、約3分鐘至約20分鐘、約4分鐘至約15分鐘或約5分鐘至約10分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

所述至少一種離液劑c1可以一定的濃度存在于結(jié)合緩沖液s3中，所述濃度例如在約4m至約6m的范圍內(nèi)，如約4.2m至約5.8m、約4.4m至約5.6m、約4.6m至約5.4m或約4.8m至約5.2m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，c1濃度可為約4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、5m、5.1m、5.2m、5.3m、5.4m、5.5m、5.6m、5.7m、5.8m、5.9m或6m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種離液劑c1可選自鹽酸胍(guhcl)、硫氰酸胍(guscn)、脲及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑c1可選自guhcl和guscn。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑d1可用于破壞細(xì)胞膜和/或使樣品中的脂質(zhì)和/或蛋白質(zhì)變性。

所述至少一種醇a1可以一定濃度存在于結(jié)合緩沖液s3中，所述濃度以體積計(jì)，在例如約1％至約5％的范圍內(nèi)，如以體積計(jì)約2％至約4％或約2.5％至約3％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a1濃度以體積計(jì)可為約1％、1.5％、2％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種醇a1可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種醇a1可為異丙醇。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種醇a1可以是離液的，并且可以用于破壞細(xì)胞膜和/或使樣品中的蛋白質(zhì)變性。

如果存在所述至少一種鹽z1，則其可以一定的濃度存在于結(jié)合緩沖液s3中，所述濃度例如在約0.2m至約2m的范圍內(nèi)，如約0.4m至約1.8m、約0.6m至約1.6m、約0.8m至約1.4m或約1m至約1.2m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，z1濃度可為約0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種鹽z1可選自硫酸銨((nh4)2so4)、乙酸銨(nh4ac)、乙酸鋰(liac)、乙酸鉀(kac)、乙酸鈉(naac)、氯化鈉(nacl)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種鹽z1可為硫酸銨。在各個(gè)實(shí)施方式中，可包括所述至少一種鹽z1以改進(jìn)核酸純化，或者，在其它實(shí)施方式中，可排除所述至少一種鹽z1，但這樣會(huì)產(chǎn)生較低的產(chǎn)量。結(jié)合緩沖液s3中的鹽濃度的升高能夠例如促進(jìn)核酸與磁性顆粒的結(jié)合和/或不需要的污染物聚集體的沉淀。

所述至少一種緩沖化合物b3可以一定濃度存在于結(jié)合緩沖液s3中，所述濃度以重量計(jì)在約0.25％至約3％的范圍內(nèi)，如約0.5％至約2.5％或如約1％至約1.5％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b3濃度以重量計(jì)可為約0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.25％、1.5％、1.75％、2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種緩沖化合物b3可選自冰乙酸、鹽酸及其組合。

在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b3在約25℃下的pka可在約4至約7的范圍內(nèi)，例如約4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75或7，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b3可包括在懸浮緩沖液s3中，其量足以將ph調(diào)節(jié)到約4至約9范圍內(nèi)的值，如約5至約8或約6至約7，包括其間所有范圍和子范圍。例如，s3的ph可等于約4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，通過(guò)例如加入裂解緩沖液s2所產(chǎn)生的堿性條件(例如ph>10)可用于使樣品中存在的pdna和基因組dna變性。隨后的用結(jié)合緩沖液s3中和可有助于所公開(kāi)的方法的總效率，尤其是對(duì)于以各種方式純化pdna來(lái)說(shuō)。例如，中和可造成基因組dna以鏈內(nèi)的方式形成堿基對(duì)，從而形成可從溶液中沉淀出來(lái)的不溶性聚集體。通過(guò)對(duì)比，認(rèn)為圓形pdna的共價(jià)閉合性質(zhì)可促進(jìn)鏈間重雜化，因而使pdna保持在溶液中。另外，當(dāng)結(jié)合緩沖液s3包含至少一種鹽z1(例如鉀鹽、鈉鹽或鋰鹽)時(shí)，這些鹽可與溶液中的一種或多種組分反應(yīng)形成另外的沉淀物。例如，sds的鉀鹽是不溶性的。因此，蛋白質(zhì)和去垢劑的沉淀和聚集均可有助于截留高分子量基因組dna。然后，通過(guò)例如離心或其它已知方法(例如過(guò)濾)可將這些聚集體和任意大分子從溶液中除去(參見(jiàn)，例如圖1中的步驟c)，這在下文中會(huì)進(jìn)行更詳細(xì)的討論。

加入結(jié)合緩沖液后，可將溶液與至少一種磁性顆粒結(jié)合以生成合并溶液(參見(jiàn)例如圖1中的步驟b)。如在本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“磁性顆?！奔捌渥兓问街荚诒硎揪哂写判?例如順磁性或超順磁性)核，且該磁性核被至少一種材料包被的顆粒，所述顆粒具有可與核酸可逆性結(jié)合的表面。合適的磁性顆?？砂ǎ?，羧基包被的順磁性顆粒、基于二氧化硅的順磁性顆粒等。在一些實(shí)施方式中，基于二氧化硅的磁性顆粒可包括用硅質(zhì)氧化物包被的順磁性核，從而提供了可與核酸結(jié)合的含水硅質(zhì)氧化物吸附性表面(例如，包含硅烷醇基團(tuán)的表面)。在另外的實(shí)施方式中，可對(duì)磁性顆粒進(jìn)行表面修飾以生成官能化的表面，舉例來(lái)說(shuō)，例如帶弱或強(qiáng)正電荷的表面、帶弱或強(qiáng)負(fù)電荷的表面或疏水表面。

可商購(gòu)的磁性顆粒的非限定性實(shí)例包括磁量生技有限公司(magquco.ltd)的q珠(qbeads)、格雷斯公司(w.r.grace&co.)的格雷斯珠(gracebeads)等。磁性顆?？删哂羞m于結(jié)合核酸的任何尺寸，包括可商購(gòu)的尺寸，如直徑在約0.3μm至約10μm范圍內(nèi)，例如直徑為約0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10μm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，q珠的平均直徑可在約4μm至約5μm的范圍內(nèi)，格雷斯珠的平均直徑可在約5μm至約10μm的范圍內(nèi)。

在一些實(shí)施方式中，可將磁性顆粒加入溶液中作為至少一種介質(zhì)中的懸浮液。所述介質(zhì)可選自例如水和/或離液劑。在某些實(shí)施方式中，磁性顆?？蔀閼腋≡谒械膓珠或者懸浮在離液劑(例如guscn)中的格雷斯珠。懸浮液中珠的濃度可根據(jù)需要變化并且可在例如約10μg/ml至約100μg/ml的范圍內(nèi)，如約20μg/ml至約90μg/ml、約30μg/ml至約80μg/ml、約40μg/ml至約70μg/ml或約50μg/ml至約60μg/ml，包括其間所有范圍和子范圍。如果使用離液劑，則懸浮液中離液劑的濃度也可根據(jù)需要變化并且可以在例如約1m至約8m的范圍內(nèi)，如約2m至約6m或約4m至約5m，包括其間所有范圍和子范圍。包含磁性珠的溶液的ph可在例如約4至約9的范圍內(nèi)，如約5至約8或者約6至約7，包括其間所有范圍和子范圍。

不希望囿于理論，認(rèn)為由結(jié)合緩沖液s3導(dǎo)入的相對(duì)高濃度的離液劑和/或鹽可增強(qiáng)核酸(如pdna)可逆(例如非共價(jià))結(jié)合至磁性顆粒表面(如二氧化硅表面)的能力。然后，可將由此而修飾的磁性顆粒，例如包含可逆結(jié)合的核酸的磁性顆粒與未結(jié)合的污染物相分離。例如，可將磁體放置于接近修飾的磁性顆粒的位置并用于使顆粒聚攏，例如形成聚集體或丸。在某些實(shí)施方式中，可將含有包含修飾的磁性顆粒的合并溶液的容器(如管)置于磁力架上，所述磁力架能夠收集并稍微固定顆粒，同時(shí)移除剩余溶液。

在核酸與磁性顆粒結(jié)合后，以及在使用例如磁體分離經(jīng)修飾的磁性顆粒后，接著可用一種或多種洗滌緩沖液結(jié)合、清洗或洗滌顆粒(參見(jiàn)例如圖1中的步驟w)。第一洗滌緩沖液(w1)可包含例如至少一種離液劑(c2)、至少一種離子螯合劑(ic2)、至少一種醇(a2)和至少一種緩沖化合物(b4)。

所述至少一種離液劑c2可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約4m至約6m的范圍內(nèi)，如約4.2m至約5.8m、約4.4m至約5.6m、約4.6m至約5.4m或約4.8m至約5m，包括其間所有范圍和子范圍。例如，c2濃度可為約4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、5m、5.1m、5.2m、5.3m、5.4m、5.5m、5.6m、5.7m、5.8m、5.9m或6m，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種離液劑c2可選自鹽酸胍(guhcl)、硫氰酸胍(guscn)、脲及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑c2可選自guhcl和guscn。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑c2可用于促進(jìn)核酸結(jié)合至磁性顆粒表面。

所述至少一種離子螯合劑ic2可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約1mm至約10mm的范圍內(nèi)，如約2mm至約9mm、約3mm至約8mm、約4mm至約7mm或約5mm至約6mm，包括其間所用范圍和子范圍。例如，ic2濃度可為約1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm或10mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種離子螯合劑ic2可選自：乙二胺四乙酸(edta)及其異構(gòu)體，例如乙二胺-n,n’-二琥珀酸(edds)；環(huán)己烷-1,2-二胺四乙酸(cdta)；亞氨基二琥珀酸(ids)；聚天冬氨酸(pasa)；甲基甘氨酸二乙酸(mgda)；l-谷氨酸n,n-二乙酸,四鈉鹽(glda)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic2可選自edta及其異構(gòu)體。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種離子螯合劑ic2可以用于減少氧化損傷和/或污染核酸酶活性和/或螯合金屬離子(如鎂)。

所述至少一種醇a2可以一定濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如以體積計(jì)在約30％至約50％的范圍內(nèi)，如以體積計(jì)約35％至約45％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a2濃度可為約30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％或50％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種醇a2可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種醇a2可為異丙醇。

所述至少一種緩沖化合物b4可以一定的濃度存在于第一洗滌緩沖液w1中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內(nèi)，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，b4濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種緩沖化合物b4可選自tris、tris-hcl、3-(n-嗎啉代)丙磺酸(mops)、4-(2-羥基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、2-(n-嗎啉代)乙磺酸(mes)，及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b4可選自tris和tris-hcl。

在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種緩沖化合物b4在約25℃下的pka可以在約7至約9的范圍內(nèi)，例如約7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9，包括其間所有范圍和子范圍。所述至少一種緩沖化合物b4可包括在第一洗滌緩沖液w1中，其量足以將ph調(diào)節(jié)到約6至約8范圍內(nèi)的值，如約6.5至約7.5或約6.8至約7.2，包括其間所有范圍和子范圍。例如，w1的ph可等于約6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8，包括其間所有范圍和子范圍。

還可用第二洗滌緩沖液(w2)結(jié)合、清洗或洗滌經(jīng)修飾的磁性顆粒，所述第二洗滌緩沖液(w2)可以包含至少一種醇(a3)和任選的至少一種鹽(z2)。所述至少一種醇a3可以一定濃度存在于第二洗滌緩沖液w2中，所述濃度以體積計(jì)，在例如約70％至約100％的范圍內(nèi)，如以體積計(jì)約75％至約95％或約80％至約90％，包括其間所有范圍和子范圍。例如，a3濃度可為約70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種醇a3可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種醇a3可為乙醇。

如果存在所述至少一種鹽z2，則其可以一定的濃度存在于第二洗滌緩沖液w2中，所述濃度例如在約10mm至約100mm的范圍內(nèi)，如約20mm至約90mm、約30mm至約80mm、約40mm至約70mm或約50mm至約60mm，包括其間所有范圍和子范圍。例如，z2濃度可為約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種鹽z2可選自硫酸銨((nh4)2so4)、乙酸銨(nh4ac)、乙酸鋰(liac)、乙酸鉀(kac)、乙酸鈉(naac)、氯化鈉(nacl)及其組合。在某些非限定性的實(shí)施方式中，所述至少一種鹽z2可選自naac和nh4ac。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，第二洗滌緩沖液w2的ph可在例如約6至約8的范圍內(nèi)，如約6.2至約7.5、約6.5至約7或約6.4至約6.8，包括其間所有范圍和子范圍。第二洗滌緩沖液w2的ph可通過(guò)改變醇和/或鹽的量調(diào)節(jié)，或者可使用如本文公開(kāi)的一種或多種緩沖化合物(如冰乙酸或naoh)調(diào)節(jié)。

加入和移除洗滌緩沖液w1和w2后，可提供表面上可逆結(jié)合有核酸的修飾的磁性顆粒，其可不含或基本不含污染物(如細(xì)胞碎片、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和/或不需要的核酸)。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，接著可將由此形成的經(jīng)修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液(e1)結(jié)合以釋放結(jié)合的核酸并且將結(jié)合的核酸與磁性顆粒分離(參見(jiàn)例如圖1中的步驟e)。經(jīng)修飾的磁性顆?？稍谙疵摼彌_液e1中孵育足以釋放核酸的一段時(shí)間，如約30秒至約10分鐘，例如，約45秒至約9分鐘、約1分鐘至約8分鐘、約2分鐘至約7分鐘、約3分鐘至約6分鐘或約4分鐘至約5分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

洗脫緩沖液e1可包含例如水或相對(duì)低的鹽溶液，所述相對(duì)低的鹽溶液包含例如至少一種緩沖化合物(如tris等)、至少一種鹽和/或至少一種離子螯合劑(如edta等)。在某些實(shí)施方式中，洗脫緩沖液e1可包含約10mm至約100mm的至少一種緩沖化合物和約0.1mm至約10mm的至少一種離子螯合劑。根據(jù)一個(gè)非限定性的實(shí)施方式，洗脫緩沖液e1可包含10mmtris和1mmedta。

隨后，可從溶液中除去(不再與核酸結(jié)合的)磁性顆粒，例如使用磁體分離，從而生成作為終產(chǎn)物的溶液中的純化的核酸(參見(jiàn)例如圖1中的步驟p)。例如，本文公開(kāi)的方法和試劑盒可用于提供純化的pdna產(chǎn)物。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，本文公開(kāi)的方法和試劑盒可用于在短時(shí)間內(nèi)有效地生產(chǎn)轉(zhuǎn)染級(jí)別的pdna。例如，在非限定性的實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的方法可在小于約30分鐘的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行，如在小于約20分鐘的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的方法可在約20分鐘內(nèi)從1ml過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物(o.d.600≈1)中產(chǎn)生平均10μg的pdna。

應(yīng)理解，在一些實(shí)施方式中，各種緩沖溶液的組分可互換使用，例如可以是彼此相同的或不同的。例如，離液劑c1和c2可以是相同的或不同的。類(lèi)似地，離子螯合劑ic1和ic2；鹽z1和z2；醇a1、a2和a3；以及緩沖液b1、b2、b3和b4；分別可以是相同的或不同的。類(lèi)似地，這些組分的濃度可以變化，且在一些情況下，取決于所需應(yīng)用，這些組分的濃度可以是相同的或相似的。

還應(yīng)理解，本文公開(kāi)的方法還可包括本領(lǐng)域已知的額外步驟，如離心、過(guò)濾等。作為非限定性的實(shí)例，在加入結(jié)合緩沖液s3后，可對(duì)形成的溶液進(jìn)行離心或過(guò)濾以除去不需要的聚集體或大分子。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，還可任選地對(duì)樣品和/或磁性顆粒進(jìn)行離心。在這樣的情況下，離心可在以下范圍內(nèi)的加速度下進(jìn)行：約10,000g至約18,000g，如約12,000g至約16,000g或約14,000g至約5,000g，包括其間所有范圍和子范圍。在各個(gè)實(shí)施方式中，離心可進(jìn)行的時(shí)間段在約30秒至約15分鐘的范圍內(nèi)，例如，約1分鐘至約14分鐘、約2分鐘至約13分鐘、約3分鐘至約12分鐘、約4分鐘至約11分鐘、約5分鐘至約10分鐘、約6分鐘至約9分鐘或約7分鐘至約8分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。

在其他非限定性的實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的方法不包括任何離心步驟，這可以增強(qiáng)使過(guò)程自動(dòng)化的能力。其它任選的步驟可包括空氣干燥，例如，在用洗滌緩沖液w1和w2清洗經(jīng)修飾的磁性顆粒后，可以將顆粒干燥一段時(shí)間，所述一段時(shí)間在約1分鐘至約10分鐘的范圍內(nèi)，如約2分鐘至約9分鐘、約3分鐘至約8分鐘、約4分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘，包括其間所有范圍和子范圍。按照所需或所必要的，在本文公開(kāi)的方法期間還可將各種樣品、溶液或者樣品或溶液的部分移除到和/或轉(zhuǎn)移到新的容器(如管)中。

試劑盒

本公開(kāi)還涉及用于核酸純化的試劑盒，所述試劑盒包括懸浮緩沖液、裂解緩沖液、結(jié)合/中和緩沖液、至少一種磁性顆粒、第一洗滌緩沖液、第二洗滌緩沖液和任選的洗脫緩沖液。在各個(gè)實(shí)施方式中，參照純化方法，緩沖液可對(duì)應(yīng)于上文公開(kāi)的緩沖液s1、s2、s3、b1、w1、w2和e1。應(yīng)理解，上文討論的關(guān)于每種緩沖液的各個(gè)實(shí)施方式可以任何方法結(jié)合并且不限于形成本文公開(kāi)的試劑盒。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，在試劑盒中可以用于即用的各組分的預(yù)定濃度提供各緩沖液?；蛘?，可提供一種或多種濃縮溶液，其由終端用戶用合適類(lèi)型及合適量的溶劑稀釋成即用的緩沖液。例如，在某些實(shí)施方式中，可提供濃縮的洗滌緩沖液w2，其可由用戶用醇(如乙醇)稀釋至70％或更高的終濃度，以乙醇的體積計(jì)。

在一些實(shí)施方式中，試劑盒還可包括針對(duì)終端用戶的關(guān)于純化實(shí)驗(yàn)方案和/或任何稀釋說(shuō)明的說(shuō)明書(shū)。根據(jù)其它實(shí)施方式，試劑盒還可包含各種另外的組分或設(shè)備，如磁力架、管、離心機(jī)、用于細(xì)菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基和/或抗生素、溶劑和/或rna酶。

應(yīng)理解，各個(gè)公開(kāi)的實(shí)施方式可以涉及與特定實(shí)施方式一起描述的特定特征、元素或步驟。還應(yīng)理解，雖然以涉及某一特定實(shí)施方式的形式描述，但特定特征、元素或步驟可以多種未說(shuō)明的組合或排列方式與替代性的實(shí)施方式互換或組合。

還應(yīng)理解的是，本文所用術(shù)語(yǔ)“該”、“一個(gè)”或“一種”表示“至少一個(gè)(一種)”，并且不應(yīng)局限為“僅一個(gè)(一種)”，除非明確有相反的說(shuō)明。因此，例如，提到的“一種緩沖液”包括具有兩種或更多種這類(lèi)“緩沖液”的實(shí)例，除非文中另行明確指明。

本文中，范圍可以表示為從“約”一個(gè)具體值開(kāi)始和/或至“約”另一個(gè)具體值終止。當(dāng)表述這種范圍時(shí)，實(shí)例包括自某一具體值始和/或至另一具體值止。類(lèi)似地，當(dāng)使用先行詞“約”表示數(shù)值為近似值時(shí)，應(yīng)理解，具體數(shù)值構(gòu)成了另一個(gè)方面。還應(yīng)理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)值在與另一個(gè)端點(diǎn)值相結(jié)合以及獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)值的情況下都是有意義的。

與實(shí)施例中不同，無(wú)論是否說(shuō)明，本文所用的所有數(shù)值應(yīng)解釋為包括“約”，除非另有明確指明。然而，還應(yīng)當(dāng)理解的是，所述的每個(gè)數(shù)值也可以考慮其精確值，無(wú)論其是否在該數(shù)值前存在“約”。因此，高于“大于2m的濃度”和“大于約2m的濃度”都包括“大于約2m的濃度”以及“大于2m的濃度”的實(shí)施方式。

除非另有表述，否則都不旨在將本文所述的任意方法理解為需要使其步驟以具體順序進(jìn)行。因此，當(dāng)方法權(quán)利要求實(shí)際上沒(méi)有陳述為其步驟遵循一定的順序或者其沒(méi)有在權(quán)利要求書(shū)或說(shuō)明書(shū)中以任意其他方式具體表示步驟限于具體的順序，都不旨在暗示該任意特定順序。

雖然會(huì)用過(guò)渡語(yǔ)“包含”來(lái)公開(kāi)特定實(shí)施方式的各種特征、元素或步驟，但是應(yīng)理解的是，這暗示了包括可采用過(guò)渡語(yǔ)“由……構(gòu)成”或“基本上由……構(gòu)成”描述在內(nèi)的替代實(shí)施方式。因此，例如，包含a+b+c的緩沖液的暗示替代實(shí)施方式包括其中緩沖液由a+b+c組成的實(shí)施方式以及其中緩沖液基本上由a+b+c組成的實(shí)施方式。

對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是，可以在不偏離本公開(kāi)的范圍和精神的情況下對(duì)本公開(kāi)進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到融合了本公開(kāi)的精神和實(shí)質(zhì)的所公開(kāi)的實(shí)施方式的各種改良組合、子項(xiàng)組合和變化，因此，應(yīng)認(rèn)為本公開(kāi)包括所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的全部?jī)?nèi)容及其等同內(nèi)容。

以下的實(shí)施例旨在僅為非限制性的和說(shuō)明性的，本發(fā)明的范圍通過(guò)權(quán)利要求來(lái)限定。

實(shí)施例

示例性的純化方案

僅用于討論目的，下文提供了一種用于從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化pdna的示例性方案。當(dāng)然，該方案不旨在限制，并且不應(yīng)被理解為是對(duì)所附權(quán)利要求的限制。

a)制備細(xì)菌培養(yǎng)物樣品：使用合適的培養(yǎng)基和抗生素制備5ml的過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物，o.d.600≈1；

b)制備懸浮緩沖液：向懸浮緩沖液s1中加入rna酶直至終濃度為100μg/ml；

c)懸浮樣品：將1ml的過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至1.5微量離心管中并通過(guò)12,000g離心1分鐘收獲細(xì)胞，隨后除去培養(yǎng)介質(zhì)并使用250μl制備好的s1緩沖液重懸；

d)裂解樣品：向懸浮液中加入250μl的裂解緩沖液s2并通過(guò)顛倒最少10次進(jìn)行混合；

e)準(zhǔn)備結(jié)合：向細(xì)胞裂解液中加入350μl的結(jié)合緩沖液s3并通過(guò)顛倒最少10次進(jìn)行混合，或直至可見(jiàn)到云狀顆粒；

f)澄清細(xì)胞裂解液：將溶液在12,000g下離心10分鐘并將澄清的裂解液轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中；

g)制備磁性顆粒：使用前在水或離液劑中渦旋磁性顆粒的懸浮液至少1分鐘；

h)結(jié)合pdna：向澄清的裂解液中加入50μl磁性顆粒溶液并通過(guò)顛倒混合，隨后在室溫下孵育5分鐘；

i)分離結(jié)合了pdna的磁性顆粒：使用磁力架，將磁性顆粒與可逆結(jié)合的pdna磁性分離1分鐘并除去剩余的裂解液；

j)洗滌結(jié)合了pdna的磁性顆粒：對(duì)包含可逆結(jié)合的pdna的磁性顆粒，使用500μl的洗滌緩沖液w1洗滌一次并使用700μl的洗滌緩沖液w2洗滌一次；

k)除去洗滌緩沖液：除去洗滌緩沖液w1和w2并將具有可逆結(jié)合的pdna的磁性顆粒在磁力架上倒置，空氣干燥5分鐘；

l)洗脫pdna：從磁力架上取下管并加入100μl水(或50μl以生成更加濃縮的樣品)并在室溫下孵育1分鐘；

m)純化pdna：將管置于磁力架上1分鐘以除去磁性顆粒并將洗脫的pdna轉(zhuǎn)移至新的微量離心管中。

對(duì)比實(shí)施例1

使用上述實(shí)驗(yàn)方案用1000μgq珠或5000μg格雷斯珠從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化pdna。還使用普洛麥格公司(promega)的wizardmagnesiltfx^tm系統(tǒng)純化相同的細(xì)菌培養(yǎng)物。對(duì)每種方法的平均總pdna產(chǎn)量進(jìn)行定量并示于圖2。使用q珠的本發(fā)明方法從1ml細(xì)菌培養(yǎng)物樣品(o.d.600≈1)中得到的平均總pdna產(chǎn)量為10.0μg。使用格雷斯珠的本發(fā)明方法的平均pdna產(chǎn)量為9.2μg，而對(duì)比的普洛麥格方法產(chǎn)生10.7μgpdna。

然后通過(guò)將編碼egfp的質(zhì)粒pegfp-c1轉(zhuǎn)染至hela細(xì)胞中來(lái)確定每種pdna樣品的轉(zhuǎn)染效率。用4％多聚甲醛對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞固定15分鐘，并且用dapi染色以使細(xì)胞核可視化。使用合適濾光器獲取gfp和細(xì)胞核的熒光圖像，隨后通過(guò)首先轉(zhuǎn)換二色圖像(黑和白)和用于對(duì)gfp陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞(細(xì)胞核)進(jìn)行計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，使用imagej進(jìn)行圖像分析。通過(guò)用視野中g(shù)fp陽(yáng)性細(xì)胞除以總細(xì)胞數(shù)確定轉(zhuǎn)染效率。每種方法的轉(zhuǎn)染效率示于圖3，其中誤差條代表至少8張圖像的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于使用q珠、格雷斯珠和普洛麥格試劑盒的方法來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染效率分別為39.0％、39.6％和40.4％。

因此，圖2-3證明了與基準(zhǔn)對(duì)比性普洛麥格試劑盒相比，在約20分鐘內(nèi)進(jìn)行的本發(fā)明方法提供了相當(dāng)?shù)膒dna產(chǎn)量和質(zhì)量。

對(duì)比實(shí)施例2

使用上述實(shí)驗(yàn)方案用含sds或sdbs的裂解緩沖液s2從細(xì)菌培養(yǎng)物中純化pdna。還使用普洛麥格公司的wizardmagnesiltfx^tm系統(tǒng)純化相同的細(xì)菌培養(yǎng)物。對(duì)每種方法的平均總pdna產(chǎn)量進(jìn)行定量并示于圖4。使用sds在其中的裂解緩沖液s2的本發(fā)明方法從1ml細(xì)菌培養(yǎng)物樣品(o.d.600≈1)中得到的平均總pdna產(chǎn)量為7.3μg。使用sdbs在其中的裂解緩沖液s2的本發(fā)明方法的平均pdna產(chǎn)量為9.8μg，而對(duì)比的普洛麥格方法產(chǎn)生6.4μgpdna。

進(jìn)行下游應(yīng)用(如限制性消化和轉(zhuǎn)染)以確定每種方法所產(chǎn)生的純化的pdna的質(zhì)量。對(duì)于限制性消化，使用限制性酶ecori對(duì)pdna進(jìn)行線性化。圖5示出了對(duì)于三種不同方法，pdna樣品(未切割的a或者用ecori切割的b)的瓊脂糖凝膠電泳分析。如圖5所示，可通過(guò)限制性酶ecori消化每種方法所產(chǎn)生的pdna。

然后通過(guò)將編碼egfp的質(zhì)粒pegfp-c1轉(zhuǎn)染至hela細(xì)胞中來(lái)確定每種pdna樣品的轉(zhuǎn)染效率。用4％多聚甲醛對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞固定15分鐘，并且用dapi染色以使細(xì)胞核可視化。使用合適濾光器獲取gfp和細(xì)胞核的熒光圖像，隨后通過(guò)首先轉(zhuǎn)換二色圖像(黑和白)和用于對(duì)gfp陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞(細(xì)胞核)進(jìn)行計(jì)數(shù)的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，使用imagej進(jìn)行圖像分析。通過(guò)用視野中g(shù)fp陽(yáng)性細(xì)胞除以總細(xì)胞數(shù)確定轉(zhuǎn)染效率。每種方法的轉(zhuǎn)染效率示于圖6，其中誤差條代表至少8張圖像的標(biāo)準(zhǔn)偏差。對(duì)于使用sds裂解緩沖液、sdbs裂解緩沖液和普洛麥格試劑盒的方法來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)染效率分別為38.0％、45.4％和52.9％。

因此，圖4-6證明了與基準(zhǔn)對(duì)比性普洛麥格試劑盒相比，在約20分鐘內(nèi)進(jìn)行的本發(fā)明方法提供了改善的或相當(dāng)?shù)膒dna產(chǎn)量和/或質(zhì)量。