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一種利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位激活基因的表達(dá)方法及其應(yīng)用

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一種利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位激活基因的表達(dá)方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究領(lǐng)域,具體涉及一種利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位 激活基因的表達(dá)方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因的表達(dá)調(diào)控受到多個(gè)層次的調(diào)控,包括轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平,對(duì)于編碼基 因還包括翻譯水平和翻譯后水平的調(diào)控等等。
[0003] 不同的基因在表達(dá)的時(shí)候也受到不同形式的調(diào)控。在研究基因功能時(shí)常通過(guò)功能 缺失實(shí)驗(yàn)(loss of function)和功能獲得實(shí)驗(yàn)(gain of function)兩種方式來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基 因功能的研究。其中功能缺失實(shí)驗(yàn)常用的方式有RNA干擾技術(shù)(RNAi Interference,RNAi) 等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)基因表達(dá)的下調(diào),而功能獲得實(shí)驗(yàn)常用的方式利用表達(dá)載體表達(dá)基因的 cDNA序列實(shí)現(xiàn)基因廣物的過(guò)表達(dá)。
[0004] 表達(dá)載體是一種可以在原核生物和真核生物細(xì)胞中外源表達(dá)蛋白或者RNA的一 種環(huán)形雙鏈DNA分子,被廣泛應(yīng)用于研究蛋白、RNA等生物大分子在細(xì)胞生命活動(dòng)中的作 用。按照應(yīng)用的宿主不同可分成原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體。常見的原核表達(dá)載體有 pET系列、pQE系統(tǒng)、pGEX系列、pMAL系列等多種。而真核表達(dá)載體則根據(jù)適用的物種不同 分酵母表達(dá)載體,植物表達(dá)載體和真核哺乳動(dòng)物載體等多種。
[0005] 在目前的研究中,研究者通常將基因的cDNA序列克隆到表達(dá)載體中進(jìn)行過(guò)表達(dá), 實(shí)現(xiàn)功能過(guò)表達(dá)。此種方式已用于外源過(guò)表達(dá)蛋白編碼基因基因和外源表達(dá)microRNA 等。雖然此種方式已發(fā)展成熟,但實(shí)際操作過(guò)程中經(jīng)常會(huì)遇到很多問(wèn)題,如不能反內(nèi)源的 應(yīng)基因表達(dá)環(huán)境,表達(dá)產(chǎn)物不能實(shí)現(xiàn)正常定位等等。特別是近年來(lái)有關(guān)長(zhǎng)非編RNA (long noncodingRNA,IncRNA)的研究讓人們進(jìn)一步意識(shí)到這種表達(dá)方式存在的不足。
[0006] 長(zhǎng)非編碼RNA (long noncoding RNAs,IncRNAs)是一類存在于細(xì)胞中,長(zhǎng)度大于 200nt且不編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物或者編碼不具有功能的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA分子。已有的研究已 發(fā)現(xiàn)了多種類型的IncRNAs,且IncRNAs可通過(guò)參與染色質(zhì)重塑,染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)維持等多 種方式參與基因表達(dá)調(diào)控,同時(shí)還可參與細(xì)胞核內(nèi)亞核結(jié)構(gòu)的形成等等。
[0007] 人們發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)的表達(dá)載體進(jìn)行IncRNAs的過(guò)表達(dá)時(shí),過(guò)表達(dá)的RNA往往不能實(shí) 現(xiàn)正確的亞細(xì)胞定位。這有可能是由于過(guò)表達(dá)cDNA序列時(shí),過(guò)表達(dá)的RNA無(wú)需經(jīng)過(guò)類似于 內(nèi)源基因的RNA加工(RNA processing)過(guò)程,如剪接(splicing);同時(shí)表達(dá)成熟的IncRNA 也與外源表達(dá)的蛋白質(zhì)不同,其分子上可能不具有特殊的細(xì)胞內(nèi)不同位置的定位信號(hào)等 等。因此,一種類似內(nèi)源表達(dá)的方式實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的過(guò)表達(dá)對(duì)于研究IncRNA的功能具有十 分重要的作用。
[0008] CCAT1-L是一條在結(jié)腸癌中高表達(dá)的長(zhǎng)非編碼RNA。原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 CCAT1-L分布在細(xì)胞核中,呈點(diǎn)狀分布(如圖FiglA),并聚集在其轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)附近(如圖 FiglB)。功能獲得實(shí)驗(yàn)對(duì)于研究CCAT1-L的生物學(xué)功能具有十分重要的作用。然而,利用傳 統(tǒng)的載體過(guò)表達(dá)IncRNAs的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,利用外源載體過(guò)表達(dá)的CCAT1-L分布在整個(gè)細(xì) 胞中,即在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中都有分布(如圖FiglC)。這說(shuō)明傳統(tǒng)方式過(guò)表達(dá)的CCAT1-L 無(wú)法模擬內(nèi)源RNA的定位情況,即無(wú)法正確發(fā)揮該RNA的生物學(xué)功能。利用此種方式過(guò)表達(dá) CCAT1-L可能導(dǎo)致獲得不正確甚至錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,一種可以模擬細(xì)胞內(nèi)源CCAT1-L 過(guò)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于研究其功能具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷,提供一種利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位 激活基因的表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用,尤其是利用基因組編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基 因的表達(dá)方法及其應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明首先公開了一種原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)方法,為:通過(guò)同源重 組技術(shù),在受體的靶基因啟動(dòng)子之后,靶基因的基因序列之前,插入一個(gè)第二啟動(dòng)子及篩選 標(biāo)記基因,并通過(guò)篩選標(biāo)記篩選獲得陽(yáng)性結(jié)果。
[0011] 所述陽(yáng)性結(jié)果為篩選獲得的陽(yáng)性細(xì)胞,可培養(yǎng)所述陽(yáng)性細(xì)胞以原位激活所述長(zhǎng)非 編碼RNA基因的表達(dá)。
[0012] 所述原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá),是指激活的長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)與 內(nèi)源長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)定位一致,可以更進(jìn)一步的模擬內(nèi)源長(zhǎng)非編碼RNA的功能。
[0013] 所述靶基因即為待激活的長(zhǎng)非編碼RNA基因,具體的,如CCAT1-L。
[0014] 進(jìn)一步擴(kuò)展的,所述長(zhǎng)非編碼RNA基因也可以為編碼基因,靶基因即為待激活的 編碼基因。
[0015] 具體的,本發(fā)明的原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)方法包括下列步驟:
[0016] 1)構(gòu)建特異識(shí)別靶序列TALEN質(zhì)粒;
[0017] 2)設(shè)計(jì)并構(gòu)建Donor質(zhì)粒,所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串聯(lián)的第 二啟動(dòng)子及篩選標(biāo)記基因;
[0018] 3)將步驟1)和2)構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒和Donor質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞,通過(guò)同源重組 對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行基因組改造,培養(yǎng)受體細(xì)胞并根據(jù)篩選標(biāo)記篩選獲得陽(yáng)性結(jié)果并驗(yàn)證。 [0019] 步驟1)中,所述TALEN質(zhì)粒所針對(duì)的靶位點(diǎn)位于靶基因的啟動(dòng)子與其基因起始序 列之間。所述TALEN質(zhì)粒不應(yīng)破壞受體基因組中靶基因的啟動(dòng)子及其基因。
[0020] 步驟2)中,所述Donor質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的同源重組靶序列位于靶基因的啟動(dòng)子與其基因 起始序列之間。所述Donor質(zhì)粒能保證同源重組后,插入的啟動(dòng)子、篩選標(biāo)記基因、及靶基 因讀框正確。
[0021] 所述第二啟動(dòng)子可選自CMV啟動(dòng)子、EFlalpha啟動(dòng)子等。所述篩選標(biāo)記基因可以 為抗性基因和熒光蛋白標(biāo)記基因。所述抗性基因如puromycin (嘌呤毒素)抗性基因或者 blasticidin (殺稻瘟素)抗性基因等。所述熒光蛋白標(biāo)記基因如EGFP、YFP熒光蛋白標(biāo)記 基因等。
[0022] 進(jìn)一步的,所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間,篩選標(biāo)記基因之后,還順序插入有 終止序列及可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。該設(shè)計(jì)可實(shí)現(xiàn)靶基因可誘導(dǎo)地過(guò)表達(dá)。
[0023] 具體的,所述終止序列可為BGH和SV40兩種終止序列。該設(shè)計(jì)可完全終止第二啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄。所述可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子可為Ptight啟動(dòng)子。
[0024] 當(dāng)插入可誘導(dǎo)啟動(dòng)子時(shí),可培養(yǎng)所述陽(yáng)性細(xì)胞并誘導(dǎo)所述長(zhǎng)非編碼RNA基因的表 達(dá)。
[0025] 如本發(fā)明具體實(shí)施例列舉的,所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串聯(lián)的 CMV啟動(dòng)子、puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標(biāo)記基因。
[0026] 進(jìn)一步優(yōu)選的,所述puromycin抗性基因和EGFP突光蛋白標(biāo)記基因之間還插入有 T2A序列。
[0027] 為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)靶基因可誘導(dǎo)的過(guò)表達(dá),所述左右同源臂之間,EGFP熒光蛋白標(biāo)記 基因之后還順序插入有BGH和SV40兩種終止序列以及Ptight啟動(dòng)子。
[0028] 步驟3)中,對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的驗(yàn)證方法可以選自qPCR、Northernblot、RNA突光原位雜 交實(shí)驗(yàn)、以及RNA/DNA雙熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)。
[0029] 本發(fā)明所述的原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)方法,也可作為一種過(guò)表達(dá)長(zhǎng)非 編碼RNA基因,以模擬內(nèi)源RNA的正確定位情況,以研究RNA功能的實(shí)驗(yàn)方法。
[0030] 本發(fā)明所述的表達(dá)方法可用于原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的過(guò)表達(dá),從而應(yīng)用于 LncRNA的功能研究領(lǐng)域。所述長(zhǎng)非編碼RNA基因的過(guò)表達(dá)能實(shí)現(xiàn)正確的亞細(xì)胞定位。
[0031] 本發(fā)明所述的表達(dá)方法同樣可擴(kuò)增應(yīng)用于原位激活編碼基因的過(guò)表達(dá),從而應(yīng)用 于編碼基因的功能研究領(lǐng)域。
[0032] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)靶基因的原位激活,為過(guò)表達(dá)包括 長(zhǎng)非編碼RNA在內(nèi)的基因和研究其功能提供了新的方法和思路。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1A:野生型RNA熒光原位雜交結(jié)果
[0034] 圖1B :野生型內(nèi)源CCAT1-L RNA/DNA雙熒光原位雜交結(jié)果
[0035] 圖1C:傳統(tǒng)質(zhì)粒過(guò)表達(dá)CCAT1-L原位雜交結(jié)果
[0036] 圖2A:實(shí)施例1構(gòu)建的Donor質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖
[0037] 圖2B :實(shí)施例1基因組編輯PCR驗(yàn)證結(jié)果
[0038] 圖2C :實(shí)施例1過(guò)表達(dá)RNA RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果。WT代表野生型,1-4代表各突變 型。
[0039] 圖2D :實(shí)施例1Northernblot驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
[0040] 圖2E:實(shí)施例1RNA熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)(RNA FISH)驗(yàn)證結(jié)果
[0041] 圖2F:實(shí)施例1RNA/DNA雙熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)(RNA/DNA double FISH)驗(yàn)證結(jié)果
[0042] 圖3A:實(shí)施例2構(gòu)建的Donor質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖
[0043] 圖3B :實(shí)施例2基因組編輯PCR驗(yàn)證結(jié)果
[0044] 圖3C :實(shí)施例2過(guò)表達(dá)RNA RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果。WT代表野生型,1-4代表各突變 型。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 本發(fā)明的原位激活長(zhǎng)非編碼RNA基因的表達(dá)方法,主要通過(guò)同源重組技術(shù),在受 體的靶基因啟動(dòng)子之后,靶基因的基因序列之前,插入一個(gè)第二啟動(dòng)子及篩選標(biāo)記基因,從 而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)非編碼RNA基因的原
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