一種動(dòng)態(tài)調(diào)控蘇氨酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種動(dòng)態(tài)調(diào)控蘇氨酸 外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-蘇氨酸是一種人體必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、動(dòng)物飼料等方面。近年 來(lái)，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)L-蘇氨酸的需求量逐年增長(zhǎng)。
[0003] 發(fā)酵法是目前工業(yè)化生產(chǎn)L-蘇氨酸的主要方法，而高生產(chǎn)性能菌種的構(gòu)建是發(fā) 酵生產(chǎn)蘇氨酸的關(guān)鍵。在菌種構(gòu)建的過(guò)程中，普遍采用過(guò)表達(dá)蘇氨酸操縱子的方法增強(qiáng)蘇 氨酸的合成途徑。當(dāng)胞內(nèi)蘇氨酸產(chǎn)量積累到一定濃度時(shí)，胞內(nèi)高濃度的蘇氨酸會(huì)反饋?zhàn)瓒?和抑制蘇氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶，甚至激活蘇氨酸的降解途徑。蘇氨酸外排則成為限制蘇 氨酸高效合成的步驟，因此需要加速蘇氨酸向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步提高菌種的蘇氨酸生產(chǎn)性 能。在公開(kāi)的文獻(xiàn)中已經(jīng)鑒定出多種蘇氨酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，如大腸桿菌的蘇氨酸外排 蛋白基因rhtA、rhtB和rhtC，谷氨酸棒桿菌的thrE基因等。在已公開(kāi)的蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn) 技術(shù)中，通過(guò)簡(jiǎn)單的過(guò)表達(dá)上述蘇氨酸外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可以提高蘇氨酸的產(chǎn)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。
[0005] 本發(fā)明提供的方法，為如下A或B :
[0006] A所示的方法包括如下步驟：將阻遏蛋白基因表達(dá)元件和蘇氨酸外排基因表達(dá)元 件導(dǎo)入出發(fā)細(xì)菌中，得到重組菌；
[0007] B所示的方法包括如下步驟：將阻遏蛋白基因表達(dá)元件、蘇氨酸外排基因表達(dá)元 件和突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件導(dǎo)入出發(fā)細(xì)菌中，得到重組菌；
[0008] 所述蘇氨酸外排基因表達(dá)元件包括蘇氨酸外排基因、驅(qū)動(dòng)蘇氨酸外排基因表達(dá)的 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和位于二者之間的調(diào)控區(qū)；
[0009] 所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件包括阻遏蛋白基因及驅(qū)動(dòng)阻遏蛋白基因表達(dá)的啟動(dòng) 子；
[0010] 所述突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件包括突變蘇氨酸操縱子和驅(qū)動(dòng)突變蘇氨酸操縱 子表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0011] 上述方法中，
[0012] B所示的方法中，所述導(dǎo)入方式為如下1)或2):
[0013] 1)將所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件、所述蘇氨酸外排基因表達(dá)元件和所述突變蘇氨 酸操縱子表達(dá)元件通過(guò)重組載體A導(dǎo)入出發(fā)細(xì)菌中，得到重組菌；
[0014] 2)將所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件和所述蘇氨酸外排基因表達(dá)元件通過(guò)重組載體 B導(dǎo)入出發(fā)細(xì)菌中，且將所述突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件通過(guò)同源重組導(dǎo)入所述出發(fā)細(xì)菌 中,得到重組菌。
[0015] 上述方法中，1)中，所述重組載體A為將所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件、所述蘇氨酸 外排基因表達(dá)元件和所述突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件插入表達(dá)載體中得到的載體；
[0016] 2)中，所述重組載體B為將所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件和所述蘇氨酸外排基因表 達(dá)元件插入表達(dá)載體中得到的載體；
[0017] 所述同源重組為將突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件以含有突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元 件的片段的形式同源重組到所述出發(fā)細(xì)菌中。
[0018] 上述方法中，所述蘇氨酸外排基因?yàn)閞htC或rhtC和rhtB或rhtC、rhtB和rhtA ;
[0019] 所述驅(qū)動(dòng)蘇氨酸外排基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為PT5 ;
[0020] 所述調(diào)控區(qū)為Ocmt ;
[0021] 所述驅(qū)動(dòng)阻遏蛋白基因表達(dá)的啟動(dòng)子為Pta ;
[0022] 所述突變蘇氨酸操縱子為突變蘇氨酸操縱子thrAei°34TBC
[0023] 所述驅(qū)動(dòng)突變蘇氨酸操縱子表達(dá)的啟動(dòng)子為PPp
[0024] 上述方法中，所述啟動(dòng)子PT5的核苷酸序列為序列表中的序列3或4或5自5'末 端第1-59位核苷酸；
[0025] 所述蘇氨酸外排基因rhtC的核苷酸序列為序列表中的序列3自5'末端第92-835 位核苷酸或序列表中的序列4自5'末端第92-733位核苷酸或序列表中的序列5自5'末 端第92-733位核苷酸；
[0026] 所述蘇氨酸外排基因rhtA的核苷酸序列為序列表中的序列4自5'末端第 734-1706位核苷酸或序列表中的序列5自5'末端第734-1637位核苷酸；
[0027] 所述蘇氨酸外排基因rhtB的核苷酸序列為序列表中的序列5自5'末端第 1638-2342位核苷酸；
[0028] 所述Ocmt的核苷酸序列為序列表中的序列3或4或5自5'末端第60-91位核苷 酸；
[0029] 所述啟動(dòng)子Pkm的核苷酸序列為序列表中的序列2自5'末端第1-144位核苷酸；
[0030] 所述阻遏蛋白基因的核苷酸序列為序列表中的序列2自5'末端第145-917位核 苷酸；
[0031] 所述突變蘇氨酸操縱子thrAei°34TBC的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端 第688-5654位核苷酸；
[0032] 所述啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端第520-687位核苷 酸。
[0033] 上述方法中，所述阻遏蛋白基因表達(dá)元件的核苷酸序列為序列表中的序列2 ;
[0034] 所述蘇氨酸外排基因表達(dá)元件的核苷酸序列為序列表中的序列3或序列4或序列 5 ；
[0035] 所述突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件的核苷酸序列為序列表中的序列1自5'末端第 520-5654位核苷酸；
[0036] 所述含有突變蘇氨酸操縱子表達(dá)元件的片段的核苷酸序列為序列表中的序列1。
[0037] 上述方法中，所述出發(fā)細(xì)菌為敲除細(xì)菌中編碼高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶 (homoserine〇-succinyltransferase)的 metA 基因、編碼蘇氨酸脫氨酶（threonine deaminase)的 ilvA 基因、編碼 DAP 脫羧酶（diaminopimelate decarboxylase)的 lysA 基 因、編碼蘇氨酸脫水酶（threonine dehydrogenase)的tdh基因、編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (也可以稱為serine/threonine:H+symporter)的tdcC基因和編碼蘇氨酸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（也 可以稱為serine/threonine:Na+symporter)的sstT基因共6種基因得到的菌。
[0038] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述出發(fā)細(xì)菌為依次敲除metA基因、i 1 vA基因、ly sA基因、 tdh基因、tdcC基因和sstT基因共6種基因得到的菌。
[0039] 上述細(xì)菌為埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選是大腸桿菌，如大腸桿菌K-12菌株的后續(xù)菌 株，包括W3110衍生的菌株。由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0040] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生成蘇氨酸的方法。
[0041] 本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：發(fā)酵培養(yǎng)上述的重組菌，且在所述重組菌的第 二生長(zhǎng)階段進(jìn)行對(duì)異丙基苯甲酸誘導(dǎo)，收集發(fā)酵產(chǎn)物的上清液，得到蘇氨酸；
[0042] 所述第二生長(zhǎng)階段為指數(shù)生長(zhǎng)后期、穩(wěn)定期或衰亡期。
[0043] 所述指數(shù)生長(zhǎng)后期為自發(fā)酵培養(yǎng)起第13-15小時(shí)；
[0044] 所述穩(wěn)定期為自發(fā)酵培養(yǎng)起第16-50小時(shí)；
[0045] 所述衰亡期為自發(fā)酵培養(yǎng)起第50-96小時(shí)。
[0046] 上述方法中，所述對(duì)異丙基苯甲酸誘導(dǎo)為向發(fā)酵體系中添加終濃度為5- 1000μmol/L對(duì)異丙基苯甲酸；
[0047] 所述對(duì)異丙基苯甲酸誘導(dǎo)具體為向發(fā)酵體系中添加終濃度為5- 500 iimol/L對(duì) 異丙基苯甲酸。
[0048] 所述方法還包括如下步驟：在所述發(fā)酵培養(yǎng)中補(bǔ)加葡萄糖，使葡萄糖在發(fā)酵體系 中的濃度維持在10±5g/L ;且在所述發(fā)酵培養(yǎng)中按照質(zhì)量比為0. 6 :1. 0 :1. 3補(bǔ)加蛋氨酸、 異亮氨酸和賴氨酸，使菌體比生長(zhǎng)速率維持在〇. 12-0. 2h'
[0049] 在本發(fā)明的實(shí)施例中，在所述重組菌的穩(wěn)定期進(jìn)行對(duì)異丙基苯甲酸誘導(dǎo)，即在自 發(fā)酵培養(yǎng)起第16小時(shí)發(fā)酵體系中添加終濃度為100 ymol/L對(duì)異丙基苯甲酸進(jìn)行誘導(dǎo)。
[0050] 或一種重組載體，為上述方法中的重組載體。
[0051] 在本發(fā)明中，發(fā)酵方式可以使分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵、半連續(xù)發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵 (微生物工程工藝原理，姚汝華周世水)，優(yōu)選為補(bǔ)料分批發(fā)酵。在理想狀態(tài)下，微生物在液 體發(fā)酵培養(yǎng)基中的典型發(fā)酵曲線包括延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期(微生物學(xué)教程，周 德慶；微生物學(xué)，I.E.阿克莫著)。在實(shí)際的發(fā)酵過(guò)程中，在指數(shù)期和穩(wěn)定期之間存在菌體 緩慢生長(zhǎng)的階段，稱為指數(shù)生長(zhǎng)后期。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"發(fā)酵過(guò)程的第二階段"包括指數(shù) 生長(zhǎng)后期、穩(wěn)定期和衰亡期，而術(shù)語(yǔ)