專利名稱：Stat－1－依賴性基因的表達(dá)調(diào)控的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO1至43的核酸序列的誘餌寡核苷酸(decoy-oligonucleotide)和反義寡核苷酸(antisense-oligonucleotide)以及這些寡核苷酸作為藥物的用途。
現(xiàn)有技術(shù)人類基因組解密的一項(xiàng)主要目標(biāo)在于分別鑒定出致病基因(由于其產(chǎn)物之作用方式所致)與此類基因所具結(jié)構(gòu)的致病性變化(多形現(xiàn)象)，并將其歸類到一種疾病模式。所以，對(duì)于大部份的疾病，若其被認(rèn)定為由一經(jīng)確定數(shù)目的基因產(chǎn)物表達(dá)得太強(qiáng)、太弱或缺陷所引起時(shí)，就會(huì)達(dá)到由原因所決定的治療法。事實(shí)上，對(duì)于一組遺傳疾病(例如囊性纖維化)就已經(jīng)知道通常為單一基因缺陷(單基因性疾病)，而對(duì)于其他疾病(例如高血壓)則顯得明顯更為復(fù)雜。后者顯然地不是單一而是多重基因缺陷的結(jié)果(多基因性疾病)，預(yù)先確定了罹患者會(huì)發(fā)展出與某些環(huán)境因素吻合的疾病。盡管此事實(shí)會(huì)限制對(duì)于在一或多重基因的表達(dá)中的目標(biāo)導(dǎo)向性介入，卻也為一種基于原因而非僅僅基于癥狀的治療法提供了一個(gè)契機(jī)。
轉(zhuǎn)錄因子為DNA-結(jié)合蛋白質(zhì)，其會(huì)結(jié)合到在細(xì)胞核內(nèi)部一或多重基因的啟動(dòng)子區(qū)，由此調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，亦即這些基因所編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。除了控制人體內(nèi)發(fā)育和分化的過(guò)程的重要生理作用之外，轉(zhuǎn)錄因子也顯示出高度的誘發(fā)疾病之潛在性，特別是其會(huì)在錯(cuò)誤的時(shí)間點(diǎn)活化基因表達(dá)。此外(可能為相同的)轉(zhuǎn)錄因子可能阻斷具有保護(hù)功能的基因而有使疾病易于形成。于此范圍內(nèi)，在下面所述抗-轉(zhuǎn)錄因子治療法的原理中，其目標(biāo)系在致病性基因的抑制與相對(duì)的保護(hù)性基因之活化。
炎癥為生物體和其組織對(duì)抗損傷性刺激的一種防衛(wèi)反應(yīng)，其目標(biāo)在于該損傷的糾正或至少將其限制在局部，并消除掉損傷的誘因(例如入侵的細(xì)菌或外來(lái)物質(zhì))。炎癥的誘發(fā)物可能為微生物(細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲(chóng))，外來(lái)物質(zhì)(花粉、石棉或硅酸鹽結(jié)晶)，機(jī)械性損傷、化學(xué)有害因子和物理影響所致組織破壞，以及來(lái)自身體本身的誘發(fā)物(崩潰性腫瘤細(xì)胞、血管外血液、自身免疫性反應(yīng))或體內(nèi)沉淀物質(zhì)的結(jié)晶(尿酸、草酸鈣和磷酸鈣、膽固醇)。
肥大細(xì)胞(組織內(nèi)部者)或血液內(nèi)的嗜堿性粒細(xì)胞等的快速活化即為觸發(fā)非常強(qiáng)的急性炎癥反應(yīng)的一個(gè)例子，且為免疫學(xué)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)(I型體液變態(tài)反應(yīng)(humoral allergy type I)的特征。若生物體已經(jīng)在事先接觸到抗原(或于過(guò)敏性的情況中接觸到過(guò)敏原)，則B-淋巴細(xì)胞會(huì)被致敏作為對(duì)此的反應(yīng)。B-淋巴細(xì)胞會(huì)與事先致敏的CD4-陽(yáng)性2型T-輔助細(xì)胞(Th2細(xì)胞)配合而轉(zhuǎn)換成為漿細(xì)胞(plasmocyte)，且開(kāi)始產(chǎn)生對(duì)抗抗原的IgE-型抗體。于此分化過(guò)程中，由表達(dá)出相應(yīng)配體(CD154)的Th2細(xì)胞通過(guò)CD40-受體產(chǎn)生的B-淋巴細(xì)胞之共刺激具有關(guān)鍵重要性。當(dāng)攜帶著抗原的IgE-抗體結(jié)合到肥大細(xì)胞上面的相應(yīng)受體(Fcε型)時(shí)，這些細(xì)胞即開(kāi)始釋放不同的炎癥介質(zhì)，特別是組織胺、白介素-8、白三烯類、和腫瘤壞死因子-α(TNFα)。其結(jié)果為吸引專職的炎性細(xì)胞特別是嗜酸性(eosinophile)和嗜中性(neutrophile)粒細(xì)胞和單核細(xì)胞以及現(xiàn)場(chǎng)的T-淋巴細(xì)胞(趨化學(xué)性)。同時(shí)會(huì)發(fā)生組織胺依賴性血管擴(kuò)張及覆蓋血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞的通透性之增加。由于血管擴(kuò)張，流動(dòng)速度的減低有助于在受吸引的白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間建立物理接觸。暴露于細(xì)胞因子(例如TNFα)且由此被活化的這些內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)顯示出選擇蛋白(selectin)(例如E-選擇蛋白)在其血管腔表面上的強(qiáng)化表達(dá)，促成白細(xì)胞沿著內(nèi)皮細(xì)胞滾動(dòng)且由此使其他粘附分子(整聯(lián)蛋白(integrin)；例如細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1)[ICAM-1]或血管細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1)[VCAM-1])活化。至此白細(xì)胞可粘附到血管壁(邊緣化(margination))且組織胺-相關(guān)聯(lián)的通透性之增加(內(nèi)皮細(xì)胞聯(lián)結(jié)的松散)有利于其移動(dòng)到血管外空間之內(nèi)(血球滲出)。于此同時(shí)，增加量的富蛋白質(zhì)流體(炎性滲出液)達(dá)到間質(zhì)空間而形成水腫。周遭的神經(jīng)末端會(huì)被組織內(nèi)增加的壓力與炎性細(xì)胞產(chǎn)生的其他介質(zhì)所刺激并觸動(dòng)疼痛而意識(shí)到組織的損傷。
已經(jīng)移動(dòng)到炎癥部位的粒細(xì)胞與已經(jīng)再分化成巨噬細(xì)胞的單核細(xì)胞都嘗試分別通過(guò)吞噬作用和胞溶作用消除掉炎癥誘發(fā)因素，由此觸發(fā)蛋白水解酶和氧自由基等的釋放，而這也可能損傷周遭組織的。特別是巨噬細(xì)胞的活化可能從許多方面(例如進(jìn)一步釋放細(xì)胞因子如白介素-1β和白介素-6)促成使得整個(gè)生物體參與了最初為局部的炎癥反應(yīng)，這就是所謂的急性時(shí)相反應(yīng)(acute phase reaction)。急性時(shí)相反應(yīng)的代表性特性為疲勞、無(wú)精打采和發(fā)熱，白細(xì)胞從骨髓的釋放增加(白細(xì)胞增多)，在血液內(nèi)檢測(cè)到急性時(shí)相蛋白質(zhì)(例如C-反應(yīng)性蛋白質(zhì))，免疫系統(tǒng)的刺激以及因?yàn)楦淖兒蟮男玛惔x狀態(tài)所致體重減低。
若炎癥的誘因可以消除時(shí)，傷口愈合的過(guò)程會(huì)與破壞組織的修復(fù)同步。最佳者為此過(guò)程會(huì)達(dá)到完整的再建立(完全恢復(fù)(restitutio adintegrum))，而更大的損傷或結(jié)締組織(尤其是膠原蛋白)的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致瘢痕的形成，其可能伴隨著取決于受害組織的相當(dāng)程度的功能障礙。若誘因(外來(lái)物質(zhì)或傷口感染)不能一次消除掉，則傷口愈合會(huì)延緩，同時(shí)增加吞噬細(xì)胞的遷移和活性，造成組織的毀滅(壞死)到甚至于腔洞的形成(膿腫)。其結(jié)果幾乎總是有瘢痕的組織重建伴隨著相應(yīng)的功能損失。若不能成功地將來(lái)源于誘因的炎癥限制在局部，則該炎癥會(huì)透過(guò)淋巴系統(tǒng)散布到整個(gè)生物體。其結(jié)果是可能有致命危險(xiǎn)的敗血癥(感染性休克)。
若炎癥和痊愈過(guò)程呈平衡情況，傷口痊愈也會(huì)受到干擾。其結(jié)果為慢性炎癥，可能到制纖維化(過(guò)多膠原蛋白合成)或肉芽腫性(炎性細(xì)胞組織化成為肉芽組織)且時(shí)常會(huì)分別帶來(lái)受害組織的連續(xù)性破壞與其所具功能的逐步受限。
除了所述可能慢性進(jìn)展的一般炎癥反應(yīng)之外，炎性疾病還會(huì)針對(duì)根本的發(fā)病機(jī)理展現(xiàn)出一般表現(xiàn)與不同的差異。兩種這些類型的疾病為例如心臟手術(shù)介入之后的并發(fā)癥與免疫不相容性反應(yīng)，因其具有巨大的臨床相關(guān)性而在本說(shuō)明書中給予較多的篇幅。
以基于球囊插管的機(jī)械擴(kuò)張(經(jīng)皮血管成形術(shù))與利用靜脈搭橋的動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄化動(dòng)脈搭橋術(shù)仍然分別構(gòu)成患有冠狀動(dòng)脈疾病與周圍循環(huán)疾病的患者之首選治療法以分別提供對(duì)抗即將發(fā)生的梗塞或器官衰竭之保護(hù)。不過(guò)經(jīng)過(guò)機(jī)械擴(kuò)張與(在大部分情況中)使用金屬血管支撐器(支架(stent))處理的動(dòng)脈之再堵塞(再狹窄)率顯然高得不可接受，于6個(gè)月內(nèi)達(dá)20-50％。此外，分別針對(duì)有關(guān)手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)背景與手術(shù)后的風(fēng)險(xiǎn)而論，主動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈和周圍靜脈搭橋于5年之后50-70％的再堵塞率對(duì)于接受治療的患者則不僅是令人不滿而已。也許是因?yàn)檠鼙诘膿p傷(此處受影響者包括內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞)之故，血管成形術(shù)之后的再狹窄在早期階段別會(huì)顯示出一種明顯的炎癥反應(yīng)成分，其特征為，與其他一起者，血管壁被專職炎性細(xì)胞所侵潤(rùn)(主要為單核細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞)。在主動(dòng)脈冠狀動(dòng)脈與周圍靜脈搭橋之內(nèi)的纖維增生性狹窄形成(血管內(nèi)膜增殖(intimal hyperplasia))似乎也分別基于炎癥反應(yīng)，特別是由機(jī)械和物理病因所引起者。長(zhǎng)久以來(lái)就已經(jīng)知道在外科介入或器官移植范疇中的所謂缺血/再注入-相關(guān)性損傷會(huì)伴隨著以炎癥為基礎(chǔ)的組織損傷，其中在內(nèi)皮細(xì)胞與專職炎性細(xì)胞(主要為粒細(xì)胞不過(guò)也包括單核細(xì)胞和T-淋巴細(xì)胞)之間的相互作用以及組織損傷性物質(zhì)(氧自由基，細(xì)胞因子)的釋放起著十分關(guān)鍵性作用。
關(guān)于所提及的心血管并發(fā)癥，重要的是要有保護(hù)機(jī)制，最重要的是在血管壁的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞之內(nèi)。其有助于限制炎癥反應(yīng)的程度與隨后的組織之適應(yīng)性重建。對(duì)此方面，舉例而言，有屬于在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的由NO-合成酶進(jìn)行的一氧化氮(NO)之合成。NO，可能起著氧自由基超氧化物的內(nèi)源性拮抗劑之作用，因此，與其他一起者，會(huì)抑制促炎性細(xì)胞因子(例如，單核細(xì)胞趨化性蛋白質(zhì)-1(monocyte chemoattractantprotein-1)(MCP-1)與粘附分子(例如ICAM-1)在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，生長(zhǎng)因子受體(例如內(nèi)皮素B-受體)在平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)以及生長(zhǎng)因子從白細(xì)胞的釋放。如此，可以容易地了解者，機(jī)械性損傷就如內(nèi)皮的功能性損傷(例如在這些細(xì)胞內(nèi)由細(xì)胞因子誘發(fā)的NO-合成酶表達(dá)之減低)會(huì)抵消形成所提及的心血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)之炎癥過(guò)程與隨后的纖維增生性血管壁重建。
要在血管成形術(shù)之后以藥物方式驗(yàn)證再狹窄的所有先前嘗試都不能在大部分患者體內(nèi)達(dá)到合意的效應(yīng)。目前，有兩種局部治療原理是較有利者已經(jīng)認(rèn)可過(guò)的血管內(nèi)近距放射線治療法(vascular brachytherapy)，即通過(guò)對(duì)擴(kuò)張血管段施以短時(shí)間放射照射以檢查細(xì)胞生長(zhǎng)之方法，以及仍然處于臨床試驗(yàn)中的藥物洗脫支架(drug-eluting stent)。此方法包括用“飽含(impregnated)”生長(zhǎng)抑制性藥物(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑和免疫抑制劑)的聚合物涂覆支架，并于數(shù)周期間將該等藥物慢慢地釋放出。大部分最近的臨床研究證明雖然有令人鼓舞的初始結(jié)果，但是這兩種治療做法都不能免于某些程度的嚴(yán)重問(wèn)題(例如引發(fā)梗塞危險(xiǎn)的支架內(nèi)血栓形成(in-stent-thrombosis))。
除了已經(jīng)描述過(guò)的I型免疫不相容性反應(yīng)之外，原則上還有四種在免疫調(diào)節(jié)上分別為變應(yīng)性和障礙的其他形式。I型反應(yīng)本身在致敏化(allergisation)完成之后主要可分為兩個(gè)階段血管活性炎性介質(zhì)從結(jié)合了IgE的肥大細(xì)胞快速釋放出和再生，以及由被吸引的嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞所介導(dǎo)的晚期反應(yīng)。完整的I型反應(yīng)可能依據(jù)對(duì)過(guò)敏原的暴露而局部性或系統(tǒng)性發(fā)生。呼吸空氣中的過(guò)敏原會(huì)誘發(fā)呼吸道中的反應(yīng)，典型地會(huì)并發(fā)粘膜水腫和過(guò)度分泌(變應(yīng)性鼻病，枯草熱)以及支氣管痙攣(哮喘)，而營(yíng)養(yǎng)物中的過(guò)敏原則誘發(fā)胃腸道癥狀如惡心、嘔吐和腹瀉。皮膚對(duì)過(guò)敏原的反應(yīng)為發(fā)癢與蕁麻疹以及異位性皮炎(atopicdermatitis)(神經(jīng)性皮炎)。不過(guò)，假使過(guò)敏原直接進(jìn)入到血流之內(nèi)(例如血液制品的注入，藥物)或假若對(duì)過(guò)敏原的暴露特別地強(qiáng)，會(huì)導(dǎo)致全身立即出現(xiàn)反應(yīng)，可能招致威脅生命的血壓降低(過(guò)敏性休克)。
于II型反應(yīng)的情況中，是由具有抗原活性的細(xì)胞(例如外來(lái)的血細(xì)胞)或細(xì)胞外蛋白質(zhì)(例如在體內(nèi)天然存在的細(xì)胞表面上被藥物誘導(dǎo)的變化)起中心作用。于致敏化之后，再次接觸導(dǎo)致IgG-和IgM-型過(guò)敏原特異性抗體的產(chǎn)生，這些可大量地結(jié)合到過(guò)敏原性細(xì)胞(調(diào)理作用(opsonisation))。由此將補(bǔ)體系統(tǒng)(膜作用性復(fù)合物之形成)和一特別的淋巴細(xì)胞亞群，天然殺手細(xì)胞(NK-細(xì)胞)等予以活化。其結(jié)果為過(guò)敏原性細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞溶解作用(cytolysis)而破壞。當(dāng)自身抗體作用到身體內(nèi)天然產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)例如腎血管球微血管的基底膜時(shí)，也會(huì)誘發(fā)類似的反應(yīng)且由此誘發(fā)伴有急性腎功能不全之急進(jìn)型腎小球腎炎。除了1型T-輔助細(xì)胞(Th1-細(xì)胞，參看下文)之外，經(jīng)活化的NK-細(xì)胞為干擾素-γ的主要產(chǎn)生者，干擾素-γ為一種細(xì)胞因子，可大幅地強(qiáng)化炎癥反應(yīng)，特別是通過(guò)將巨噬細(xì)胞活化的炎癥反應(yīng)。
III型反應(yīng)的特征在于免疫復(fù)合物(抗原-抗體復(fù)合物)的形成和沉積，隨后活化補(bǔ)體系統(tǒng)與吞噬細(xì)胞(粒細(xì)胞，巨噬細(xì)胞)。這些細(xì)胞會(huì)在血液中循環(huán)且繼而主要沉積于腎血管球的微血管之內(nèi)，不過(guò)也會(huì)沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)或皮膚內(nèi)。由此誘發(fā)出的炎癥反應(yīng)可能帶來(lái)(免疫復(fù)合物性)腎小球腎炎，關(guān)節(jié)內(nèi)疼痛以及蕁麻疹。若免疫系統(tǒng)不能消除掉誘因劑(例如鏈球菌)之時(shí)，感染也可能誘發(fā)系統(tǒng)性III型反應(yīng)。代表性局部III型反應(yīng)為免疫接種之后皮膚內(nèi)的所謂Arthus反應(yīng)或于抗原-抗體復(fù)合物在肺部中沉積的情況中發(fā)生的外源性過(guò)敏性肺胞炎(例如養(yǎng)鳥(niǎo)人肺(bird-breederlung))。系統(tǒng)性紅斑狼瘡也是一種III型反應(yīng)不過(guò)因?yàn)橛凶陨砜贵w之形成而歸屬于自身免疫性疾病。
與前面所提及的過(guò)敏性反應(yīng)不同，IV型反應(yīng)不是體液性而是細(xì)胞性且經(jīng)常要到數(shù)天之后才會(huì)達(dá)到其最高點(diǎn)(遲發(fā)型反應(yīng)或遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng))。誘發(fā)劑主要為蛋白質(zhì)、侵入的外來(lái)生物體(細(xì)菌、病毒、真菌和寄生體)，其他外來(lái)蛋白質(zhì)(例如于乳糜瀉情況中的小麥衍生之麥膠蛋白(gliadin))以及半抗原(haptens)(藥物、金屬[例如接觸性皮膚炎情況中的鎳]，化妝品與植物成分)。移植器官的原發(fā)性排異也是一種IV型反應(yīng)?？乖瓡?huì)被(組織)巨噬細(xì)胞所吞噬、處理與呈遞給純真T-輔助細(xì)胞(CD4-陽(yáng)性)；T-輔助細(xì)胞的致敏化需要花數(shù)天之久。以此種方式第二次接觸時(shí)T-輔助細(xì)胞會(huì)變更成為Th1-細(xì)胞；其中CD-154介導(dǎo)的抗原呈遞細(xì)胞(此細(xì)胞系表達(dá)CD40-受體)之共刺激扮有重要角色，因?yàn)榇朔N信號(hào)途徑可觸發(fā)白介素-12從巨噬細(xì)胞被釋放出來(lái)。白介素-12可起始T-輔助細(xì)胞的分化與增生。Th1-細(xì)胞本身則通過(guò)某些生長(zhǎng)因子(例如GM-CSF)而激發(fā)骨髓中的單核細(xì)胞形成，利用某些細(xì)胞因子(例如MIF)使之得到補(bǔ)充，并通過(guò)釋放IFNγ使之活化。如此所得非常強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)可能大規(guī)模破壞身體內(nèi)正常的組織(例如結(jié)核病)或移植的組織。再者，CD8-陽(yáng)性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞參與了移植物排異(細(xì)胞溶解)，該CD8-陽(yáng)性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞能夠辨識(shí)其目標(biāo)(外來(lái)細(xì)胞表面)，且相應(yīng)地僅通過(guò)像CD4-陽(yáng)性Th1細(xì)胞一般以事先的抗原呈遞將其“武裝”起來(lái)。
類似于IV型反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)障礙可形成例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化(自身反應(yīng)性Th1-細(xì)胞)以及糖尿病(自身反應(yīng)性細(xì)胞毒性T-細(xì)胞)的基礎(chǔ)。除了細(xì)菌超抗原(例如TBC誘因劑)和相應(yīng)的遺傳傾向(例如MHC-蛋白，Th1/Th2平衡缺失)之外，經(jīng)針對(duì)一些誘因劑(例如鏈球菌)之特定抗原的、與自身抗原(在身體內(nèi)產(chǎn)生，分子模擬)交叉反應(yīng)的T-細(xì)胞也可能對(duì)這些自身免疫疾病起著作用。不同的是，第V型反應(yīng)可能通過(guò)，與其他一起者，活化或阻斷激素受體的自體抗體(例如于Basedow’s病中的促甲狀腺激素(thyrotropin))或神經(jīng)遞質(zhì)受體(例如在重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis)中的乙酰膽堿)而引發(fā)。
與移植物排異可相比—但相反義者—為移植物抗宿主病(graft versushost disease)(GVHD)，其出現(xiàn)于約40％受者的異體骨髓轉(zhuǎn)植(遺傳學(xué)上不相同的諸個(gè)體之間)的過(guò)程中。于持續(xù)長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月的急性期中，已經(jīng)與干細(xì)胞一同輸注的供體的T-細(xì)胞會(huì)攻擊宿主生物體。所造成的可能為嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)會(huì)優(yōu)先顯示在皮膚、胃腸道和肝臟。
為了治療有關(guān)的誘因引起的急性炎病，經(jīng)常是分別利用非甾體類消炎藥(NSAID，與其他一起，抑制前列腺素之合成)及/或抗感染藥物(殺滅細(xì)菌、真菌或寄生蟲(chóng))和抗病毒化療藥物，偶然也會(huì)采用臨時(shí)局部施用糖皮質(zhì)激素(基因表達(dá)的通用抑制劑)。于嚴(yán)重或慢性復(fù)發(fā)性炎性疾病的情況中，可進(jìn)行全身方式施用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑(抑制T-細(xì)胞活化)或細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑例如氨甲喋呤(methotrexate)。此亦分別用于器官和骨髓的移植。雖然其具有無(wú)可置疑的治療效用，不過(guò)所提及的藥物的全身性施用仍然可能引發(fā)嚴(yán)重的副作用，尤其是在長(zhǎng)期施用之時(shí)。例如，服用氨甲喋呤2或更多年的患者之中有多達(dá)25％會(huì)發(fā)展出嚴(yán)重的肝硬化。更近的特別是用于慢性復(fù)發(fā)性炎性疾病之活性藥物可阻斷TNFα的促炎癥效應(yīng)(proinflammatory effect)分別針對(duì)細(xì)胞因子本身及其受體的抗體，受體的低分子量拮抗劑以及會(huì)捕捉細(xì)胞因子的經(jīng)重組產(chǎn)生的可溶性受體蛋白質(zhì)。不過(guò)在使用受體蛋白質(zhì)治療的過(guò)程中，有越來(lái)越多的跡象顯示感染性疾病(與其他一起者結(jié)核病)的發(fā)生率有增加，且有約40％的患者似乎對(duì)于治療根本沒(méi)有反應(yīng)(無(wú)反應(yīng)者)。此外，對(duì)于經(jīng)認(rèn)可的人源化TNFα-抗體，在起始治療2-4年之后，也有關(guān)于會(huì)引起感染乃至發(fā)生敗血癥的相應(yīng)的警告。再者，此兩種活性藥物在緊急事件中都是禁忌使用者。此外，經(jīng)認(rèn)可者還有主要用于治療哮喘的、白三烯類受體的低分子量拮抗劑，以及環(huán)加氧酶-2(cyclooxygenase-2)的抑制劑，一種新穎的，具有比傳統(tǒng)NSAID顯著減低的胃腸副作用的非甾體類消炎藥(NSAID)。再者，有一系列其他——通常為經(jīng)人源化的——抗體或反義寡核苷酸為基礎(chǔ)的方法分別用以對(duì)抗白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附分子、T-輔助細(xì)胞的細(xì)胞因子受體或IgE-抗體，這些正處于不同的臨床試驗(yàn)階段之中。為了避免使用糖皮質(zhì)激素和抗感染劑一類的藥物，必須一致地將所提及的藥物特異地導(dǎo)向于與治療有相關(guān)性的目標(biāo)分子。
綜上所述，本發(fā)明以下述問(wèn)題為基礎(chǔ)針對(duì)受患病人的罹病率和死亡率提供物質(zhì)用以預(yù)防或治療過(guò)度的炎癥反應(yīng)及與此伴隨的并發(fā)癥。
該問(wèn)題系由本專利權(quán)利要求書所界定的主題予以解決。


本發(fā)明要用下面諸圖式予以更詳細(xì)地說(shuō)明。
圖1顯示出在經(jīng)培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細(xì)胞中利用相應(yīng)的順式作用元件誘餌(cis-element-decoy)(SEQ ID NO33)中和轉(zhuǎn)錄因子STAT-1以抑制經(jīng)細(xì)胞因子刺激的CD40(a、b、d和e)、E-選擇蛋白和MCP-1之表達(dá)(a)以及經(jīng)CD40配體誘導(dǎo)的白介素-12p40表達(dá)。(a)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)或NF-κB順式作用元件誘餌(10μM)預(yù)孵育4小時(shí)且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育9小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的E-選擇蛋白、MCP-1和CD40 mRNA-表達(dá)之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計(jì)分析(“強(qiáng)度”)表為經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品rp132進(jìn)行參比)。(b)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(10μM；SEQ ID NO33)預(yù)孵育4小時(shí)且隨后與約670000個(gè)P3xTB.A7-細(xì)胞/毫升(這些小鼠骨髓瘤細(xì)胞會(huì)穩(wěn)定地表達(dá)人類CD40-配體CD154)和1000U/毫升干擾素-γ孵育12小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的白介素-12p40 mRNA-表達(dá)之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計(jì)分析(“強(qiáng)度”)表為經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品rp132進(jìn)行參比)。(c)在經(jīng)與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)或相應(yīng)的對(duì)照寡核苷酸(STAT-1-25mut)預(yù)孵育4小時(shí)(濃度10μM)且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育12小時(shí)的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的CD40 mRNA-表達(dá)之代表性RT-PCR-分析(此外將光密度計(jì)分析(“強(qiáng)度”)表為經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品EF-1進(jìn)行參比)。(d)對(duì)于STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)對(duì)在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中所進(jìn)行的經(jīng)細(xì)胞因子刺激的CD40 mRNA-表達(dá)的影響所做的5個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)之統(tǒng)計(jì)學(xué)分析小結(jié)(*p＜0.05相對(duì)于經(jīng)刺激的對(duì)照細(xì)胞)。(e)對(duì)于STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)對(duì)在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中所進(jìn)行的經(jīng)細(xì)胞因子刺激的CD40蛋白質(zhì)-表達(dá)24小時(shí)之后的影響之代表性Western印跡分析與光密度分析(“強(qiáng)度”表示為經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)進(jìn)行參比)。于其他實(shí)驗(yàn)中也得到可相比較之結(jié)果。
圖2顯示出在經(jīng)培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細(xì)胞中通過(guò)基于反義寡核苷酸的轉(zhuǎn)錄因子STAT-1的表達(dá)的下調(diào)抑制經(jīng)細(xì)胞因子刺激的CD40基因表達(dá)。(a)CD40-蛋白質(zhì)和STAT-1-蛋白質(zhì)分別在靜止條件下以及在將細(xì)胞與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育14小時(shí)之后的表達(dá)。圖中左格顯示出使用不同批次細(xì)胞進(jìn)行的2-4次實(shí)驗(yàn)之統(tǒng)計(jì)學(xué)分析小結(jié)，圖中右格顯示出代表性Western印跡分析與光密度分析(“強(qiáng)度”表示為未經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)進(jìn)行參比)(*p＜0.05相對(duì)于未經(jīng)刺激的對(duì)照細(xì)胞)。(b)在使用STAT-1-反義寡核苷酸(1μM；SEQ ID NO33)預(yù)處理24小時(shí)的經(jīng)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞中，CD40-蛋白質(zhì)和STAT-1-蛋白質(zhì)的表達(dá)之可相比較的抑制。2次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的小結(jié)(圖中左格；*p＜0.05相對(duì)于經(jīng)刺激的對(duì)照細(xì)胞)與代表性Western印跡分析(圖中右格)。
圖3顯示出轉(zhuǎn)錄因子IRF-1在單核細(xì)胞系THP-1中的表達(dá)(a)以及NO-合成酶的誘導(dǎo)型異構(gòu)體(inducible isoform)在經(jīng)培養(yǎng)的人類平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)利用相應(yīng)的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)中和轉(zhuǎn)錄因子STAT-1之抑制作用。(a)代表性Western印跡分析與光密度分析(“強(qiáng)度”表示為經(jīng)刺激的對(duì)照樣品之％且相對(duì)于內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)樣品β-肌動(dòng)蛋白。經(jīng)培養(yǎng)的THP-1-細(xì)胞系與順式作用元件誘餌(10μM)預(yù)孵育4小時(shí)且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育3小時(shí)。(b)圖中左格使用與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)、NF-κB順式作用元件誘餌或GATA-2順式作用元件誘餌(10μM)預(yù)孵育4小時(shí)且隨后與1000U/毫升干擾素-γ，60U/毫升白介素-1β，100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1微克/毫升細(xì)菌脂多糖孵育9小時(shí)的不同批次經(jīng)培養(yǎng)的人類平滑肌細(xì)胞所進(jìn)行的3個(gè)實(shí)驗(yàn)之統(tǒng)計(jì)學(xué)分析小結(jié)。NO-合成酶的誘導(dǎo)型異構(gòu)體mRNA-表達(dá)之RT-PCR-分析(*p＜0.05相對(duì)于經(jīng)刺激的細(xì)胞＝100％)。圖中右格使用不同批次細(xì)胞進(jìn)行的3個(gè)實(shí)驗(yàn)之統(tǒng)計(jì)學(xué)分析小結(jié)及通過(guò)分別與STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO33)和NF-κB順式作用元件誘餌預(yù)孵育以對(duì)NO-合成酶蛋白質(zhì)的經(jīng)細(xì)胞因子刺激的表達(dá)(暴露20小時(shí)之后)產(chǎn)生抑制之代表性Western印跡分析(*p＜0.05相對(duì)于經(jīng)刺激的細(xì)胞＝100％)。
圖4顯示出使用不同的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、25、29、31、33、35、37、39和突變的對(duì)照寡核苷酸STAT-1-19mut和STAT-1-25mut)對(duì)單核細(xì)胞系THP1的細(xì)胞核提取物中所含內(nèi)源性STAT-1的中和。代表性EMSA分析。經(jīng)培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞系與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育3小時(shí)且隨后即用來(lái)制備細(xì)胞核提取物。將細(xì)胞核提取物分別與[32P]-標(biāo)記的雙鏈SIE-寡核苷酸(Santa Cruz Biotochnologie，Heidelberg，Germany)及相應(yīng)的順式作用元件誘餌和對(duì)照寡核苷酸在室溫下共孵育20分鐘且隨后施以電泳移動(dòng)偏移分析。
圖5顯示出所選出的STAT-1順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、31、35、37)對(duì)于E-選擇蛋白和MCP-1mRNA在得自胸腺靜脈的人類平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)之影響。培養(yǎng)細(xì)胞(第2道)與相應(yīng)的順式作用元件誘餌(10μM)預(yù)孵育4小時(shí)且隨后與100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ孵育9小時(shí)。代表性RT-PCR-分析，于其他實(shí)驗(yàn)中得到可相比較的結(jié)果。
圖6以基因圖譜示意地顯示出STAT-1-反義表達(dá)載體pCI/Stat1 AS的結(jié)構(gòu)。
圖7顯示出使用不同的順式作用元件誘餌(SEQ ID NO17、19、27、33和39)對(duì)于經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中所含STAT-1進(jìn)行中和的結(jié)果。代表性EMSA-分析，與光密度分析(“強(qiáng)度”)。經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞系與誘餌寡核苷酸(10微摩爾/升)孵育4小時(shí)且隨后用100U/毫升腫瘤壞死因子-α和1000U/毫升干擾素-γ刺激30分鐘。對(duì)于EMSA-分析，使用經(jīng)刺激的細(xì)胞的細(xì)胞核提取物和[32P]-標(biāo)記的雙鏈SIE-寡核苷酸(Santa CruzBiotochnologie，Heidelberg，Germany)。
圖8顯示出STAT-1順式作用元件誘餌(STAT-1cons，10nmol，SEQ ID NO19)而非突變的對(duì)照寡核苷酸(STAT-1mut，10nmol，SEQ IDNO61)對(duì)于在雄豚鼠體內(nèi)經(jīng)DNCB-誘導(dǎo)的接觸性皮膚炎的影響的組織學(xué)分析(原始x400，總共17只受檢豚鼠的典型結(jié)果)。
本發(fā)明人已經(jīng)鑒定出參與在人類內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中以及在單核細(xì)胞中細(xì)胞因子介導(dǎo)的促炎性基因產(chǎn)物(CD40、E-選擇蛋白、NO-合成酶的誘導(dǎo)型異構(gòu)體、白介素-12[p40]、MCP-1)表達(dá)的增加中的轉(zhuǎn)錄因子。由此可以證明，在經(jīng)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中使用TNFα和CD154分別與IFNγ組合進(jìn)行刺激的情況中，于轉(zhuǎn)錄因子核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)與轉(zhuǎn)錄信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與活化子-1(signal transducer and activator oftranscription-1，STAT-1)之間存在著協(xié)同作用(synergism)。相同的情形也分別發(fā)生于經(jīng)培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞。
IFNγ單獨(dú)地能夠增加CD40在人類內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，而E-選擇蛋白或白介素-12則不能。對(duì)于很難且非組成型地在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分別表達(dá)的此兩種基因產(chǎn)物之表達(dá)，有必要分別與TNFα(E-選擇蛋白)和CD154(白介素-12)同時(shí)刺激細(xì)胞。再者，另一轉(zhuǎn)錄因子，干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)的重新(de novo)表達(dá)為IFNγ-介導(dǎo)的CD40而不是E-選擇蛋白在內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)之增加所必需。于這些分析的范圍之內(nèi)，可以證明IRF-1-蛋白質(zhì)表達(dá)在使用IFNγ且特別是使用TNFα單獨(dú)刺激細(xì)胞的情況中比在兩種細(xì)胞因子都存在的情況中顯著地較為弱。根據(jù)此點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和STAT-1在IRF-1基因的轉(zhuǎn)錄情況中也會(huì)協(xié)同地作用(Ohmore等，J.Biol.Chem.，(1977)，272，14899)。
STAT-1(分別為GenBank Accession Number NM007315和XM010893及http://transfac.gbf.de/cgi-bin/qt/getEntry.pl？t0149)系屬于一組包括至少6種成員的轉(zhuǎn)錄因子。STAT-1基因產(chǎn)物系由大部分細(xì)胞所組成型地表達(dá)，不過(guò)通常系以非活性單體型蛋白質(zhì)之形式(91kDa)存在于細(xì)胞質(zhì)之內(nèi)。此種p91-亞單位(subunit)的酪氨酸-磷酸化與后續(xù)的兩個(gè)這種p91-亞單位(稱為STAT-1α)的結(jié)合(二聚體化)可促成從此時(shí)起成為活性的轉(zhuǎn)錄因子運(yùn)載到細(xì)胞核之內(nèi)。也可以進(jìn)行與STAT-1β所含p84-亞單位(相同基因的不同剪切產(chǎn)物)的異二聚體化(hetero-dimerisation)。以組成方式存在的亞單位之磷酸化是通過(guò)細(xì)胞質(zhì)janus激酶(janus-kinases)依賴刺激而發(fā)生的。所以，兩種janus激酶(Jak1和Jak2)都會(huì)受IFNα所刺激(更好地回復(fù)到干擾素受體)；與此相反，就(病理)生理學(xué)而言，作為STAT-1活化的最重要的刺激，IFNγ，則只刺激Jak2。不同的生長(zhǎng)因子和肽類激素(例如血管緊張素II)也會(huì)活化STAT-1；除了固有的(生長(zhǎng)因子)受體酪氨酸激酶之外，還有一種有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAP-激酶)也對(duì)此具有作用。與STAT-1α不同， STAT-1β不具有反式激活活性(transactivating activity)，亦即基因表達(dá)刺激活性。
STAT-1參與在白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中的一系列潛在促炎性基因產(chǎn)物的表達(dá)之中，其中轉(zhuǎn)錄因子的活化經(jīng)常以IFNγ-依賴性方式發(fā)生。一項(xiàng)例外為，白介素-6在血管緊張素II-刺激血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的STAT-1-依賴性表達(dá)(Schieffer等，Circ.Res.(2000)，87，1195)。蛋白質(zhì)，也包括STAT-1，可經(jīng)使用非常不同的方式來(lái)抑制其活性。如此，可以使用，例如，抗STAT-1抗體以及天然或合成的物質(zhì)來(lái)減低STAT-1與DNA的相互作用，亦即，降低轉(zhuǎn)錄活性。再者，也可以抑制導(dǎo)致STAT-1活化的信號(hào)途徑(Jak1、Jak2、受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine-kinases)、MAP-激酶)。要將STAT-1的活性特異性地抑制所用的優(yōu)選的方法為1.使用誘餌寡核苷酸中和(抑制(squelching))活化的轉(zhuǎn)錄因子，2.利用反義寡核苷酸抑制STAT-1-蛋白質(zhì)表達(dá)，與3.利用反義表達(dá)載體抑制STAT-1-蛋白質(zhì)表達(dá)。
本文中所使用的術(shù)語(yǔ)“誘餌寡核苷酸”或“順式作用元件誘餌”分別指稱雙鏈DNA分子和雙鏈DNA寡核苷酸。兩條DNA鏈均具有一互補(bǔ)序列。于本發(fā)明中，順式作用元件誘餌具有的序列與基因組內(nèi)的天然STAT-1核心結(jié)合序列一致或類似，且其可被細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)錄因子STAT-1所結(jié)合。如此，順式作用元件誘餌可作為STAT-1競(jìng)爭(zhēng)抑制(優(yōu)選的為中和作用)中所用的分子。
本發(fā)明的一方面提供了能夠以序列特異性方式結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子STAT-1的雙鏈DNA寡核核苷酸，該雙鏈DNA寡核核苷酸具有下列序列之一，雖然此處只示出每一種此類雙鏈DNA寡核核苷酸所含的一條鏈，不過(guò)其互補(bǔ)鏈也包括在本發(fā)明之內(nèi)5′-NTTNCBGDAAN-3′(SEQ ID NO1)，5′-ATTACCGGAAG-3′(SEQ ID NO3)，5′-ATTCCGGTAAG-3′(SEQ ID NO5)，5′-ATTCCTGGAAG-3′(SEQ ID NO7)，5′-ATTCCTGTAAG-3′(SEQ ID NO9)，5′-GTTCCAGGAAC-3′(SEQ ID NO11)，5′-GTTCCCGGAAG-3′(SEQ ID NO13)，5′-GTTCCGGGAAC-3′(SEQ ID NO15)，5′-TGTGAATTACCGGAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO17)，5′-TGTGAATTACCGGAAGTG-3′(SEQ ID NO19)，5′-AGTCAGTTCCAGGAACTGACT-3′(SEQ ID NO21)，
5′-ATGTGAGTTCCCGGAAGTGAACT-3′(SEQ ID NO23)，5′-ACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO25)，5′-GACAGTTCCGGGAACTGTC-3′(SEQ ID NO27)，5′-GTGTATTCCGGTAAGTGA-3′(SEQ ID NO29)，5′-TTATGTGAATTCCTGGAAGTG-3′(SEQ ID NO31)，5′-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO33)，5′-TGTGAATTCCTGTAAGTGAGA-3′(SEQ ID NO35)，5′-TGCATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO37)，5′-ATATTCCTGTAAGTG-3′(SEQ ID NO39)。
若在人類內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)使用根據(jù)本發(fā)明針對(duì)STAT-1的誘餌寡核苷酸而不是個(gè)別對(duì)照寡核苷酸，則細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD40表達(dá)(包括用IFNγ進(jìn)行單一刺激及與IFNγ和TNFα組合刺激兩種情況)會(huì)被顯著地抑制超過(guò)50％。假若細(xì)胞的刺激是用IFNγ與TNFα和CD154分別進(jìn)行，此種情況也分別發(fā)生于E-選擇蛋白及MCP-1和白介素-12(p40)的表達(dá)之中。根據(jù)此點(diǎn)，將STAT-1活性消除掉會(huì)帶來(lái)一組促炎性基因產(chǎn)物在人類內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)之高度明顯的抑制。如此即可在此種治療措施的情況中于炎性疾病范圍之內(nèi)構(gòu)思出使內(nèi)皮-白細(xì)胞相互作用(E-選擇蛋白，MCP-1)的明顯減低，而且也可使抗原呈遞細(xì)胞(例如巨噬細(xì)胞和B-淋巴細(xì)胞)與T-淋巴細(xì)胞(CD40、白介素-12)的相互作用明顯減低。類似地，此種情形也發(fā)生于已經(jīng)證明的在THP-1單核細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子誘發(fā)的IRF-1表達(dá)的減低(且由此將IRF-1依賴性基因的表達(dá)下調(diào))之中，以及細(xì)胞因子誘導(dǎo)的包括誘導(dǎo)型NO-合成酶在內(nèi)的所述基因產(chǎn)物在人類平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)減低之中。
因此，STAT-1活性的特異性抑制所用的一種優(yōu)選的方法為使用根據(jù)本發(fā)明的含有STAT-1的結(jié)合位點(diǎn)的雙鏈DNA寡核核苷酸，也稱為順式作用元件誘餌或誘餌寡核苷酸。從外部給細(xì)胞提供大量的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，特別是遠(yuǎn)大于基因組內(nèi)所含數(shù)目的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生一種狀況，其中有大部分的某一種轉(zhuǎn)錄因子會(huì)特異地結(jié)合到相應(yīng)的順式作用元件誘餌而不會(huì)結(jié)合到其內(nèi)源性靶結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源性結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合予以抑制所用的這些方法也稱為抑制(squelching)。使用順式作用元件誘餌對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的抑制(也叫做中和)可以成功地用來(lái)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。于此使用了含有對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)之DNA片段(Morishita等，PNAS(1995)92，5855)。
防止轉(zhuǎn)錄因子STAT-1結(jié)合所用的核酸序列為例如在細(xì)胞內(nèi)部可與STAT-1自然結(jié)合之序列。STAT-1可特異地結(jié)合到具有下述序列的基序(motive)5’NNNSANTTCCGGGAANTGNSN-3’，其中的符號(hào)為N＝A、T、C或G且S＝C或G。具有下劃線的堿基的嚴(yán)格共有序列(consensus)以及這些堿基間的距離對(duì)于STAT-1的有效結(jié)合都是極為重要的。所以，根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌可能具有下述11體(11-mer)共有核心結(jié)合序列5’-NTTNCBGDAAN-3’(SEQ ID NO1)，其中的符號(hào)為B＝C、G或T，D＝A、G或T且N＝A、T、C或G。再者，該順式作用元件誘餌可以大于該11體核心結(jié)合序列，且可在5’-端及/或3’-端延長(zhǎng)。在該核心結(jié)合序列區(qū)內(nèi)的相應(yīng)突變會(huì)導(dǎo)致STAT-1對(duì)誘餌寡核苷酸之結(jié)合的妨害。
由于該順式作用元件誘餌為一種雙鏈核酸，因此根據(jù)本發(fā)明的DNA寡核核苷酸不僅包括有義或正向序列，而且也包括互補(bǔ)的反義或反向序列。本發(fā)明的優(yōu)選的DNA寡核苷酸具有如涵蓋在SEQ ID NO3至SEQ ID NO16之內(nèi)的STAT-1的11體核心結(jié)合序列。
不過(guò)該順式作用元件誘餌也可以具有不同于前述序列且比11體更長(zhǎng)的序列。特別優(yōu)選的為諸如涵蓋在SEQ ID NO17至SEQ ID NO40之內(nèi)的序列。這些順式作用元件誘餌含有2個(gè)分別針對(duì)STAT-1的結(jié)合位點(diǎn)。
“2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)”于此涉及有義鏈和反義鏈。此優(yōu)選的序列名單不具限制性。對(duì)于本領(lǐng)域人員是顯而易知的，有眾多序列可以用為STAT-1的抑制劑，只要其具有先前提及的11體共有核心結(jié)合序列與對(duì)STAT-1的親和力之條件即可。
核酸序列對(duì)STAT-1的結(jié)合親和力可通過(guò)使用電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)予以評(píng)定(Sambrook等(1989)，Molecular Cloning.Cold SpringHarbor Laboratory Press；Krezesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)。此種檢驗(yàn)系統(tǒng)適合用于預(yù)期用在本發(fā)明方法中的核酸的質(zhì)量控制，或用來(lái)測(cè)定結(jié)合位點(diǎn)的最佳長(zhǎng)度。其亦適合用來(lái)鑒定會(huì)被STAT-1結(jié)合之其他序列。對(duì)于EMSA，打算用來(lái)分離新的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，最適當(dāng)者為經(jīng)純化或經(jīng)重組表達(dá)的STAT-1形式，其可以用于數(shù)個(gè)更迭回合的PCR-擴(kuò)增(PCR-amplification)并以EMSA進(jìn)行選擇(Thiesen and Bach(1990)，Nucleic Acids Res.18，3203)。
已知在啟動(dòng)子(promoter)區(qū)或增強(qiáng)子(enhancer)區(qū)含有STAT-1結(jié)合位點(diǎn)之基因中，或STAT-1對(duì)其表達(dá)具重要性的功能跡象且因而成為以本發(fā)明方法予以特異性抑制的可能的靶基因中，除了CD40-基因、E-選擇蛋白基因、可誘導(dǎo)型NO-合成酶基因、白介素-12(p40)-基因、和MCP-1-基因之外，還有其他促炎性基因，例如IFNγ本身，細(xì)胞因子白介素-6，粘附分子ICAM-1，PECAM-1(血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1))，RANTES(活化調(diào)節(jié)，正常T-細(xì)胞表達(dá)，可能分泌(regulated upon activation，normal T-cellexpressed，presumed scrected)；由T-淋巴細(xì)胞可溶性分泌)和VCAM-1，趨化因子白介素-8、IP-10(干擾素-誘導(dǎo)型蛋白質(zhì)-10)與Mig(γ-干擾素誘導(dǎo)出的單核因子(monokine))以及MHC-蛋白質(zhì)I和II。于此，不論這些基因的表達(dá)是否由STAT-1直接地或間接地調(diào)節(jié)都沒(méi)有關(guān)系(例如通過(guò)IRF-1的STAT-1-依賴性表達(dá))。
本發(fā)明方法可調(diào)控一基因或多基因的轉(zhuǎn)錄，其方式為使得該基因或該多基因，例如E-選擇蛋白，不表達(dá)或較低地表達(dá)。在本發(fā)明范圍之內(nèi)，經(jīng)減低或經(jīng)抑制的表達(dá)意指相對(duì)于沒(méi)有使用根據(jù)本發(fā)明的雙鏈DNA寡核核苷酸處理過(guò)的細(xì)胞比較之下轉(zhuǎn)錄速率較為減低。此種減低可以使用，例如Northern-blot印跡分析(Sambrook等，1989)或RT-PCR(Sambrook等，1989)予以測(cè)定。通常這些減低至少為2倍，特別者至少為5倍，更特別者至少10倍的減低。活化的喪失可能通過(guò)例如若STAT-1以轉(zhuǎn)錄激活子形式作用于某一基因且因此激活子的抑制導(dǎo)致該靶基因的表達(dá)的缺失而達(dá)到。
此外，本發(fā)明方法有助于基因表達(dá)的抑制之解除，條件是將該表達(dá)的阻斷的原因是通過(guò)一具有組成型活性或(在重復(fù)細(xì)胞刺激之后)用一活化的轉(zhuǎn)錄因子。對(duì)此的一個(gè)例子為，前內(nèi)皮素原-1基因(prepro-endothelin-1-gene)在兔頸靜脈(V.jugularis)天然內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)之抑制，可以通過(guò)以針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合性蛋白質(zhì)的順式作用元件誘餌予以解除(Lauth等，J.Mol.Med.(2000)，78，441)。對(duì)此，意指基因表達(dá)的抑制可經(jīng)解除使其產(chǎn)物發(fā)揮出保護(hù)性效用，例如對(duì)抗炎性疾病。如此，例如NO-合成酶的內(nèi)皮細(xì)胞的異構(gòu)體，其產(chǎn)物NO對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的促炎性粘附分子和細(xì)胞因子的表達(dá)之抑制起著關(guān)鍵性作用，可用IFNγ予以下調(diào)(Rosenkranz-Weiss等(1994)，J.Clin.Invest.93，1875)。對(duì)抗STAT-1的順式作用元件誘餌可通過(guò)抑制STAT-1對(duì)內(nèi)皮NO-合成酶基因所含啟動(dòng)子中的相應(yīng)結(jié)合位點(diǎn)之結(jié)合而逆轉(zhuǎn)此非合意的效應(yīng)。
寡核苷酸通常會(huì)被核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶所快速降解，尤其是被DNase和RNase在細(xì)胞內(nèi)所降解。所以，DNA寡核核苷酸可經(jīng)修飾以穩(wěn)定化而對(duì)抗降解，由此在細(xì)胞內(nèi)可以長(zhǎng)時(shí)期地維持住一高濃度的寡核苷酸。通常此種穩(wěn)定化可通過(guò)導(dǎo)入一或多種經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵而得到。
經(jīng)成功地穩(wěn)定化的DNA寡核核苷酸不一定在每一核苷酸間連鍵都含有一修飾。優(yōu)選的是將在順式作用元件誘餌的兩寡核苷酸之相應(yīng)末端的核苷酸間連鍵予以修飾。其中可以將最后的六、五、四、三、二個(gè)或最后一個(gè)或在最后六個(gè)核苷酸間連鍵中的一或多個(gè)核苷酸間連鍵予以修飾。另外，在核酸中可以插入經(jīng)不同修飾的核苷酸間連鍵且由此產(chǎn)生的雙鏈DNA寡核核苷酸可通過(guò)使用常規(guī)EMSA-檢驗(yàn)系統(tǒng)分析與STAT-1的序列特異性結(jié)合。此檢驗(yàn)系統(tǒng)可以用來(lái)測(cè)定順式作用元件誘餌的結(jié)合常數(shù)及因而測(cè)定其親和力是否因該修飾而改變?？梢赃x擇仍然顯示出充足的結(jié)合作用之經(jīng)修飾順式作用元件誘餌，其中充分的結(jié)合意指為未修飾核酸的結(jié)合之至少約50％或至少約75％，且特別優(yōu)選的為約100％。
仍然顯示出充足的結(jié)合作用之具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵的順式作用元件誘餌可以測(cè)試其在細(xì)胞內(nèi)是否比未修飾順式作用元件誘餌較為穩(wěn)定。對(duì)使用根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌“轉(zhuǎn)染”的細(xì)胞測(cè)試在不同的時(shí)間點(diǎn)仍然可利用的順式作用元件誘餌的量。其中，優(yōu)選的為使用經(jīng)熒光染料(例如得克薩斯紅(Texas-red))標(biāo)記的順式作用元件誘餌或經(jīng)放射性(例如32P)標(biāo)記的順式作用元件誘餌，隨后分別施以數(shù)字熒光顯微術(shù)和放射自顯術(shù)或閃爍掃描法(scintigraphy)。經(jīng)成功修飾的順式作用元件誘餌在細(xì)胞內(nèi)具有比未經(jīng)修飾的順式作用元件誘餌更為長(zhǎng)的半壽期，優(yōu)選的至少約48小時(shí)，更優(yōu)選的至少約4天，且最優(yōu)選的至少約7天。
適當(dāng)?shù)男揎椇塑账衢g連鍵經(jīng)摘列于Uhlmann和Peyman((1990)Chem.Rev.90，544)之中。可以用于本發(fā)明的方法之中的在核酸內(nèi)的經(jīng)修飾的核苷酸間磷酸殘基及/或非磷橋聯(lián)(non phosphorus-bridge)包括例如甲基膦酸酯(methylphosphonate)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸酯，而非磷核苷酸間類似物包括例如硅氧烷橋聯(lián)、碳酸酯橋聯(lián)、羧甲基酯橋聯(lián)(carboxymethylester-bridges)、乙酰胺酸酯橋聯(lián)(acetamidate-bridges)、及/或硫醚橋聯(lián)。在使用經(jīng)硫代磷酸酯修飾的核苷酸間連鍵的情況中，其優(yōu)選的不要位于胞嘧啶堿基與鳥(niǎo)嘌呤堿基間，因?yàn)槿羰侨绱?，其可能?dǎo)致順式作用元件誘餌的靶細(xì)胞的活化。
本發(fā)明另一具體實(shí)施方式
為通過(guò)在核酸中插入結(jié)構(gòu)特定性所得核酸之穩(wěn)定化，此舉可以增長(zhǎng)該核酸的半壽期。含有發(fā)夾型和鐘型DNA的這些結(jié)構(gòu)經(jīng)揭示于US5,683,985之中。同時(shí)，可以將經(jīng)修飾的核苷酸間-磷酸-殘基及/或非磷-橋聯(lián)與所述的結(jié)構(gòu)一起導(dǎo)入。接著可以對(duì)如是所得的核酸在上文所述檢驗(yàn)系統(tǒng)中測(cè)試結(jié)合作用與穩(wěn)定性。
核心結(jié)合序列不僅可以存在于順式作用元件誘餌之中而且可以存在于載體(vector)之中。在一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方式
之中，該載體為一質(zhì)粒載體(plasmid vector)且特別是一種能夠自體復(fù)制以增加所導(dǎo)入的雙鏈核酸所具穩(wěn)定性之質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的順式作用元件誘餌可以迅速地被攝取到細(xì)胞之內(nèi)。足夠的攝取之特征在于一或多種會(huì)受STAT-1所控制的基因的表達(dá)之調(diào)控現(xiàn)象。本發(fā)明的順式作用元件誘餌優(yōu)選的為在與細(xì)胞接觸約4小時(shí)之后，更佳者在約2小時(shí)之后，在約1小時(shí)之后，約30分鐘之后且最佳者在約10分鐘之后調(diào)控一基因或多基因的轉(zhuǎn)錄。在這些實(shí)驗(yàn)中使用的典型混合物含有10微摩爾/升的該順式作用元件誘餌。
另外，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌在藥物制造中的用途。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌在一藥物的制造中之用途，該藥物用以預(yù)防或治療心血管并發(fā)癥(例如，在經(jīng)皮血管成形術(shù)之后的再狹窄，靜脈搭橋術(shù)的狹窄)，移植物排異，移植物抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關(guān)性損傷，免疫過(guò)敏性反應(yīng)(I型至第V型)，自身免疫性疾病(例如，糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)以及所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關(guān)節(jié)處者(例如，關(guān)節(jié)炎)，累及呼吸器官者(例如，支氣管哮喘(bronchial asthma)、慢性支氣管炎)，累及皮膚者(例如，牛皮癬(psoriasis)、神經(jīng)性皮炎(neurodermitis))以及累及胃腸道者(例如，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’sdisease))，包括感染性休克(septic shock)。
此外，本發(fā)明也涉及一種在細(xì)胞內(nèi)，特別是在內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、白細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞或纖維母細(xì)胞之內(nèi)調(diào)控至少一種基因的轉(zhuǎn)錄的方法，包括下述步驟將所述的細(xì)胞與一混合物接觸，該混合物含有一或多種能夠以序列特異性方式結(jié)合到轉(zhuǎn)錄因子STAT-1的一或多種根據(jù)本發(fā)明的雙鏈核酸。一優(yōu)選的方法為，例如，對(duì)含有T-淋巴細(xì)胞的骨髓捐贈(zèng)者在將其導(dǎo)入受者身體內(nèi)之前給予離體處理(ex vivotreatment)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌也可以置于一組合物中給患者施用或用于根據(jù)本發(fā)明的方法之中。含有根據(jù)本發(fā)明的順式作用元件誘餌之組合物(于后文中稱為混合物)即可與靶細(xì)胞(例如，內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、白細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞或纖維母細(xì)胞)接觸。此接觸的目的為將結(jié)合STAT-1的順式作用元件誘餌轉(zhuǎn)移到該靶細(xì)胞(亦即，以STAT-1依賴性方式表達(dá)出促炎性基因產(chǎn)物之細(xì)胞)之內(nèi)。所以，已知可以改善膜的穿透之核酸修飾及/或添加劑或輔助物質(zhì)都可以用于本發(fā)明的范圍之內(nèi)(Uhlmann and Peyman(1990)，Chem.Rev.90，544)。
于一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，根據(jù)本發(fā)明的混合物只含有核酸和緩沖液。適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷T餌之濃度在至少0.1至100μM的范圍之內(nèi)，優(yōu)選的者10μM，于其中加入一或多種適當(dāng)?shù)木彌_液。這些緩沖液的一個(gè)例子為林格溶液(Ringer’s solution)，其中含有145毫摩爾/升的Na+、5毫摩爾/升的K+、156毫摩爾/升的Cl-、2毫摩爾/升的Ca2+、1毫摩爾/升的Mg2+、10毫摩爾/升的HEPES、10毫摩爾/升的D-葡萄糖、pH 7.4。
于本發(fā)明另一具體實(shí)施方式
中，該混合物另外含有至少一種添加劑及/或輔助物質(zhì)。諸如脂質(zhì)、陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)體、納米粒子、核酸-適合體(nucleic acid-aptameres)、結(jié)合了DNA的肽和蛋白質(zhì)等或合成的肽-DNA-分子等之添加劑及/或輔助物質(zhì)都為預(yù)期使用者，以期(i)增加，例如，核酸導(dǎo)入到細(xì)胞之內(nèi)，以期(ii)僅將混合物導(dǎo)向一細(xì)胞亞群，以期(iii)在細(xì)胞內(nèi)抑制核酸的降解，以期(iv)在其使用之前幫助核酸混合物的貯存。肽類和蛋白質(zhì)或合成的肽-DNA-分子的例子有例如抗體、抗體片段、配體、粘附分子等，其全部都可經(jīng)修飾或可以不經(jīng)修飾。
可以將順式作用元件誘餌穩(wěn)定化在細(xì)胞內(nèi)部的添加劑為例如核酸-濃縮物質(zhì)(nucleic acid-condensing substance)諸如陽(yáng)離子聚合物、聚-L-賴氨酸或聚乙亞胺。
本發(fā)明方法中所使用的混合物優(yōu)選的是通過(guò)注射、插管、栓劑、氣霧劑(分別經(jīng)鼻和經(jīng)口噴入，吸入)、套管針、投射(projectile)、Pluronic凝膠、可將藥物持續(xù)釋放的聚合物、或有助于局部進(jìn)入的任何其他裝置等進(jìn)行局部施用。將本發(fā)明方法中所使用的混合物進(jìn)行離體使用(ex vivouse)也可以促成局部進(jìn)入。
不過(guò)，STAT-1活性的抑制可以不僅是在前述方法中于蛋白質(zhì)層次上予以抑制，而且可以在轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯之前或之中就予以完成。該抑制可以用所謂的反義寡核苷酸予以實(shí)施。反義寡核苷酸可以在三個(gè)不同的層次上抑制靶基因的合成，亦即，在轉(zhuǎn)錄之過(guò)程中(防止hnRNA-合成)，于hnRNA的處理(剪切)導(dǎo)致mRNA之過(guò)程中及在在核糖體上面mRNA轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)之過(guò)程中。利用反義寡核苷酸來(lái)抑制基因表達(dá)所用的方法系一種現(xiàn)有技術(shù)且為本領(lǐng)域人員所熟知。本發(fā)明另一方面為可特異地抑制STAT-1表達(dá)且具有下列序列中之一的反義寡核苷酸5′-TACCACTGAGACATCCTGCCAC-3′(SEQ ID NO41)，5′-AACATCATTGGCACGCAG-3′(SEQ ID NO42)，5′-GTGAACCTGCTCCAG-3′(SEQ ID NO43)。
該反義寡核苷酸可為單鏈DNA分子，RNA分子或?yàn)閱捂淒NA-RNA雜合分子。該反義寡核苷酸更可具有一或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵，例如前面對(duì)順式作用元件誘餌所述及者。在通過(guò)硫代磷酸-修飾核苷酸間連鍵予以穩(wěn)定化的反義寡核苷酸的情況中，特別要考慮到在胞嘧啶堿基與鳥(niǎo)嘌呤堿基間不要插入硫代磷酸-修飾核苷酸間連鍵，因?yàn)槿绱丝赡軐?dǎo)致——特別是——具有免疫活性的細(xì)胞(例如內(nèi)皮細(xì)胞)的類似被IFNγ活化且因而會(huì)，至少部分地，阻礙產(chǎn)生合意的治療效果。
該反義寡核苷酸不僅可以用單鏈核酸分子之形式施用，而且可以用包含在一載體內(nèi)的形式施用。在一優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，該載體為一質(zhì)粒載體且特別是一種能夠自體復(fù)制由此可增加所導(dǎo)入的單鏈核酸所具穩(wěn)定性的質(zhì)粒載體。
本發(fā)明的另一方面因而為一種反義寡核苷酸載體，于轉(zhuǎn)染之后其本身要在靶細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)且會(huì)特異地抑制STAT-1的表達(dá)。于此，可以考慮根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)可得到的任何真核生物表達(dá)載體。優(yōu)選的考慮Promega公司的pCI-質(zhì)粒(目錄編號(hào)No.E1731，GenBank Accession NumberU47119)，其中將包括STAT-1基因節(jié)段(segment)的2350bp(-121至+2229，GenBank Accession Number XM010893)以相反方向(3’→5’)克隆。此STAT-1基因節(jié)段的側(cè)翼接著兩個(gè)EcoRI限制位點(diǎn)且含有一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)。其表達(dá)受到CMV-啟動(dòng)子的控制。整個(gè)質(zhì)粒(稱為pCI/Stat1 AS)包括6365bp。
以反義寡核苷酸為基礎(chǔ)的STAT-1蛋白質(zhì)表達(dá)之調(diào)控也可以在人類內(nèi)皮細(xì)胞中抑制經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CD40-表達(dá)，達(dá)到與用誘餌寡核苷酸者相同的程度。
此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的反義寡核苷酸在藥物制造中的用途。進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸在一種藥物的制造中的用途，該藥物用以預(yù)防或治療心血管并發(fā)癥(例如，在經(jīng)皮血管成形術(shù)之后的再狹窄，靜脈搭橋術(shù)的狹窄)，移植物排異，移植物抗宿主病(graft versus host disease)(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關(guān)性損傷，免疫過(guò)敏性反應(yīng)(第I至V型)，自身免疫性疾病(例如，糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)以及所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關(guān)節(jié)處者(例如，關(guān)節(jié)炎)，累及呼吸器官者(例如，支氣管哮喘(bronchial asthma)、慢性支氣管炎)，累及皮膚者(例如，牛皮癬(psoriasis)、神經(jīng)性皮炎(neurodermitis))以及累及胃腸道者(例如，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)、克隆氏病(Chron’s disease))，包括感染性休克(septic shock)。
另外，根據(jù)本發(fā)明的反義寡核苷酸也可以置于一組合物中給患者施用。該組合物可包括穩(wěn)定化性添加劑或輔助物質(zhì)以幫助，例如，將該反義寡核苷酸導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)，將組合物僅導(dǎo)向到一細(xì)胞亞群，防止例如該反義寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)部的降解，或幫助例如在使用之前該反義寡核苷酸的貯存。
下面的圖式和實(shí)施例僅用來(lái)示范說(shuō)明用而不是要用來(lái)以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1.細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)用1.6U/毫升的溶于HEPES-修飾Tyrode溶液的分散酶(dispase)在37℃下處理30分鐘而從臍帶靜脈分離出人類內(nèi)皮細(xì)胞，且置于經(jīng)明膠包被(2毫克/毫升明膠/0.1N HCl，在室溫下30分鐘)的6-孔組織培養(yǎng)皿上，于1.5毫升M199培養(yǎng)基(Gibco Life Technologies，Karlsruhe，Germany)中培養(yǎng)，其中含有20％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，10U/毫升制霉菌素(nystatin)，5mM HEPES和5mMTES，1微克/毫升肝素和40微克/毫升內(nèi)皮生長(zhǎng)因子。這些細(xì)胞以其典型的鋪路石型態(tài)，對(duì)yon Willebrandt-因子(vWF)的陽(yáng)性免疫染色及用熒光計(jì)檢測(cè)(FACS)PECAM-1(CD31)，以及對(duì)平滑肌α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)的陰性免疫染色予以鑒定(Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)。人類單核細(xì)胞系THP-1(ATCC TIB 202)以RPMI 1640培養(yǎng)基(LifeTechnologies)培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，和10U/毫升制霉菌素。人類平滑肌細(xì)胞從切下的胸腺靜脈利用外植體技術(shù)(the explant-technology)分離(Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191)，且置于經(jīng)明膠包被(參閱上文)的6-孔組織培養(yǎng)皿上，于1.5毫升Dulbecco’s改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其中含有15％胎牛血清，50U/毫升青霉素，50微克/毫升鏈霉素，和10U/毫升制霉菌素。該細(xì)胞以對(duì)平滑肌α-肌動(dòng)蛋白的陽(yáng)性免疫染色予以鑒定。
2.RT-PCR分析內(nèi)皮細(xì)胞總RNA使用Qiagen RNeasy試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)分離，且接著進(jìn)行DNA合成，其中根據(jù)制造商的實(shí)驗(yàn)程序使用最大量3微克RNA和200U SuperscriptTMII逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase)(Life Technologies)，總體積為20微升。為了調(diào)整cDNA裝載率，于50微升總體積中使用5微升(約75毫微克cDNA)所得的cDNA溶液和延長(zhǎng)因子-1(the elongation factor 1)(EF-1)的引物對(duì)(primerpair)(Gibco)，及1U Taq DNA聚合酶(Gibco)進(jìn)行PCR。EF-1作為PCR的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)。在含有0.1％溴乙錠(ethidium bromide)的1.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物并使用一CCD攝影系統(tǒng)與Scanalytics的One-Dscan凝膠分析軟件(Billerica，MA，USA)，通過(guò)光密度法測(cè)定條帶的強(qiáng)度以調(diào)整隨后的PCR分析中的cDNA的體積。
所有PCR反應(yīng)都是在Hybaid OmnE Thermocycler(AWG；Heidelberg，Germany)中針對(duì)每一引物對(duì)分別地實(shí)施。針對(duì)得自臍帶靜脈的人類內(nèi)皮細(xì)胞的cDNA，所用的特殊的PCR條件為CD40(產(chǎn)物大小381bp，25循環(huán)，退火溫度(annealing temperature)60℃，(正向引物)5’-CAGAGTTCACTGAAACGGAATGCC-3’(SEQ ID NO44)，(反向引物)5’-TGCCTGCCTGTTGCACAACC-3’(SEQ ID NO45))；E-選擇蛋白(產(chǎn)物大小304bp，33循環(huán)，退火溫度60℃，(正向引物)5’-AGCAAGGCATGATGTTAACC-3’(SEQ ID NO46)，(反向引物)5’-GCATTCCTCTCTTCCAGAGC-3’(SEQ ID NO47))；EF-1(產(chǎn)物大小220bp，22循環(huán)，退火溫度55℃，(正向引物)5’-TCTTAATCAGTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO48)，(反向引物)5’-TTTGGTCAAGTTGTTTCC-3’(SEQ ID NO49))；IL-12p40(產(chǎn)物大小281bp，30循環(huán)，退火溫度62℃，(正向引物)5’-GTACTCCACATTCCTACTTCTC-3’(SEQ ID NO50)，(反向引物)5’-TTTGGGTCTATTCCGTTGTGTC-3’(SEQ ID NO51))；rpl32(產(chǎn)物大小368bp，20循環(huán)，退火溫度60℃，(正向引物)5’-GTTCATCCGGCACCAGTCAG-3’(SEQ ID NO52)，(反向引物)5’-ACGTGCACATGAGCTGCCTAC-3’(SEQ ID NO53)；MCP-1(產(chǎn)物大小330bp，22循環(huán)，退火溫度63℃，(正向引物)5’-GCGGATCCCCTCCAGCATGAAAGTCTCT-3’(SEQ ID NO54)，(反向引物)5’-ACGAATTCTTCTTGGGTTGTGGAGTGAG-3’(SEQ IDNO55)。
3.電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)按照Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191中所述，進(jìn)行細(xì)胞核提取物，并進(jìn)行[32P]-標(biāo)記的雙鏈共有寡核苷酸(Santa Cruz Biotechnologie，Heidelberg，Germany)的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯術(shù)和超級(jí)遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(supershift-analysis)。于此使用具有以下所示單鏈序列(核心結(jié)合序列以下劃線標(biāo)出)的雙鏈DNA寡核核苷酸SIE，5’-GTGCATTTCCCGTAAATCTTGTC-3‘(SEQ ID NO56)。為分析使用各種順式作用元件誘餌對(duì)經(jīng)細(xì)胞因子刺激的THP-1細(xì)胞(前單核細(xì)胞人類細(xì)胞系(pre-monocytous human cell line)的細(xì)胞核提取物中所含內(nèi)源性STAT-1之?dāng)D出作用(extrusion)，在EMSA結(jié)合方法中選用30∶1(STAT-1順式作用元件誘餌[32P]-標(biāo)記的SIE的寡聚核苷酸(11fmol))的比例。
4.誘餌寡核苷酸技術(shù)按照Krzesz等(1999)，F(xiàn)EBS Lett.453，191中所述，使用互補(bǔ)的單鏈硫代磷酸連接的寡核苷酸(Eurogentec，Kln，Germany)產(chǎn)生雙鏈誘餌寡核苷酸。將培養(yǎng)的人類內(nèi)皮細(xì)胞與濃度為10μM的相應(yīng)的誘餌寡核苷酸預(yù)孵育4小時(shí)。此為事先根據(jù)EMSA和RT-PCR分析予以最優(yōu)化的條件。于此之后，通常將含有誘餌寡核苷酸的培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基予以更換。該寡核苷酸的單鏈序列如下(下劃線的字母代表經(jīng)硫代磷酸連接的堿基，序列都是按5’→3’之方向顯示)GATA-2，CACTTGATAACAGAAAGTGATAACTCT(SEQ ID NO57)；NF-κB，AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC(SEQ ID NO58)；STAT-1，CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG(SEQ ID NO33)；STAT-1-19mut，GACAGTGCAGTGAACTGTC(SEQ ID NO59)；STAT-1-25mut，CATGTTATGCAGACCGTAGTAAGTG(SEQ IDNO60)。
5.反義寡核苷酸(ODN)技術(shù)對(duì)于反義方法，于100毫升OPTI-MEMI培養(yǎng)基中定加15微升脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin)(Gibco Life Technologie，Karlsruhe，Germany)，且在室溫(RT)下孵育45分鐘(溶液A)。隨后在100微升OPTI-MEMI培養(yǎng)基中添加反義ODN(Eurogentec，Kln，Germany)到終濃度為0.5μM(溶液B)。在將溶液A和溶液B混合之后，于室溫下再度孵育15分鐘。于實(shí)驗(yàn)起始之時(shí)，在裝有脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑-反義ODN復(fù)合物的Eppendorf管內(nèi)添加0.8毫升內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基(不含肝素和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)，并將內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基更換為反義-脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng)基。于4小時(shí)之后取出反義-脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑培養(yǎng)基并用新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基(含有肝素和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)予以更換。STAT-1反義ODN的序列為5’-T*A*CCA*C*T*G*A*G*A*C*A*T*CC*T*GCC*A*C-3’(*硫代磷酸修飾的堿基；SEQ ID NO41)。
6.Western印跡分析將得自臍帶靜脈的人類內(nèi)皮細(xì)胞與得自胸腺靜脈的平滑肌細(xì)胞通過(guò)接續(xù)在液態(tài)氮中冷凍與在37℃(電熱組，Kleinfelden，Germany)下5分鐘的解凍予以碎裂。按照Hecker等(1994)，Biochem J.299，247中所述制備蛋白質(zhì)提取物。采用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)程序利用10％聚丙烯酰胺凝膠電泳在變性條件下于SDS存在中分離出20-30微克蛋白質(zhì)且予以轉(zhuǎn)移到BioTraceTM聚偏二氟乙烯轉(zhuǎn)移膜之上(polyvinylidene fluoride transfer membrane)(PallCorporation，Roβdorf，Germany)。使用下面的原抗體進(jìn)行免疫蛋白質(zhì)檢測(cè)CD40(多克隆，1∶2000稀釋，Research Diagnostics Inc.，F(xiàn)landersNJ，USA)，STAT-1蛋白質(zhì)(單克隆，1∶5000稀釋，BD TransductionLaboratories，Heidelberg，Germany)，IRF-1蛋白質(zhì)(多克隆，1∶2000稀釋，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany)，iNOS蛋白質(zhì)(多克隆，1∶3000稀釋，BD Transduction Laboratories，Heidelberg，Germany)。于分別添加過(guò)氧化物酶綴合的抗-兔-IgG與——在使用單克隆抗體的情況中——添加相應(yīng)的抗-小鼠-IgG(1∶3000，Sigma，Deisenhofen，Germany)之后，利用化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence method)(SuperSignal Chemiluminescent Substrate；Pierce Chemical，Rockford，IL，USA)和隨后的放射自顯影術(shù)(HyperfilmTMMP，Amersham Pharmacia，Biotech，Buckinghamshire，England)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。于“洗滌”轉(zhuǎn)移膜(5分鐘，0.2N NaOH，接著用H2O洗滌3×10分鐘)之后，通過(guò)用單克隆抗體和過(guò)氧化物酶綴合的抗-小鼠-IgG(兩者皆得自Sigma-Aldrich，1∶3000稀釋)檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白的等量蛋白質(zhì)條帶，而顯示出等量蛋白質(zhì)的裝載率和轉(zhuǎn)移。
7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析若沒(méi)有給予不同的說(shuō)明，附圖和文中的所有數(shù)據(jù)都表為n個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SEM。采用Student’st-檢驗(yàn)對(duì)未配對(duì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以p＜0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
8.通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)檢測(cè)誘餌寡核苷酸的影響8.1小鼠為了檢測(cè)本申請(qǐng)所開(kāi)發(fā)出的以誘餌寡核苷酸為基礎(chǔ)的治療法的功效，對(duì)每組8-10只動(dòng)物的小鼠針對(duì)抗原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎進(jìn)行“概念驗(yàn)證研究(proof-of-concept-study)”(有關(guān)所用模型可參閱Henzgen等，Exp.Toxicol.Pathol.(1996)，48，255)。將單份0.25納摩爾的STAT-1-誘餌寡核苷酸(SEQ ID NO33)直接施加到關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)內(nèi)注射)，可以在3-14天期間內(nèi)高度明顯地減低關(guān)節(jié)的抗原誘發(fā)的腫脹(減低35％)、炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度(減低70％)、關(guān)節(jié)破壞(減低80％)、總關(guān)節(jié)炎評(píng)分(減低70％)、以及血清中的促炎性細(xì)胞因子的濃度(例如白介素-6，減低80％)。與此不同，相應(yīng)的對(duì)照寡核苷酸都沒(méi)有治療功效。
此外，于此研究中值得注意的是，在關(guān)節(jié)炎誘發(fā)14天之后，于皮膚中引發(fā)的接觸性皮炎(IV型反應(yīng))——其由將抗原再度經(jīng)皮注射到動(dòng)物體內(nèi)一次產(chǎn)生——也在經(jīng)誘餌寡核苷酸處理的小鼠體內(nèi)獲得高度明顯的抑制(減低35％)。
8.2豚鼠于7天中將豚鼠(Hartley，雄鼠，體重350克)致敏化兩次(于第一天在一側(cè)耳朵中，于第二天在另一側(cè)耳朵中，每次都使用50微升的10％DNCB(溶于50％丙酮/50％橄欖油的溶液)；于第七天，使用15微升的2％DNCB(溶于95％丙酮/5％橄欖油的溶液)在頸部皮膚中加強(qiáng))之后，通過(guò)在第13天于動(dòng)物刮過(guò)毛的背部一或多個(gè)大小約1平方厘米的部位上分別再施用2，4-二硝基氯苯(DNCB；10微升0.5％ DNCB，溶于95％丙酮/5％橄欖油的溶液)，并于24小時(shí)之后以肉眼和組織學(xué)方式評(píng)估。以此種方式誘發(fā)的接觸性皮炎的組織學(xué)特征(Giemsa染色)在于，在表皮部位明顯形成浮腫和海綿層水腫(spongiosis)，凋亡細(xì)胞的增加以及白細(xì)胞大量侵潤(rùn)(圖8)。于末次DNCB暴露1小時(shí)之前，皮內(nèi)施用STAT-1-誘餌寡核苷酸(SEQ ID NO19)而非經(jīng)突變的對(duì)照寡核苷酸(5’-TGTGGACCGTAGGAAGTG-3’，SEQ ID NO61)，可導(dǎo)致所述的組織學(xué)參數(shù)之明顯減低，即總的說(shuō)來(lái)達(dá)到了炎癥反應(yīng)的明顯減弱。
序列表<110>亞文塔克有限公司<120>STAT-1-依賴性基因的表達(dá)調(diào)控<130>HEC-003 PCT/nat.
<140>未知<141>2004-04-04<150>DE 101 48 828.9<151>2001-10-04<160>61<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>順式作用元件誘餌<40>31ttatgtgaat tcctggaagt g 21<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>32cacttccagg aattcacata a 21<210>33<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>33catgttatgc atattcctgt aagtg 25<210>34<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌
<400>34cacttacagg aatatgcata acatg 25<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>35tgtgaattcc tgtaagtgag a 21<210>36<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>36tctcacttac aggaattcac a 21<210>37<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>37tgcatattcc tgtaagtg 18<210>38<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>38cacttacagg aatatgca 18<210>39<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>39atattcctgt aagtg15
<210>40<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>40cacttacagg aatat15<210>41<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>41taccactgag acatcctgcc ac22<210>42<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>42aacatcattg gcacgcag 18<210>43<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>反義寡核苷酸<400>43gtgaacctgc tccag15<210>44<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>44cagagttcac tgaaacggaa tgcc 24<210>45<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>45tgcctgcctg ttgcacaacc 20<210>46<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>46agcaaggcat gatgttaacc 20<210>47<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47gcattcctct cttccagagc 20<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48tcttaatcag tggtggaag19<210>49<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>49tttggtcaag ttgtttcc 18<210>50<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>50gtactccaca ttcctacttc tc22
<210>51<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>51tttgggtcta ttccgttgtg tc22<210>52<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52gttcatccgg caccagtcag 20<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>53acgtgcacat gagctgccta c 21<210>54<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>54gcggatcccc tccagcatga aagtctct 28<210>55<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>55acgaattctt cttgggttgt ggagtgag28<210>56<211>23<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>引物<400>56gtgcatttcc cgtaaatctt gtc 23<210>57<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>57cacttgataa cagaaagtga taactct 27<210>58<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>58agttgagggg actttcccag gc22<210>59<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>59gacagtgcag tgaactgtc19<210>60<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌<400>60catgttatgc agaccgtagt aagtg25<210>61<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>順式作用元件誘餌
<400>61tgtggaccgt aggaagtg18
權(quán)利要求
1.一種誘餌寡核苷酸，其包括具有SEQ ID NO1至32或34至40的一種序列的一條核酸鏈。
2.權(quán)利要求1的誘餌寡核苷酸，其具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵。
3.一種核酸分子，其具有SEQ ID NO41至43的一種序列。
4.權(quán)利要求3的核酸分子，其具有經(jīng)修飾的核苷酸間連鍵。
5.作為藥物的權(quán)利要求1或2的誘餌寡核苷酸和權(quán)利要求3或4的核酸分子。
6.權(quán)利要求1或2的誘餌寡核苷酸和權(quán)利要求3或4的核酸分子作為藥物的用途，所述的藥物用于預(yù)防及/或治療心血管并發(fā)癥、特別是在經(jīng)皮血管成形術(shù)之后的再狹窄與靜脈搭橋術(shù)之后的再狹窄，移植物排異，移植物抗宿主病(GVHD)，在外科介入范疇中的缺血/再注入相關(guān)性損傷，免疫學(xué)過(guò)敏性反應(yīng)(I至V型)，自身免疫性疾病、特別是糖尿病、多發(fā)性硬化癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，所有形式的急性、亞急性和慢性炎性疾病，特別是累及關(guān)節(jié)者、特別是關(guān)節(jié)炎，累及呼吸器官者、特別是支氣管哮喘和慢性支氣管炎，累及皮膚者、特別是牛皮癬和神經(jīng)性皮炎，以及累及胃腸道者、特別是潰瘍性結(jié)腸炎和克隆氏病，以及感染性休克。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO1至43的核酸序列的誘餌寡核苷酸和反義寡核苷酸以及這些寡核苷酸作為藥物的用途。
文檔編號(hào)A61P11/06GK1668629SQ02819705
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2002年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月4日
發(fā)明者馬庫(kù)斯·?？? 安德烈·H.·華格納 申請(qǐng)人:亞文塔克有限公司