專利名稱：用no對(duì)指甲感染的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療手和腳指(趾)甲感染的方法，用于這種治療的藥物以及這種藥物的制備方法。
指甲感染是常見的，嚴(yán)重的時(shí)候很痛苦并有損外貌，影響患者的生活質(zhì)量。與指甲感染有關(guān)的真菌主要是指那些由腳趾縫蔓延到指甲引起足癬(或皮癬菌病)的真菌。指甲的真菌感染稱為甲癬，也稱作甲真菌病、皮霉菌性甲癬或指甲“癬菌病”。
在甲癬中分離到的最常見的病原體是皮膚真菌，特別是紅色發(fā)癬菌(腳趾甲56％，手指甲36％)和須瘡癬菌(腳趾甲19％，手指甲11％)。酵母菌感染較少常見但其通常同白色念珠菌相關(guān)聯(lián)(腳趾甲10％，手指甲30％)。
估計(jì)40～60歲的人中至少15～20％有甲癬，超過60歲的人中25～40％患有此病，但低于18歲的只有3％或更少的患有此病。但是很難對(duì)甲癬的實(shí)際發(fā)病作出精確的估算，因?yàn)橹辽儆?0％的患者沒有尋求醫(yī)生診視。
輕度甲癬的癥狀可能只限于在指甲表面上的白斑或小凹陷，但更常見的疾病，其癥狀包括甲床過度角化，指甲增厚、褪色及甲松離(甲板與甲床分離)。
許多因素使患者易感染甲癬，包括糖尿病、年齡的增長(zhǎng)、多汗癥(hyperhydrosis)、甲脫離、外傷、外周循環(huán)不良、免疫抑制。此病在男性中更常見，且在青春期和絕經(jīng)前的女性中很少見。
甲癬是一種真菌病，并且適合真菌生長(zhǎng)的環(huán)境有利于甲癬的生長(zhǎng)。相應(yīng)地，80％的情況發(fā)生在腳上，特別是拇指或大腳趾并其通常同如穿緊鞋，出漢過多相聯(lián)系，例如在運(yùn)動(dòng)中可能常遇見此情形。但是，外傷也是一個(gè)主要的病原因素，特別是在腳趾甲中，最長(zhǎng)的腳趾特別地敏感。
并不完全確定甲癬是如何感染上的，但知道其具有傳染性。感染可能來自從皮膚到指甲的真菌的蔓延或直接來自其他人的皮膚或指甲感染。在腳趾甲感染的情況下，運(yùn)動(dòng)員的腳菌可能蔓延到指甲里，指甲外傷經(jīng)常發(fā)生，因而使真菌得以進(jìn)入。
盡管甲癬是很流行的，但此病對(duì)局部藥物有較強(qiáng)的耐藥性，因而對(duì)該病的治療受到了限制。局部的藥物治療包括羅每樂(阿莫羅芬)和Penlac(環(huán)吡酮)，但由于穿過指甲的滲透性差，且抗病原體的活性差，使其治愈率低(＜10％)，并且治療時(shí)間長(zhǎng)(長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月)。
治療甲癬和其它指甲感染的一個(gè)特有問題在于此感染通常位于或接近甲床及指甲本身，因而損毀的指甲使得感染免受外來的攻擊。治療可包括除去指甲，使感染的組織暴露出來，盡管除去太多的指甲是不受歡迎的。另外，治療期通常長(zhǎng)達(dá)一年或更久。
更最近，已開發(fā)出口服治療(特比萘芬和伊曲康唑)并獲得了更高的治愈率(～70％)和更短的治療期(12～16周)。但是對(duì)于這些較新的口服療法卻存在安全顧慮，包括肝臟毒性，嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)及藥物交互作用。
因此，需要一種治愈率相似或更優(yōu)于口服療法且安全顧慮少的局部的或透指甲的療法。
意外地，我們發(fā)現(xiàn)氮氧化物能穿透指甲并對(duì)指(趾)甲下感染的病原體的治療有效。
因而，在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療指(趾)甲下感染的氮氧化物生成組合物。
氧化氮(NO)是本發(fā)明組合物的一個(gè)主要產(chǎn)物，并已知其具有抗菌和創(chuàng)傷愈合的效果[c.f.WO 95/22335，和Hardwick等，(2001)，Clin.Sci.，100，395～400]。
氧化氮在體里在血管內(nèi)皮組織以及神經(jīng)元中及活化的巨噬細(xì)胞中被合成。在汗液中可以觀察到相對(duì)較高濃度的NO。盡管對(duì)于NO如何殺死微生物體沒有精確的認(rèn)識(shí)，但推測(cè)NO破壞細(xì)菌的DNA，或干擾含有過渡金屬的細(xì)菌酶的功能。
用于治療用途的氧化氮，最方便的制備方法是通過亞硝酸鹽與酸，特別是無機(jī)亞硝酸鹽和有機(jī)酸反應(yīng)得到。反應(yīng)所產(chǎn)生的亞硝酸的分子形式易分解為一分子的水和一分子的三氧化二氮，后者進(jìn)一步分解形成NO和二氧化氮。反應(yīng)如下所示
盡管N2O3在本反應(yīng)中是一個(gè)中間體，但有證據(jù)表明其可獨(dú)立存在，并且其對(duì)由本發(fā)明組合物所產(chǎn)生的殺菌效果至少具有部分作用。
在還原劑如抗壞血酸存在下，由三氧化二氮形成NO的反應(yīng)更有效，并可由例如下面的反應(yīng)來代表例如通過酸在亞硝酸鹽上的作用，特別是在生成的鹽不溶的情況下，適合亞硝酸的生成。
應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，本發(fā)明可使用任何適當(dāng)?shù)牡趸镌矗瑑?yōu)選可提供至少NO級(jí)分的氮氧化物源，一般優(yōu)選根據(jù)一個(gè)或更多上述反應(yīng)產(chǎn)生氮氧化物的氮氧化物源。
適合提供氮氧化物的任何組合物均可作為本發(fā)明的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，由本發(fā)明的組合物所生成的NO的比例優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少80％。若還原酸為唯一使用的酸，則所產(chǎn)生的氮氧化物中的NO的含量可升至100％。
“產(chǎn)生氮氧化物”是指本發(fā)明的組合物用于在原位釋放氮氧化物，即在其使用的部位，通常是在感染的指甲上。在一個(gè)實(shí)施方案中，其最簡(jiǎn)單的形式，可包括溶有氣態(tài)NO的軟膏或凝膠或，甚至其它任何適當(dāng)?shù)木植枯d體，如一旦將其應(yīng)用到指甲上時(shí)可釋放出NO。
如果只需要很少量的氮氧化物即可獲得效果，那么只要有足夠的氮氧化物可到達(dá)作用部位起到滅菌和抑制的效果，就不會(huì)介意在指甲表面以外是否有氣體的逃逸，或是否只有少量的氮氧化物穿過指甲真正地滲透進(jìn)去，或氮氧化物的量在穿過指甲的過程中是否會(huì)減少。
盡管NO及其前體一般是短壽命成分，半衰期短至數(shù)秒，但我們已證實(shí)其可足量地穿過人的指甲來治療指(趾)甲下的感染。更令人意想不到的是，不僅證實(shí)NO或其它氮氧化物穿過指甲到達(dá)那里可能需要數(shù)小時(shí)，而且一旦NO/其它氮氧化物開始釋放，則此釋放可以持續(xù)達(dá)10小時(shí)，甚至更長(zhǎng)時(shí)間。因此拋開理論的限制，似乎指甲充當(dāng)貯器或池，并吸附或吸收NO或前體。NO或前體穿過指甲，并在其另一面釋放NO和其它的氮氧化物?？紤]到此氣體的半衰期很短，可能的情況是其與蛋白質(zhì)在指甲中絡(luò)合并緩慢地?cái)U(kuò)散通過。
盡管已知NO有抗真菌的效果，但并不清楚NO是否必須穿過指甲，可能是當(dāng)前體一旦穿過指甲時(shí)，NO是唯一的再生物質(zhì)。事實(shí)上，在本發(fā)明中，產(chǎn)生大量NO的組合物不必有最好的效果。拋開理論的限制，在指甲表面有效而快速地產(chǎn)生NO可能是不利的，因?yàn)镹O的半衰期很短，可能不能足量地穿過指甲。相反地，需更長(zhǎng)時(shí)間產(chǎn)生NO的組合物在穿過指甲傳遞滅菌成分方面顯得更有效，不論此成分是NO或其它的氮氧化物。
基本上只包括抗壞血酸或其它相似的還原酸及亞硝酸鹽的本發(fā)明組合物易于快速產(chǎn)生大量的NO。盡管指甲有一定程度上的滲透性，但如果NO產(chǎn)生太快，則可能沒有足夠的時(shí)間使指甲吸收大量的生成NO，并且實(shí)驗(yàn)顯示這些組合物與更低的穿過指甲的NO總體流量相聯(lián)系。
在酸存在下，亞硝酸銀易于產(chǎn)生NO，但效率相對(duì)較低，所以通常不被優(yōu)選。然而例如在滅真菌的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)亞硝酸鈉和亞硝酸鉀可與乙酸、檸檬酸、馬來酸和蘋果酸反應(yīng)生成抑制區(qū)。
當(dāng)亞硝酸鈉和亞硝酸鉀同乙酸、檸檬酸、馬來酸和蘋果酸相結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)殺死真菌菌絲體的水平是相似的，都產(chǎn)生大量的抑制區(qū)。同樣的，發(fā)現(xiàn)用孢子所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，對(duì)于相同的酸-亞硝酸鹽混合物顯示出相似的抗真菌效果。通常發(fā)現(xiàn)溶液比乳膏可產(chǎn)生更強(qiáng)的抗真菌活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，菌絲體比孢子對(duì)抗真菌效果更敏感。然而，通常乳膏生成氮氧化物的時(shí)間更長(zhǎng)，當(dāng)為了提高穿過指甲的滲透性，希望能延長(zhǎng)NO或其它的氮氧化物在指甲表面上的生成時(shí)間，這成為乳膏的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。
由酸-亞硝酸鹽混合物生成的NO量不一定與抑制區(qū)大小必然地相關(guān)，但在一般情況下，與所產(chǎn)生的氮氧化物總量有關(guān)。例如，在一些實(shí)驗(yàn)中，可產(chǎn)生大量NO的抗壞血酸-亞硝酸鹽溶液只有很弱的抗真菌的活性，而亞硝酸鉀和蘋果酸的混合物只產(chǎn)生大約為檸檬酸一半量的NO，但其抑制區(qū)大小沒有必然地變小。
氮氧化物從指甲另一側(cè)的延時(shí)釋放是特別有益的，因?yàn)橥ǔＰ枰c活性物質(zhì)至少要接觸5分鐘才能產(chǎn)生殺菌作用。在同活性氣體接觸后大約30分鐘，可觀察到殺菌高峰，但暴露于活性氣體后，抗真菌的活性通常持續(xù)直到2小時(shí)。
氮氧化物產(chǎn)生的組合物可為任何適當(dāng)?shù)男问?。然而，?yīng)當(dāng)理解到，氮氧化物的產(chǎn)生是活潑的，那么通常需要將反應(yīng)物彼此分開直到氮氧化物被真正地需要。盡管其一般為優(yōu)選的，但不必總使用。例如，可用凝膠或基質(zhì)構(gòu)成一個(gè)封閉的貼片，并向其中加入可產(chǎn)生氮氧化物的成分，然后用一個(gè)合適的帶子將貼片保護(hù)起來防止氣體散發(fā)。
在此貼片中，優(yōu)選基質(zhì)或凝膠是有粘性的，并且其粘合強(qiáng)度足夠克服氮氧化物脫離和推開帶子的任何傾向，但應(yīng)當(dāng)意識(shí)到此粘性強(qiáng)度應(yīng)使帶子能很好的去除以使用此貼片。另外，為了延長(zhǎng)NO的壽命或減小其產(chǎn)生速度，優(yōu)選在凝膠或基質(zhì)中含適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如螯合劑。另外，因?yàn)镹O更易溶于非水和脂類物質(zhì)，在治療中加入這些物質(zhì)可延緩NO的活性以及將NO給藥到感染指甲和甲床的速度。
然而，已包含有游離NO的組合物通常不能穩(wěn)定任意長(zhǎng)的時(shí)間，并且優(yōu)選在制備后應(yīng)盡快讓患者使用。
更優(yōu)選以多個(gè)部分的形式提供本發(fā)明的組合物。這些部分可各自分別地包括活性物或反應(yīng)物，當(dāng)將其混合時(shí)，用于產(chǎn)生氮氧化物。因此，第一種組合物可包括裝在合適載體中的適合亞硝酸鹽。第二種組合物可包括適合的酸。然后將兩種組合物混合，優(yōu)選充分地混合，并然后將其施于感染的指甲上，或可在原位混合。盡管通常希望將必須混合的組分?jǐn)?shù)目降低到最小以獲得最終氮氧化物產(chǎn)生的組合物，但應(yīng)當(dāng)意識(shí)到任何數(shù)目都是可以的。特別是，例如可優(yōu)選提供包含有還原酸的三個(gè)組分。然而，當(dāng)還原酸，如抗壞血酸被使用，那么通常優(yōu)選將其以其本身作為酸使用或者提供將其連同主要酸(primary acid)一起在與亞硝酸鹽相分開的組合物中。
可將亞硝酸鹽組分加入到一系列的賦形劑中，包括，例如，聚甲基丙烯酸樹脂L100、聚羧乙烯、羧甲基纖維素或羥甲纖維素，并將酸組分加入到另一種適合的賦形劑中，如聚羧乙烯、羧甲基纖維素、羥甲纖維素、甲基纖維素或加入到水性基質(zhì)中。其它的賦形劑，如聚乙烯醇、丙二醇、聚乙烯吡咯酮(聚維酮)、明膠、瓜爾膠和蟲膠已用于幫助形成薄膜，其對(duì)在原位維持組合物是很有用的。
特別是，適于將物質(zhì)引入皮膚和角質(zhì)層的組合物可能通常不適用于指甲，因?yàn)橹讣讓?shí)際上是親水性物質(zhì)，而角質(zhì)層通常為疏水的。因而，易溶于水的離子和可離子化的物質(zhì)在指甲中優(yōu)選被吸收，并且優(yōu)選可促進(jìn)此吸收的賦形劑。
通常優(yōu)選使用含水的堿性制劑來幫助滲透。此制劑可為流動(dòng)的溶液，但似乎NO和/或其它的氮氧化物與指甲接觸最短時(shí)間是最佳的，因此通常優(yōu)選氮氧化物的產(chǎn)生不要完成的太快，以便可有充足的時(shí)間在指甲表面吸收，并通常優(yōu)選的制劑形式為凝膠、乳膏、外用洗液、軟膏，或其它的濃稠形式，如漆狀物(lacquers)?？墒褂萌缟厦枋龅馁x形劑來實(shí)現(xiàn)適當(dāng)?shù)脑龀砗推渌奶匦?。例如，已證實(shí)使用聚甲基丙烯酸樹脂能改變氮氧化物從制劑中的釋放特性。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括分隔開的有機(jī)酸和亞硝酸鹽水性制劑。更優(yōu)選地，每個(gè)制劑采取適合彼此混合的凝膠、乳膏、外用洗液、軟膏或涂布劑的形式。特別優(yōu)選一或兩個(gè)制劑都包含有適于在混合時(shí)延緩氮氧化物釋放的賦形劑。對(duì)于亞硝酸鹽，優(yōu)選的賦形劑是聚甲基丙烯酸樹脂，如聚甲基丙烯酸樹脂L100。對(duì)于兩者優(yōu)選的其它賦形劑如上文所列舉。
被選的賦形劑可簡(jiǎn)單地為了延緩氧化物的釋放，但通常也應(yīng)有增稠的性質(zhì)，此賦形劑的用量通常由為了提供適當(dāng)?shù)哪z所需量來確定，其可在已知的范圍內(nèi)變化，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易的確定和認(rèn)可此范圍。然而，作為指導(dǎo)，適合量為約1％～40％，盡管不同的賦形劑有很大的區(qū)別。通常，優(yōu)選地賦形劑只需使用2％～10％的量，如3％～5％，然而那些主要用作膠凝作用的賦形劑，不論是結(jié)合還是單獨(dú)使用，其使用量應(yīng)適于實(shí)現(xiàn)此目的。例如，用量為約10％～50％w/v的聚乙二醇適于用作粘合劑，但更優(yōu)選約20％～35％w/v。適合的增稠劑包括聚羧乙烯和纖維素衍生物，并根據(jù)所需制劑的性質(zhì)，其用量一般為約2％～10％。一種優(yōu)選制劑為流動(dòng)性凝膠。
可以理解發(fā)明的組合物可包括所需的其它組分，如抗氧化劑、防腐劑、著色劑和香料以及表面活性劑和/或滲透劑，盡管不需這些附加的組分，含水的亞硝酸鹽和酸的組分即可提供穿過指甲的氮氧化物。
盡管本發(fā)明這里就這兩種組分混合最終得到氮氧化物產(chǎn)生組合物方面進(jìn)行了舉例說明，但是應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)提及這些組分時(shí)，除非顯而易見或明確指出，其包括多于兩種初始組分。
本發(fā)明的組合物可包括用于混合的任何適當(dāng)?shù)妮d體。重要的是酸和亞硝酸鹽，或亞硝酸鹽前體，其可按此方式反應(yīng)產(chǎn)生需要的氮氧化物。因此，提供最終組合物的初始組分中至少有一種應(yīng)優(yōu)選包含有含水組分，以便讓產(chǎn)生氮氧化物的反應(yīng)發(fā)生。更優(yōu)選地，兩種初始組分都應(yīng)包含有含水組分以有利于成分的混合，其中希望組分應(yīng)緩慢反應(yīng)，一或兩種組分中的含水量應(yīng)最小化。
對(duì)能夠混合得到最終組合物的初始組分的類型沒有限制，只要此最終組合物可用于產(chǎn)生氮氧化物。在此方面，應(yīng)當(dāng)理解全文所提及的“氮氧化物”包括100％的NO，盡管不是必需或優(yōu)選的。
例如，此初始組分可是任何適當(dāng)?shù)男问?，如液體、凝膠或固體，盡管當(dāng)一種是固體，那么另一種優(yōu)選為液體或凝膠。液體的分類包括溶液、懸液和膠體，并且這種情況也適用于凝膠，其通常包括液體和固體之間的任何狀態(tài)。
更詳細(xì)地說，凝膠根據(jù)其性質(zhì)，可包括如乳膏、軟膏、酊劑、蠟狀物和洗劑這些狀態(tài)，盡管后者可能屬于液體。應(yīng)當(dāng)理解到，只要這種液體凝膠固體可用作活性物的載體，并沒有特別的排除。
固體載體可包括例如貼片中的基質(zhì)或更長(zhǎng)鏈的蠟。
初始組分物應(yīng)在使用前或在原位適當(dāng)?shù)乇换旌?，用來提供可產(chǎn)生氮氧化物的最終組合物。例如，此混合物可直接是凝膠/凝膠混合物，將其用于指甲并留在原位。它們也可包括兩種液體，在它們之間，形成凝膠、漆狀物、固體或涂漆，同樣的，還可包括兩種凝膠，或一種液體和一種凝膠，其可固化，形成漆狀物，或另外形成一種對(duì)氮氧化物的產(chǎn)生、保持和分散起保護(hù)的環(huán)境。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將凝膠用于指甲，然后將含有基質(zhì)的貼片如膏藥用于凝膠上，此基質(zhì)含有其它活性物，一旦接觸，活性物質(zhì)之間緩慢地相互作用產(chǎn)生氮氧化物。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，活性物質(zhì)可以涂布劑(paints)或漆狀物的形式進(jìn)行分散。合適地，一種組分如亞硝酸鹽可被應(yīng)用，然后將其干燥，并在上面涂上第二層。第二層中的水可使反應(yīng)進(jìn)行。盡管本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不必使用此種溶劑和滲透增強(qiáng)劑，但是如果需要，可以使用快速干燥的溶劑，如乙醇或乙酸酯。然而可優(yōu)選將薄膜的組分提供于彼此分離的制劑中，以便使得聚合反應(yīng)例如在混合時(shí)能夠發(fā)生。在一個(gè)制劑可含有某種催化劑，而在另一個(gè)中可含有一種可聚合的單體?？蛇x擇地，在制劑中，溶劑的揮發(fā)可使聚合物成凝膠狀或進(jìn)一步硬化。
本發(fā)明組合物的氮氧化物產(chǎn)生階段通常經(jīng)2或3小時(shí)或通常更少的時(shí)間而減弱，但是指甲下沉效果使為指甲的另一側(cè)提供氮氧化物所用的時(shí)間更長(zhǎng)，并通常直到氧化物的產(chǎn)生有效地停止。在氧化物產(chǎn)生過程中，優(yōu)選將組合物在原地混合，其可通過組合物裝置來實(shí)現(xiàn)?？晒┻x擇地，例如優(yōu)選使用封閉的敷藥來保護(hù)指甲。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，貼片的基質(zhì)，或膏藥，為非水的但具有親水性，并含有基本干燥形式的活性物的混合物。在這種情況下，術(shù)語“干燥形式”可包括例如含有結(jié)晶水的晶體。因而，盡管兩種活性物質(zhì)都在貼片或膏藥的基質(zhì)中，但在沒有適量的水來充當(dāng)溶劑來提供反應(yīng)環(huán)境的情況下，它們不會(huì)發(fā)生反應(yīng)。當(dāng)想要使用貼片或膏藥時(shí)，可除去保護(hù)性的帶子并向基質(zhì)中加入適量的水如幾滴來活化活性成分?？蓪⒋嘶罨馁N片應(yīng)用于指甲上使氮氧化物產(chǎn)生來發(fā)揮效果。
這種提供基本上干燥的組合物并向其中加入水的方法也可用于其它的組合物。在這種情況下，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語“干燥”指游離水含量相關(guān)，所以盡管此組合物可為凝膠，例如，其水含量卻很低，如1％，或更低。優(yōu)選此組合物基本上無水。
本發(fā)明組合物的活性成分可以任何適當(dāng)?shù)牧看嬖冢它c(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯而易見的。通常，優(yōu)選亞硝酸鹽的量約為最終組合物重量的0.5～30％。更優(yōu)選地，亞硝酸鹽或其前體的量為1～20％，特別地1～15％，優(yōu)選地5～15％。優(yōu)選范圍為1～10％，或2～10％。通常優(yōu)選更高的濃度，并優(yōu)選最低濃度為8～10％。在乳膏、外用洗液和凝膠中，其上限為約13.5％，盡管在適當(dāng)?shù)闹苿┲锌赡茉试S更高的水平。
通常優(yōu)選本發(fā)明的組合物提供為兩種含水凝膠、外用洗液或乳膏。更優(yōu)選，一種含有檸檬酸其濃度為0.5％～20％，如0.75％、2.25％、4.5％、9％和13.5％w/w，另一種含有上文所述的亞硝酸鈉，例如，0.5％、1.5％、3.0％、6％和9％w/w。優(yōu)選每種活性組分的濃度范圍為10％內(nèi)，這樣提供一種適當(dāng)過量的酸。也優(yōu)選兩種活性組分的濃度至少在2％，優(yōu)選5％w/w或更高，以便可提供有效劑量的氮氧化物穿過指甲。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，此酸的含量為13.5％并且亞硝酸鹽的量為9％，但在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，每個(gè)組分的含量為10％。優(yōu)選的酸為檸檬酸，而優(yōu)選的亞硝酸鹽為亞硝酸鈉。
凝膠、外用洗液或乳膏可被患者以任何適當(dāng)?shù)牧炕旌喜⒗绶笤谀_或手指甲的感染部位。每種凝膠、外用洗液或乳膏的適合量可為0.05～1g，更優(yōu)選0.1～0.5g，其組分反應(yīng)產(chǎn)生氮氧化物。
相對(duì)亞硝酸鹽或其前體，優(yōu)選酸的含量至少為化學(xué)計(jì)算量。更優(yōu)選地，酸的含量為化學(xué)計(jì)算過量，確保有足夠的酸可為亞硝酸鹽提供酸性環(huán)境以產(chǎn)生氮氧化物。盡管將全部的亞硝酸鹽生成氮氧化物并不是必須的，但有太多的亞硝酸鹽沒有反應(yīng)通常是低效的，優(yōu)選將大多數(shù)的亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氮氧化物。
通常，優(yōu)選酸的含量為足夠量使得最終組合物的pH為5或更低，特別是pH為4或更低。然而，氮氧化物產(chǎn)生反應(yīng)可在更高的pH下發(fā)生，并且pH為5.5或甚至為6可被可接受的，特別是在有過量的還原酸存在下，從而應(yīng)當(dāng)理解為最終組合物的pH并不是本發(fā)明的重要部分。
對(duì)于亞硝酸鹽，除了其通常為藥用外沒有其它的限制。甚至此種需求也不是主要的考慮，因?yàn)榇俗罱K組合物通常用于患者的指甲上，使得皮膚接觸為最小的，因此相應(yīng)地使可能全身接觸降低到最小。然而，為了安全考慮，優(yōu)選使用亞硝酸鹽或其前體，其通常對(duì)于局部用藥是安全的。
為了簡(jiǎn)單起見，亞硝酸鹽的性質(zhì)通常為無機(jī)的并至少可部分溶于水。優(yōu)選堿金屬亞硝酸鹽和堿土金屬亞硝酸鹽，盡管其它適合的亞硝酸鹽，如過渡金屬化合物也可被用，只要適合特別是溶解性合適。特別是，可以及使用鈉、鉀、鎂和鋇化合物，從價(jià)格和可得性方面考慮，通常優(yōu)選鈉和鉀化合物。
合適的酸化劑包括無機(jī)酸，但由于其通常不可藥用，一般不被優(yōu)選。因而，更優(yōu)選有機(jī)酸，特別是那些適于同水形成溶液并產(chǎn)生pH為4或更低的有機(jī)酸。這類酸包括甲酸、蘋果酸、馬來酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、苯甲酸、酒石酸和水楊酸，應(yīng)當(dāng)理解此名單包含性的，而非排他性。其它適合的酸包括不必形成酸溶液的抗壞血酸和抗壞血酸棕櫚酸鹽，但其為還原酸，可增加NO的產(chǎn)生量，并且一旦NO產(chǎn)生，其也可用于穩(wěn)定NO。應(yīng)當(dāng)意識(shí)到在此所指的酸包括所提及的適于提供酸性水溶液的酸的任意形式，只與水混合或與優(yōu)選在生理上可接受的脫保護(hù)劑混合的形式，其可能在混合前最初存在于亞硝酸鹽溶液或制劑中。適合形式的例子包括含酸的水合式或無水的形式，如檸檬酸一水合物和其無水的形式。
由于還原酸有利的性質(zhì)，在實(shí)施方案中，當(dāng)形成最終組合物時(shí)，除了主要酸外，優(yōu)選提供一種還原酸。其適當(dāng)?shù)谋壤s為主要酸的5％～200％，以及更優(yōu)選約5％～150％，特別是主要酸的5～40％，更特別地為10～20％。
應(yīng)當(dāng)理解，按照下面的實(shí)施例，特別是其中有機(jī)體為紅色發(fā)癬菌的情況，本發(fā)明涉及可為任何可產(chǎn)生抑制區(qū)的組合物。
本發(fā)明也提供治療指(趾)甲下感染的方法，其中在文中所描述的組合物以有效的量施用于感染的指甲。
本發(fā)明也提供氮氧化物產(chǎn)生的組合物在藥物制備方面的用途，此藥物用于治療和預(yù)防指(趾)甲下感染。
應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，本發(fā)明包括含有在文中所定義組分的試劑盒。特別是，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含亞硝酸鹽的含水制劑和有機(jī)酸的含水制劑的試劑盒，彼此分開放置，這兩種制劑每一種均適合應(yīng)用于被治療的指甲，使得亞硝酸鹽和酸可反應(yīng)放出氮氧化物來滲透進(jìn)入指甲。此制劑優(yōu)選如文中所表述的濃度和/或形式，特別是外用洗液、凝膠、乳膏或漆狀物，并適合以在可再次密封的容器中提供，以使得每個(gè)試劑盒可提供多劑或多次施用。
本發(fā)明的組合物可用來治療任何形式的指(趾)甲下感染。然而通常優(yōu)選治療甲癬。
適合的治療期通常由一般的醫(yī)生即可容易地確定。然而通常，優(yōu)選應(yīng)繼續(xù)治療直到實(shí)現(xiàn)真正的痊愈或完全的臨床治愈。在前一種情況中，病原體被殺死了，但指甲可能還很難看，因?yàn)槭种讣滓?個(gè)月的時(shí)間才能長(zhǎng)出來，而腳趾甲要長(zhǎng)達(dá)一年的時(shí)間。當(dāng)感染的指甲不再有感染的跡象時(shí)即實(shí)現(xiàn)臨床治愈，因其取決于長(zhǎng)出的指甲，因而同真正的痊愈相比可能要用明顯更長(zhǎng)的時(shí)間。
通常優(yōu)選繼續(xù)治療為至少兩個(gè)月，更優(yōu)選三個(gè)月，特別是3～6個(gè)月。事實(shí)上，我們的試驗(yàn)表明病原體在開始治療的幾天內(nèi)即有可能被殺死，所以治療一周可能是足夠的，特別是例如，若一天使用二或三次該組合物。三個(gè)月的治療方案對(duì)于實(shí)現(xiàn)治愈將足夠了，也可使得患者能觀察到健康的指甲長(zhǎng)出來。然而，應(yīng)當(dāng)理解到只要需要例如直到獲得臨床的治愈，此治療可一直繼續(xù)下去，其可能長(zhǎng)達(dá)14個(gè)月或更長(zhǎng)，使得指甲痊愈并生長(zhǎng)。
使用的組合物的劑量和數(shù)量可由下列參數(shù)來確定，如患者的年齡和體重，但更具體地，可由指甲的尺寸而定，如受體的厚度和面積來決定，并且這些可由一般的醫(yī)生很容易地確定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于只需少量的氮氧化物即可產(chǎn)生效果，所以不必要求對(duì)于不同的患者要有不同的處方，并且一種制劑可用于所有的患者。然而，可使用不同的強(qiáng)度，如較高強(qiáng)度的氧化物產(chǎn)生制劑用于在腳趾中的持久狀況，如較低強(qiáng)度的制劑用于手指甲。此強(qiáng)度不必與生成的氧化物量相關(guān)，但可能與由給定的組合物產(chǎn)生氧化物的時(shí)間長(zhǎng)短有同等地關(guān)系。
施用發(fā)明的組合物可一天2次或更多次，優(yōu)選一天2～3次，其構(gòu)成了發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。此優(yōu)選方案可當(dāng)先前的藥效逐漸減弱的時(shí)候，有效地提供在指甲的感染側(cè)的氮氧化物濃度的提高?？蛇x擇的劑量應(yīng)能保持氮氧化物穿過指甲傳輸?shù)倪B續(xù)性，或如所需的間斷性。
本發(fā)明的組合物可由任意適合的方法制備得到。當(dāng)組合物包括有含水組分的時(shí)候，那么通常優(yōu)選將活性組分溶于水，或含水的制劑中，然后將活性組分彼此分開直到需要的時(shí)候。在主要的活性組分溶解后通常加入任何賦形劑?？芍苽浠緹o水的干燥制劑，當(dāng)需要活化組合物時(shí)加入水。
當(dāng)最終組合物包含有液體或凝膠的時(shí)候，其可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒▉硎┯?，包括手工混合。其它的方法可包括雙管(double barrelled)注射器或雙驅(qū)動(dòng)分配器(dual actuated dispenser)，如由手指或壓舌板(spatula)或其它任何適當(dāng)?shù)姆椒▉韺?shí)現(xiàn)最終混合。
應(yīng)當(dāng)理解下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明范圍是非限制性的。這些實(shí)施例參考附圖進(jìn)行舉例說明，其中

圖1圖解說明用于測(cè)定抑制區(qū)的實(shí)驗(yàn)；圖2顯示測(cè)定從本發(fā)明組合物中釋放的氮氧化物的Franz傳感器(cell)裝置；圖3表示從含有亞硝酸鹽和酸的膠凝劑中的NO生成量相對(duì)于時(shí)間的關(guān)系；圖4表示對(duì)于某些溶液和凝膠狀制劑的抑制區(qū)；圖5表示在還原劑存在下所試驗(yàn)的制劑的抑制區(qū)；圖6表示在α-維生素E和其它的還原劑存在下所試驗(yàn)的制劑的抑制區(qū)；圖7表示由不同制劑所產(chǎn)生的NO和NO2/NO3的濃度平均峰值；圖8表示由不同的試驗(yàn)制劑所產(chǎn)生的NO達(dá)到最高產(chǎn)量的平均時(shí)間；圖9表示由10％酸和10％亞硝酸鹽溶液所產(chǎn)生的NO在18小時(shí)期間穿過指甲的量；圖10表示由5％酸和5％亞硝酸鹽溶液所產(chǎn)生的NO在18小時(shí)期間穿過指甲的量；圖11表示用于測(cè)定圖9和10中穿過指甲的NO量的裝置；圖12表示由10％抗壞血酸和10％亞硝酸鹽溶液所產(chǎn)生的NO在18小時(shí)期間穿過指甲的量，以及圖13表示用于測(cè)定應(yīng)用于人指甲的本發(fā)明組合物所得到的抑制區(qū)的Franz傳感器裝置。
方法例1用于篩選氣體產(chǎn)生制劑的體外分析模型測(cè)定不同乳膏和溶液的殺傷區(qū)的方法如圖1所示。圖示說明顯示了試驗(yàn)的構(gòu)成。將2mL的Eppendorf管的蓋嵌入到Sabouraud葡萄糖瓊脂層中，并在瓊脂的表面涂上一層黑曲霉孢子。使用黑曲霉孢子，因?yàn)橐阎渑c菌絲體相比對(duì)抗菌活性有更強(qiáng)的抗性。然后將此凹面培養(yǎng)得到菌絲體，或直接被用來測(cè)試發(fā)明的混合物殺孢子的能力。將本發(fā)明的混合物放在Eppendorf蓋中并用移液器的底部攪拌10次。這些測(cè)試板這里也指抑制板的有壁孔區(qū)。每個(gè)制劑測(cè)試三次。
該方法提供了很好的結(jié)果，因?yàn)楫a(chǎn)生NO的混合物不與瓊脂相接觸，并且對(duì)照表明空孔穴不會(huì)抑制生長(zhǎng)。此種測(cè)定法也是很靈敏的。
所用的對(duì)照如下i)只含有Sabouraud葡萄糖瓊脂的空Eppendorf；ii)在Eppendorf蓋中的0.1ml亞硝酸鈉(10％)；iii)在Eppendorf蓋中的0.1ml檸檬酸(13.5％)；iv)在Eppendorf蓋中的0.1ml亞硝酸鈉(9％)；和v)在Eppendorf蓋中的0.1ml檸檬酸(10％)。
在任一個(gè)對(duì)照中都沒有看到生長(zhǎng)的抑制。
方法例2指示有機(jī)體同甲癬相關(guān)的皮膚癬菌是生長(zhǎng)緩慢的生物體，在Sabouraud葡萄糖瓊脂板上于25℃培養(yǎng)最少5天才能生成完整的培養(yǎng)層。這在活性制劑篩選中的限制性因素，因?yàn)橹辽僖靡恢艿臅r(shí)間才能得到一組結(jié)果。因此，盡管一些組合物的效果由紅色發(fā)癬菌來確定，但通常決定使用快速生長(zhǎng)的指示有機(jī)體來分析制劑的效果。可選擇的生物體為真菌、黑曲霉素，經(jīng)常用于監(jiān)測(cè)美容和局部制劑防腐和殺菌效果的生物體。
黑曲霉素用作同甲癬相關(guān)的皮膚癬菌的指示生物體，并在真菌孢子和菌絲體上進(jìn)行測(cè)試。若使用菌絲體，殺傷區(qū)可由真菌孢子的發(fā)展(黑/棕)缺失來確定，白色區(qū)表示成長(zhǎng)抑制。在真菌孢子板上，生長(zhǎng)抑制由菌絲體的發(fā)展缺失(白色/乳酪色)來確定，所以只能看到瓊脂。
方法例3NO的檢測(cè)所生成的NO可用WPI法(World Precision Instruments，Inc.)NO檢測(cè)器來測(cè)定。當(dāng)用此種檢測(cè)器時(shí)，NO的測(cè)定需在有水環(huán)境中實(shí)現(xiàn)，并且此實(shí)驗(yàn)適于滿足此要求。這些設(shè)備也可通過添加化學(xué)藥品和將本方法進(jìn)行較小的改動(dòng)來監(jiān)測(cè)NO2/NO3的生成量。
在室溫下，將Franz傳感器組裝起來放在磁力攪拌器上，在裝有去離子水的較低的接受體中含有磁子，其可確保氣體分散滲透薄膜。1/2英寸(13mm)的圓濾紙片中浸漬有NO產(chǎn)生制劑中的亞硝酸鈉組分。將此浸漬的圓片放在薄膜上Franz傳感器的上層隔室中，之后移取等量的檸檬酸組分放到上面。NO的產(chǎn)生量用WPI NO檢測(cè)器來監(jiān)測(cè)。實(shí)驗(yàn)如圖2所示被安裝。
當(dāng)所測(cè)的NO的濃度到達(dá)平臺(tái)時(shí)，將含有亞硝酸鈉和檸檬酸混合物的圓片移開，并向接受體隔室中加入0.1ml的0.1MH2SO4+0.1M KI溶液，并用WPI探測(cè)器測(cè)定(通過轉(zhuǎn)化)的NO2/NO3量。
實(shí)施例1亞硝酸鹽溶液混合的酸性制劑對(duì)黑曲霉孢子的效果所選的酸為檸檬酸、乙酸、抗壞血酸、馬來酸和蘋果酸。所選的亞硝酸鹽為鈉、鉀和銀鹽。
使用方法例1中所描述的建立的測(cè)定裝置。文中所有涉及殺傷區(qū)的實(shí)施例都使用方法例1中的裝置，除非另外指出。
用蒸餾水配制下面的酸溶液(w/v)
1)檸檬酸2.5％2)檸檬酸5％3)檸檬酸7.5％4)檸檬酸10％5)抗壞血酸2.5％6)抗壞血酸5％7)抗壞血酸7.5％8)抗壞血酸10％9)馬來酸2.5％10)馬來酸5％11)馬來酸7.5％12)馬來酸10％13)蘋果酸2.5％14)蘋果酸5％15)蘋果酸7.5％16)蘋果酸10％17)乙酸2.5％18)乙酸5％19)乙酸7.5％20)乙酸10％將Eppendorf微量管的蓋子移開，滅菌并通過將蓋子放在培養(yǎng)皿中并在其周圍傾倒25ml瓊脂的方法將Eppendorf微量管的蓋子移到Sabouraud葡萄糖瓊脂板中。將瓊脂固定并然后用黑曲霉素來接種。上文所指的每個(gè)溶液用2.5、5、7.5和10％鈉/鉀/銀亞硝酸鹽溶液混合，通過將精確量的0.1ml的每種溶液加入到微管的蓋子中并慢慢地旋轉(zhuǎn)板來進(jìn)行混合。對(duì)于上文所列的酸溶液用分開板進(jìn)行并在32℃培養(yǎng)。在24小時(shí)后測(cè)定每塊板的生長(zhǎng)抑制區(qū)。結(jié)果如下表1和2所示。
表1亞硝酸鈉抑制區(qū)結(jié)果-黑曲霉孢子
表2亞硝酸鉀抑制區(qū)結(jié)果-黑曲霉孢子
表格中沒有顯示亞硝酸銀的結(jié)果，因?yàn)閷?duì)任何被試驗(yàn)的酸，其與亞硝酸銀反應(yīng)沒有觀察到抑制區(qū)。
某些抗壞血酸混合物混合時(shí)會(huì)膨脹以至于在凹孔上形成半球形隆起，偶爾在將板向培養(yǎng)箱轉(zhuǎn)移的過程中會(huì)導(dǎo)致少量溢出到瓊脂上，其可產(chǎn)生抑制區(qū)。在無溢出物存在下，用抗壞血酸溶液沒有觀察到抑制區(qū)。其它的酸沒有任何溢出或膨脹的跡象。這些測(cè)試表明除了那些含有亞硝酸銀或抗壞血酸的混合物外，所有被測(cè)的混合物都是有效的。
實(shí)施例2用亞硝酸鹽混合的酸制劑對(duì)黑曲霉菌絲體的作用酸溶液按實(shí)施例1中所描述的方法制備。在加入氣體產(chǎn)生制劑前，將板在32℃培養(yǎng)過夜以得到完全的生長(zhǎng)膜。然后如實(shí)施例1中所描述地方法將溶液加入到凹孔中。將板在32℃再培養(yǎng)24小時(shí)。，當(dāng)孢子生成區(qū)(黑)和非孢子生成區(qū)(白/淡黃)形成的時(shí)候測(cè)定生長(zhǎng)抑制區(qū)。結(jié)果如表3、4和5所示。
表3亞硝酸鈉抑制區(qū)結(jié)果-黑曲霉菌絲體
表4亞硝酸鉀抑制區(qū)結(jié)果-黑曲霉菌絲體
表5亞硝酸銀抑制區(qū)結(jié)果-黑曲霉菌絲體
這些測(cè)試結(jié)果表明，除了那些大多數(shù)含有亞硝酸銀或抗壞血酸的混合物外，所有被測(cè)的混合物都是有效的。
實(shí)施例3用亞硝酸鹽溶液混合的酸性含水乳膏制劑對(duì)黑曲霉孢子的效果除了用含水乳膏代替溶液外，遵循實(shí)施例1中所描述的相同的方法，使用相同濃度酸和亞硝酸鹽。結(jié)果如表6和7所示。
表6亞硝酸鈉乳膏對(duì)黑曲霉孢子上影響
表7亞硝酸鉀乳膏對(duì)黑曲霉孢子的影響
表格中沒有顯示亞硝酸銀的結(jié)果，因?yàn)閷?duì)任何被試驗(yàn)的酸，其與亞硝酸銀反應(yīng)沒有觀察到抑制區(qū)。這些測(cè)試表明除了那些含有亞硝酸銀或抗壞血酸的混合物外，所有被測(cè)的混合物都是有效的。
實(shí)施例4用亞硝酸鹽溶液混合的酸性含水乳膏制劑對(duì)黑曲霉菌絲體的影響除了用含水乳膏代替溶液外，遵循實(shí)施例2中所描述的相同的方法，使用相同濃度酸和亞硝酸鹽。結(jié)果如表8、9和10所示。
表8亞硝酸鈉乳膏對(duì)黑曲霉菌絲體的影響
表9亞硝酸鉀乳膏對(duì)黑曲霉菌絲體的影響
表10亞硝酸銀乳膏對(duì)黑曲霉菌絲體的影響
這些測(cè)試表明除了那些大多數(shù)含有亞硝酸銀或抗壞血酸的混合物外，所有被測(cè)的混合物都是有效的。
實(shí)施例5由酸和亞硝酸鹽混合物所產(chǎn)生的NO量用WPI NO檢測(cè)器來計(jì)算每種酸和亞硝酸鹽溶液所產(chǎn)生的NO量的粗略估計(jì)，如方法實(shí)施例3中所描述。在每個(gè)試驗(yàn)里，將亞硝酸鹽組分(50μl)加入到10ml酸溶液中。
首先將NO探測(cè)器浸入到酸組分(每個(gè)實(shí)驗(yàn)中的10％的溶液)中。在加入亞硝酸鹽以前，將此檢測(cè)器留酸中平衡。當(dāng)基線形成時(shí)，將儀器調(diào)零，并加入亞硝酸鹽。先加入最低濃度的，當(dāng)曲線開始變平時(shí)再加入隨后的添加物。所產(chǎn)生的曲線只能提供生成的NO量的粗略估計(jì)，在此情況下不能測(cè)定其值。在每套讀數(shù)之前在使用利用WPI的詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)方案，作出校準(zhǔn)曲線，可供在不同溫度下NO檢測(cè)過程中的任何細(xì)微的變化之用，如由WPI所建議的。
對(duì)于亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，將2.5、5、7.5和10％濃度的溶液在不同點(diǎn)加入到每種酸中。亞硝酸銀較難溶，只有使用很低濃度，所以只將0.025、0.05、0.075和0.1％濃度的溶液加入到酸中。
得到所有酸和亞硝酸鹽的校準(zhǔn)曲線和NO釋放曲線。對(duì)于同抗壞血酸相混合的亞硝酸鈉和亞硝酸鉀，其在磁子和NO檢測(cè)器附近有氣泡產(chǎn)生。
對(duì)某些制劑，可用下述簡(jiǎn)單研究來估計(jì)NO2/NO3相對(duì)量。其可通過上述方法例3中所描述的，即當(dāng)NO產(chǎn)生制劑達(dá)到最大值時(shí)，通過加入1ml的0.1M H2SO4和0.1M KI。0.1MH2SO4和0.1M KI將NO2/NO3轉(zhuǎn)化為NO，后者可用WPI NO檢測(cè)器來記錄。得到的結(jié)果為●10ml檸檬酸(10％)+50μl NaNO2(10％)生成4000pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值達(dá)到20000pA。可以估計(jì)出約有20％的NO及80％的NO2/NO3。
●10ml檸檬酸(10％)+50μl KNO2(10％)生成2200pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值達(dá)到10700pA?？梢怨烙?jì)出約有20％的NO及80％的NO2/NO3。
●10ml抗壞血酸(10％)+50μl AgNO2(0.1％)生成5200pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，沒有觀察到峰值的改變。可以估計(jì)出約有100％的NO，沒有NO2/NO3。
●10ml乙酸(10％)+50μl AgNO2(0.1％)生成70pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值達(dá)到2700pA?？梢怨烙?jì)出約有3％的NO及97％的NO2/NO3。
意外地注意到，即使前面實(shí)施例的結(jié)果，確定使用抗壞血酸的混合物沒有產(chǎn)生抑制區(qū)，但使用抗壞血酸的組合可產(chǎn)生相當(dāng)量的NO。然而，抗壞血酸同亞硝酸銀一起卻產(chǎn)生很少或不產(chǎn)生NO2/NO3。被測(cè)試的所有其它酸，產(chǎn)生的NO2/NO量都比NO量大。
同樣值得注意地，蘋果酸-亞硝酸鉀NO產(chǎn)生曲線及檸檬酸-亞硝酸鉀NO產(chǎn)生曲線顯示出NO產(chǎn)生量和前面實(shí)施例中所見的區(qū)域大小兩者之間幾乎沒有相關(guān)性。這兩種酸產(chǎn)生非常相似的區(qū)域大小，但蘋果酸同亞硝酸鈉一起只產(chǎn)生約三分之一量的NO。
實(shí)施例6制劑評(píng)價(jià)聚甲基丙烯酸樹脂考察了聚甲基丙烯酸樹脂漆狀物改變制劑的NO釋放的能力。通常，聚甲基丙烯酸酯(Eudragit)被用于口服藥片/膠囊制劑的薄膜包衣劑。選擇不同的薄膜可產(chǎn)生不同的藥物釋放速率。可用的不同的聚甲基丙烯酸樹脂包括聚甲基丙烯酸樹脂E、聚甲基丙烯酸樹脂L和聚甲基丙烯酸樹脂S。聚甲基丙烯酸樹脂E被用作簡(jiǎn)單地絕熱薄膜形成物，并可在pH低于5時(shí)溶于胃液中。聚甲基丙烯酸樹脂L和S用作腸溶衣劑，對(duì)胃液具有抗性。不同形式的聚甲基丙烯酸樹脂L和S可溶于不同的pH，例如聚甲基丙烯酸樹脂L100溶于pH大于6的溶液，聚甲基丙烯酸樹脂S100溶于pH大于7的溶液。可將聚甲基丙烯酸樹脂組合起來獲得不同的藥物釋放特性?？疾炝撕兴岷蛠喯跛猁}的聚甲基丙烯酸樹脂制劑的活性氣體產(chǎn)生。
測(cè)試表明組合亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100將NO的釋放時(shí)間從5分鐘延長(zhǎng)到25～30分鐘(數(shù)據(jù)沒有顯示)。將酸組分配制在聚甲基丙烯酸樹脂(E100)中，對(duì)延緩NO的生成具有很少的或沒有效果。因而，適合的制劑為將亞硝酸鈉配制在L100中，大量的酸存在于凝膠中。
實(shí)施例7替代性的凝膠制劑視覺考察了酸及亞硝酸鹽組合的不同膠凝劑制劑中情況。所用的膠凝劑如下
3％羧甲基纖維素(CMC)；3％甲基纖維素(MC)；3％聚羧乙烯934；3％明膠A；3％明膠B；20％聚乙二醇(PEG)400；20％PEG 600；20％PEG 1000；3％羥甲纖維素(HMC)；和3％聚乙烯醇(PA)。
所有的凝膠都由下面兩種溶液來制備(i)10％檸檬酸溶液，以及(ii)10％亞硝酸鈉溶液。
進(jìn)行了視覺判定和pH檢測(cè)(用石蕊試紙)。結(jié)果如表11和12所示。
表1110％亞硝酸鈉凝膠膠凝劑 pH 性狀CMC8 形成濃的淡黃色凝膠MC 8 水狀、黃色，可見沉淀物聚羧乙烯9349.5濃的淡黃色不透明凝膠明膠A 8.5橙色透明液體明膠B 8 黃色透明液體PEG400 8.5淡黃色透明液體PEG600 8.5淡黃色透明液體PEG10009 淡黃色透明液體HMC8.5濃的淡黃色凝膠PA 8 淡黃色液體，有沉淀物從表11中可以看出CMC、HMC和聚羧乙烯，在10％亞硝酸鈉存在下都形成穩(wěn)定的凝膠。
表1210％檸檬酸凝膠的特性膠凝劑 pH 性狀CMC2 流動(dòng)性凝膠，不透明(無色)MC 1 流動(dòng)性凝膠，透明聚羧乙烯9341 流動(dòng)性凝膠，不透明明膠A 2 淡黃色透明液體明膠B 2 淡黃色透明液體PEG400 1 透明液體PEG600 1 透明液體PEG10002 透明液體HMC1 透明的濃凝膠PA 2 透明液體從表12中可以看出HMC、CMC、MC和聚羧乙烯，在10％檸檬酸存在下都形成穩(wěn)定的凝膠。
這些測(cè)試提供了某些初步結(jié)果。特別地，明膠是優(yōu)選的膠凝劑，并優(yōu)選以常規(guī)的較高濃度使用，如20％～40％，更通常為約30％。
實(shí)施例8NO-產(chǎn)生制劑對(duì)紅色發(fā)癬菌的效果方法如上述方法例2中所描述，使用抑制板的有壁孔區(qū)，用來檢測(cè)不同NO產(chǎn)生制劑對(duì)皮膚癬菌的滅菌活性。配制下述制劑并將其加入到預(yù)先接種紅色發(fā)癬菌的有壁瓊脂板孔上●含有10％檸檬酸的聚羧乙烯(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100(50μl)混合。
●含有10％檸檬酸的CMC(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的CMC(50μl)混合。
●含有10％檸檬酸的含水乳膏(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的含水乳膏(50μl)混合。
●含有10％檸檬酸的HMC(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的HMC(50μl)混合。
●含有10％檸檬酸的聚甲基丙烯酸樹脂E100(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂E100(50μl)混合。
●含有10％檸檬酸的MC(50μl)與含有10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100(50μl)混合。
●50μl的10％檸檬酸與10％亞硝酸鈉溶液(50μl)混合。
●50μl的10％檸檬酸與含有10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100(50μl)混合。
●陽性對(duì)照(不加入制劑)。
表13結(jié)果-五天后的區(qū)域大小產(chǎn)生NO的制劑抑制區(qū)10％檸檬酸 10％亞硝酸鈉(cm)聚羧乙烯 L1007.7CMCCMC 5.6含水乳膏 含水乳膏3.4HMCHMC 8.5E100 L1000MC L1007.7溶液 溶液8.5溶液 L1008.5無 無 0結(jié)果表明紅色發(fā)癬菌對(duì)由本發(fā)明的制劑所產(chǎn)生的殺傷力有很高的敏感性，可觀察到大的殺傷區(qū)。
實(shí)施例9從漆狀物/膠凝劑中所生成的NO的WPI測(cè)定建立一種實(shí)驗(yàn)方法來分析NO產(chǎn)生制劑中NO的釋放時(shí)間。將制劑直接地放到Franz傳感器中的0.2μm孔徑的濾器表面上，導(dǎo)致制劑濾過濾紙，且反應(yīng)在Franz傳感器的較低容器中進(jìn)行。相應(yīng)地，將抗菌圓片用NO產(chǎn)生制劑中的亞硝酸鈉組分滲入，并將此圓片放在膜上Franz傳感器的上層隔室中，之后移取等量的檸檬酸組分放到浸漬的圓片上面。用WPI NO檢測(cè)器來監(jiān)測(cè)NO的產(chǎn)生量。實(shí)驗(yàn)裝置如圖2所示。
評(píng)價(jià)了三種制劑●10％檸檬酸的聚羧乙烯934和10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100●10％檸檬酸的HMC和10％亞硝酸鈉的聚甲基丙烯酸樹脂L100溶液●10％檸檬酸溶液和10％亞硝酸鈉溶液此結(jié)果如圖3所示，其顯示出從含有亞硝酸鹽和酸的膠凝劑中所產(chǎn)生的NO的量隨時(shí)間的變化。聚羧乙烯和L100 NO產(chǎn)生制劑達(dá)到50000pA的峰值，高于WPI儀表的檢測(cè)限。然而，從此曲線圖中可觀察到制劑以相當(dāng)穩(wěn)定的速度釋放NO，并在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)以恒定速率持續(xù)了23分鐘。與之形成對(duì)比的是，由溶液所產(chǎn)生的NO速率在很早的時(shí)候就開始慢下來了，可能是因?yàn)樗a(chǎn)生的NO中的大部分從溶液中冒泡并釋放到空氣中。對(duì)于HMC的樣品可觀察到相似的模式。結(jié)果表明可用制劑方法得到不同的NO釋放形式。
實(shí)施例10用于測(cè)試的制劑在表14中所列出的制劑用于考察抑制區(qū)、NO釋放形式以及NO2/NO3釋放。列在表14中的組分的濃度是混合前的濃度(％w/w在去離子水中)。
表14樣品號(hào) 含10％亞硝酸鈉(％w/w) 含10％檸檬酸(％w/w)的制劑的制劑1羧甲基纖維素(CMC)(3％) + 聚羧乙烯(3％)2CMC(3％)+ 羥甲纖維素(HMC)(3％)3CMC(3％)+ 甲基纖維素4CMC(3％)+ CMC(3％)5CMC(3％)+ 溶液(DW)6L100(聚甲基丙烯酸樹脂)(5％) + 聚羧乙烯(3％)7L100(5％) + HMC(3％)8L100(5％) + MC(3％)9L100(5％) + CMC(3％)10 L100(5％) + 溶液(DW)11 羥甲纖維素(HMC)(3％)+ 聚羧乙烯(3％)
12 HMC(3％) + HMC(3％)13 HMC(3％) + MC(3％)14 HMC(3％) + CMC(3％)15 HMC(3％) + 溶液(DW)16 溶液(蒸餾水(DW)) + 聚羧乙烯(3％)17 溶液(DW) + HMC(3％)18 溶液(DW) + MC(3％)19 溶液(DW) + CMC(3％)20 溶液(DW) + 溶液(DW)21 乳膏(溶于DW的 + 乳膏(溶于DW的50％含水乳膏)50％含水乳膏)22 溶液(DW) + 1M抗壞血酸鈉23 溶液(DW) + 1M硫氫化鈉(SHS)只評(píng)價(jià)了表15的組合物的抑制區(qū)。
表15樣品號(hào) 制劑(％w/w)24 檸檬酸(20％)+抗壞血酸(20％) + 亞硝酸鈉(20％)25 檸檬酸(20％)+抗壞血酸(16％) + 亞硝酸鈉(20％)26 檸檬酸(20％)+抗壞血酸(12％) + 亞硝酸鈉(20％)27 檸檬酸(20％)+抗壞血酸(8％) + 亞硝酸鈉(20％)28 檸檬酸(20％)+抗壞血酸(4％) + 亞硝酸鈉(20％)29 檸檬酸(16％)+抗壞血酸(20％) + 亞硝酸鈉(20％)30 檸檬酸(12％)+抗壞血酸(20％) + 亞硝酸鈉(20％)31 檸檬酸(8％)+抗壞血酸(20％) + 亞硝酸鈉(20％)32 檸檬酸(4％)+抗壞血酸(20％) + 亞硝酸鈉(20％)33 檸檬酸(20％)+1M Na2S2O4+ 亞硝酸鈉(20％)34 檸檬酸(20％)+1M抗壞血酸鈉 + 亞硝酸鈉(20％)35*檸檬酸(20％)+1M Na2S2O4+ 亞硝酸鈉(20％)36*檸檬酸(20％)+1M抗壞血酸鈉 + 亞硝酸鈉(20％)37**DW + 亞硝酸鈉(20％)所列出的單獨(dú)組分代表混合前的初始濃度(％w/w在去離子水中(DW))。
*和**分別代表陽性和陰性對(duì)照。
評(píng)價(jià)了可選擇的還原劑α-維生素E對(duì)抑制區(qū)的影響。使用此還原劑的組合物列在表16中。也包括作為比較的含有亞硝酸鈉和檸檬酸及抗壞血酸(樣品號(hào)24)、Na2S2O4(樣品號(hào)33)或抗壞血酸鈉(樣品號(hào)34)的組合物的制劑。
表16樣品號(hào) 制劑(％w/w)38 9g DW+1g檸檬酸+50μlα-維生素E+ 亞硝酸鈉(20％)39 4g DW+1g檸檬酸+5g乙醇+50μl + 亞硝酸鈉α-維生素E (20％)40*DW+ DW所列出的單獨(dú)組分代表混合前的初始濃度(％w/w)。
*代表陰性對(duì)照。
實(shí)施例11A)抑制區(qū)圖4、5和6顯示實(shí)施例10的制劑對(duì)抑制區(qū)的效果。明顯地，可得出大多數(shù)被考察的制劑在觀察的抑制區(qū)方面沒有明顯的不同的結(jié)論，盡管樣品號(hào)32(低濃度的檸檬酸和高濃度的抗壞血酸)及樣品號(hào)39(配制在乙醇中的α-維生素E)顯示出比其它制劑更低的活性。然而，其它含有高濃度(20％)抗壞血酸(樣品24～31)組合物的制劑顯示出在抗真菌活性方面沒有明顯的減弱，如抑制區(qū)分析中所示。
圖4顯示表14中的溶液和凝膠制劑的抑制區(qū)。
圖5顯示表15中在還原劑存在下所研究制劑的抑制區(qū)。
圖6顯示表16中在α-維生素E和其它還原劑存在下所研究制劑的抑制區(qū)。
B)NO和NO2/NO3釋放用pA為單位來表示由WPI儀器測(cè)定的NO產(chǎn)生量的數(shù)據(jù)。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖來計(jì)算NO釋放濃度(數(shù)據(jù)沒有顯示)。通常，所獲得的曲線顯示溶液制劑釋放NO比凝膠制劑更快。在溶液制劑中，樣品號(hào)20(亞硝酸鈉和檸檬酸的溶液)顯示出在最短的時(shí)間內(nèi)有很高的NO釋放量。然而，含有聚羧乙烯(樣品號(hào)16)和CMC(樣品號(hào)19)中的亞硝酸鈉溶液和檸檬酸的溶液制劑的組合物，在一段長(zhǎng)期的時(shí)間可產(chǎn)生最大量的NO。發(fā)現(xiàn)通常CMC制劑釋放的NO量最低。
圖7表示不同研究制劑產(chǎn)生的NO平均峰值和NO2/NO3濃度。在所考察的凝膠制劑中，發(fā)現(xiàn)CMC制劑同其余的凝膠制劑(L100，HMC和聚羧乙烯)相比，產(chǎn)生更低濃度的NO。不同制劑所產(chǎn)生的NO濃度的平均峰值與時(shí)間的關(guān)系如圖8所示。除樣品19(包含CMC)外，數(shù)據(jù)證實(shí)與凝膠制劑相比，溶液(樣品號(hào)5、10、16～20)可明顯更快地達(dá)到NO濃度頂點(diǎn)。
圖7表示不同制劑所產(chǎn)生的NO的平均峰值和NO2/NO3濃度。
圖8表示不同制劑達(dá)到最大NO產(chǎn)生量的平均時(shí)間。
實(shí)施例12NO透過人指甲情況18小時(shí)，10％溶液使用如圖11所示的裝置。在T0點(diǎn)，將100μl的10％亞硝酸鈉和100μl的10％檸檬酸移液到一片人指甲表面上，后者固定在Franz傳感器上(暴露面為0.1963cm2)。穿過指甲的NO量由WPI NO檢測(cè)器監(jiān)控18小時(shí)。結(jié)果如圖9所示。
18h，5％溶液使用如圖11所示的裝置。在T0點(diǎn)，將100μl的5％亞硝酸鈉和100μl的5％檸檬酸移液到一片人指甲表面上，后者固定在Franz傳感器上(暴露面為0.1963cm2)。穿過指甲的NO量由WPI NO檢測(cè)器監(jiān)控18小時(shí)。結(jié)果如圖10所示。
陰性對(duì)照陰性對(duì)照包括將200μl的去離子水移液到一片人指甲表面上，后者放在Franz傳感器上，其他操作與10％和5％的操作過程相同。
從圖中可看出，10％溶液的NO產(chǎn)生在開始時(shí)候明顯地下降。然而，經(jīng)過約4小時(shí)后(不同的實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生不同的時(shí)間滯后，沒有顯示數(shù)據(jù))，NO突然增加，然后在高水平保持約10小時(shí)。5％的溶液可產(chǎn)生正濃度水平的NO，雖然其水平比10％的制劑稍低。在實(shí)驗(yàn)開始有最初下降后，陰性對(duì)照從沒有偏離基線(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
實(shí)施例13測(cè)定利用10％抗壞血酸和10％亞硝酸鈉的穿過人指甲NO的情況在實(shí)驗(yàn)的第一階段，裝配好圖11的雙臂指甲Franz傳感器，但用一片透氣性的薄膜來代替人指甲。在制劑加入前，將此系統(tǒng)保持約40分鐘。如實(shí)施例12中那樣，將100μl的10％抗壞血酸和100μl的10％亞硝酸鈉溶液加入到Franz傳感器的頂部，并用parafilm覆蓋頂部。
在實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的NO量超過了NO檢測(cè)器的檢測(cè)限，并且曲線圖僅在1小時(shí)后即偏離標(biāo)尺(10μM)。沒有在頂峰處觀察到有初始的下降。所產(chǎn)生的NO量約比檸檬酸(10％)和亞硝酸鈉(10％)產(chǎn)生的量高20倍。
然后重復(fù)該實(shí)驗(yàn)，此次使用一片人指甲。然后將100μl的10％抗壞血酸和100μl的10％亞硝酸鈉直接施用到指甲表面并混合。將Franz傳感器用parafilm覆蓋，并且用WPI儀表來監(jiān)測(cè)穿過指甲的NO量。結(jié)果如圖12所示。
最高點(diǎn)上的下降似乎是涉及人指甲和NO產(chǎn)生制劑實(shí)驗(yàn)的普通的假象。下降之后最高點(diǎn)的增加是很突然的，兩者之間不是逐步改變的。
從圖12中可以看出，盡管包含有抗壞血酸的混合物可提供持續(xù)釋放的NO穿過指甲，但其水平比使用檸檬酸要低約10倍(10×)。
實(shí)施例14對(duì)于穿過人指甲的抗真菌氣體穿透性的Franz傳感器指甲生物測(cè)試如圖13所示將Franz傳感器裝配好，下層部分充滿熔融的Sabouraud葡萄糖瓊脂一直到出口孔下方約8mm處。待瓊脂冷卻并固定后，將25μl的黑曲霉孢子懸液移液到瓊脂表面上，并將指甲切片以空氣密封方式裝在出口孔上方，并在適當(dāng)?shù)奈恢脢A緊。然后將此容器在32℃培養(yǎng)24小時(shí)獲得一層菌絲體。
當(dāng)菌絲體長(zhǎng)出時(shí)，將容器從培養(yǎng)箱中移出，并將0.1ml的檸檬酸和0.1ml的亞硝酸鈉移液到Franz傳感器的漏斗中，并用移液器頭混合。陰性對(duì)照加入0.2ml的10％亞硝酸鈉溶液或0.2ml的10％檸檬酸。然后將所有Franz傳感器的漏斗頂端用parafilm覆著。將容器放置在室溫中。經(jīng)過2小時(shí)10分鐘后，將每個(gè)Franz傳感器中的溶液移出，并用相當(dāng)溶液代替，并且每2小時(shí)10分鐘將此過程重復(fù)一次，再重復(fù)了兩次，總共用進(jìn)行四次。在使用最后一次溶液后，在室溫下將此容器蓋上，讓有機(jī)體慢慢生長(zhǎng)24小時(shí)。
在24小時(shí)后，裝有檸檬酸和亞硝酸鈉混合物的所有六個(gè)容器在最靠近指甲/制劑的位置，都有黑曲霉素菌落的中心區(qū)域，其已被活性氣體所殺死。這可由暈效應(yīng)得到證實(shí)，在暈效應(yīng)中死的白色菌絲體面積被一圈黑色的孢子形成的菌絲體所包圍。再經(jīng)過24小時(shí)，黑曲霉素可通過從沒被殺死的最遠(yuǎn)區(qū)域向中心生長(zhǎng)并恢復(fù)。
含有亞硝酸鈉或檸檬酸的所有容器均顯示有一層完整的菌絲體生長(zhǎng)膜，其有形成的孢子，由固體黑圈證實(shí)。
此結(jié)果清楚地證實(shí)本發(fā)明的制劑產(chǎn)生穿過指甲有效氣體組分的能力。明確表明此活性氣體能穿透人完整的腳趾甲，并直接影響黑曲霉素的生長(zhǎng)。另外，此制劑穿透指甲并影響在其他8毫米范圍內(nèi)的有機(jī)體的生長(zhǎng)，在活體內(nèi)的間隔事實(shí)上可以忽略不計(jì)。對(duì)照確定的確是活性氣體引起暈輪效應(yīng)。
實(shí)施例15試劑盒配制含有兩種含水凝膠制劑的試劑盒。所述制劑有如下配方A.亞硝酸鈉凝膠(2ml)亞硝酸鈉 6.6％羥甲纖維素 10.0％聚乙烯吡咯烷酮 5.0％聚乙二醇 20.0％苯甲醇 1.0％著色劑 0.005％水 至100％B.檸檬酸凝膠(2ml)檸檬酸 10.0％聚羧乙烯 5.0％聚乙烯吡咯烷酮 5.0％聚乙二醇 30.0％羥苯甲酸甲酯 0.2％對(duì)羥苯甲酸丙酯 0.02％水 至100％著色劑 0.005％制劑A和B被分別裝在可再密封的、可擠壓的軟管中，以方便在應(yīng)用到指甲前立即混合或在指甲上混合。
權(quán)利要求
1.一種可用于治療指甲下的感染氮氧化物產(chǎn)生的組合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其包括在使用前彼此分開放置的亞硝酸鹽和有機(jī)酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2組合物，其中酸為足量存在的使得最終組合物pH為5.5或更低。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的組合物，其中酸選自甲酸、蘋果酸、馬來酸、乙酸、乳酸、檸檬酸、苯甲酸、酒石酸和水楊酸、抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸鹽及其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2～4中任一項(xiàng)的組合物，其中亞硝酸鹽選自堿金屬亞硝酸鹽和堿土金屬亞硝酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中亞硝酸鹽選自鈉，鉀、鎂和鋇亞硝酸鹽。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其包括檸檬酸和亞硝酸鈉，每一個(gè)在使用前彼此分開放置，至少有一個(gè)存在于含水的載體中。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求種任一項(xiàng)組合物，其中指甲下的感染為甲癬。
9.根據(jù)權(quán)利要求2～8中任一項(xiàng)的組合物，其中亞硝酸鹽組分與賦形劑進(jìn)行配制，賦形劑選自聚甲基丙烯酸樹脂、聚羧乙烯、羧甲基纖維素、羥甲纖維素及其混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求2～8中任一項(xiàng)的組合物，其中酸組分用選自聚羧乙烯、羧甲基纖維素、羥甲纖維素、甲基纖維素及其混合物的賦形劑進(jìn)行配制。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中酸和亞硝酸鹽被分開置于水性制劑中。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的組合物，其中每個(gè)制劑形式分別選自適于彼此混合的凝膠、乳膏、外用洗液、軟膏和涂布劑。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中酸和亞硝酸鹽分別配制成凝膠、涂布劑或漆狀物。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中酸和亞硝酸鹽分別配制成液體或凝膠，當(dāng)兩者混合時(shí)固化或形成凝膠或涂布劑。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中亞硝酸鹽約為最終組合物重量的0.5～30％。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中亞硝酸鹽約為最終組合物重量的5～15％。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的組合物，其中酸約為最終組合物重量的5～30％。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的組合物，其中酸約為最終組合物重量的10～15％。
19.一種根據(jù)實(shí)施例可產(chǎn)生抑制區(qū)的組合物。
20.氮氧化物產(chǎn)生的成分在用于治療或預(yù)防指甲下感染的藥劑制備中的用途，其中此藥劑為權(quán)利要求2～19中任一項(xiàng)所定義的組合物。
21.一種用于治療或預(yù)防指甲下感染的方法，其中將權(quán)利要求1～19中任一項(xiàng)所定義的組合物以有效量施于感染的指甲。
22.包含如權(quán)利要求1～19中任一項(xiàng)所定義的組合物的試劑盒。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的試劑盒，包括亞硝酸鹽的水性制劑和有機(jī)酸的水性制劑，彼此分開放置，兩種制劑各自均適合施用于治療的指甲上，使得亞硝酸鹽和酸反應(yīng)釋放出氮氧化物滲透進(jìn)入指甲。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的試劑盒，其中每個(gè)制劑為選自外用洗液、凝膠、乳膏和漆狀物的形式。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24的試劑盒，其中制劑被裝在可再密封的容器中。
全文摘要
氮氧化物產(chǎn)生的組合物可用于指趾甲下感染的治療，因?yàn)橐馔獾匕l(fā)現(xiàn)NO能穿透指甲發(fā)揮抗真菌的作用。
文檔編號(hào)A61P17/00GK1564681SQ02819625
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2002年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月3日
發(fā)明者奈杰爾·本杰明 申請(qǐng)人:阿伯丁大學(xué)