位過表達(dá)。
[0046] 本發(fā)明具體以長非編碼RNA CCAT1-L為例，采用所述的表達(dá)方法，實現(xiàn)了 CCAT1-L 在結(jié)腸癌細(xì)胞中的原位過表達(dá)。
[0047] 具體的，試驗方法包括下列步驟：
[0048] 1)構(gòu)建 TALEN 質(zhì)粒。
[0049] 所述TALEN質(zhì)粒所針對的靶位點位于待激活的長非編碼RNA基因的啟動子與其基 因起始序列之間。
[0050] 具體的，左右TALEN質(zhì)粒識別序列分別為TCATCATTACCAGCTGCCGT和 ACGCTCACGATTCACAGAAA。
[0051] 2)設(shè)計并構(gòu)建Donor質(zhì)粒，所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串聯(lián)的第 二啟
[0052] 動子和篩選標(biāo)記基因。
[0053] 所述篩選標(biāo)記基因可以為抗性基因和熒光蛋白標(biāo)記基因。所述抗性基因如 puromycin (噪呤毒素）抗性基因或者blasticidin (殺稻癌素）抗性基因等。所述突光蛋 白標(biāo)記基因如EGFP、YFP熒光蛋白標(biāo)記基因等。
[0054] 如本發(fā)明一個實施例具體列舉的，所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串 聯(lián)的CMV啟動子、puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標(biāo)記基因。
[0055] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述puromycin抗性基因和EGFP突光蛋白標(biāo)記基因之間還插入有 T2A序列。
[0056] 具體的，所述Donor質(zhì)粒的序列如SEQ ID N0:29所示。
[0057] 如本發(fā)明另一具體實施例列舉的，所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串 聯(lián)的CMV啟動子、puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標(biāo)記基因、BGH終止序列、SV40終止 序列以及Ptight啟動子。
[0058] 更佳的，所述puromycin抗性基因和EGFP突光蛋白標(biāo)記基因之間還插入有T2A序 列。
[0059] 具體的，所述Donor質(zhì)粒的序列如SEQ ID N0:30所示。
[0060] 3)將步驟1)和2)構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒和Donor質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，通過同源重組 對受體細(xì)胞進(jìn)行基因組改造，培養(yǎng)受體細(xì)胞，篩選獲得陽性結(jié)果并驗證。
[0061] 具體的，實施例采用了結(jié)腸癌細(xì)胞作為受體細(xì)胞。
[0062] 對于插入可誘導(dǎo)啟動子的情況，進(jìn)行過表達(dá)驗證時，需要誘導(dǎo)表達(dá)。具體的，對于 ptight啟動子，可利用可誘導(dǎo)系統(tǒng)（Tet-〇n系統(tǒng)、Tet-〇ff系統(tǒng)）對靶基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。
[0063] 本發(fā)明具體實施采用了 qPCR、Northernblot驗證了基因組的改造，采用RNA熒光 原位雜交實驗、以及RNA/DNA雙熒光原位雜交實驗驗證了原位過表達(dá)。
[0064] 采用上述方法獲得陽性細(xì)胞，可用于原位過表達(dá)CCAT1-L，所述過表達(dá)的CCAT1-L 能正確定位于細(xì)胞核上。從而可用于對CCAT1-L的功能研究。所述長非編碼RNA基因的 [0065] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0066] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明。
[0067] 實施例1CCAT1過表達(dá)細(xì)胞系的獲得和鑒定
[0068] 1.實驗材料
[0069] 1)試劑
[0070] 引物合成自上海博尚生物有限公司；EcoRI和NotI購自NEB公司；pLKO. 1L來自 addgene網(wǎng)站；TALEN組裝試劑盒購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司。
[0071] 2)細(xì)胞株和載體
[0072] 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116培養(yǎng)在加入了 10%胎牛血清（Gbico)，1%。雙抗的DMEM培養(yǎng)基 (Gibco)中貼壁培養(yǎng)。
[0073] 2?實驗方法
[0074] 2. 1TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建
[0075] TALEN質(zhì)粒的構(gòu)建按照TALEN組裝試劑盒(購自上海斯丹賽生物技術(shù)有 限公司）說明書進(jìn)行，左右TALEN質(zhì)粒識別序列分別為TCATCATTACCAGCTGCCGT和 ACGCTCACGAITCACAGAAA。所得 TALEN 質(zhì)粒進(jìn)行 sanger 測序驗證。
[0076] 2. 2Donor質(zhì)粒的構(gòu)建
[0077] 為實現(xiàn)靶基因的過表達(dá)，需在靶基因的5'端插入一個啟動子(如CMV啟動子、 EFlalpha);同時，在基因組中插入抗性基因（如puromycin (噪呤毒素）抗性基因或者 blasticidin (殺稻癌素）抗性基因等）和突光蛋白標(biāo)記(如GFP)可以為后續(xù)的克隆篩選提 供很大的幫助。
[0078] 因此，將順序串聯(lián)CMV啟動子和puromycin抗性基因和GFP的片段插入到靶基 因的啟動子后面，基因編碼區(qū)前面。為了產(chǎn)生獨立且具有功能的puromycin蛋白，可在 puromycin和EGFP之間插入T2A序列，該序列在翻譯后可以被細(xì)胞中的酶識別并切割。（示 意圖如圖2A)。
[0079] 使用以下引物1和引物2以及引物3和引物4從HCT116細(xì)胞基因組中分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增Donor質(zhì)粒的左右同源臂，然后在pCR II質(zhì)粒(購自Invitrogen)使用Hind III和 Kpnl插入左同源臂，用Xho I和BamH I插入右同源臂。然后使用引物5和引物6從pTALETF_ v2(NI)(購自上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司）中擴(kuò)增CMV promoter，用引物7和引物8從 pLKO. 1-TRC(購自Addgene)中擴(kuò)增puro基因，用引物9和引物10從pTALETF_v2 (NI)中 擴(kuò)增T2A-EGFP片段。上述擴(kuò)增所用條件均為常規(guī)。將得到的片段進(jìn)行overlapping后使 用Kpnl和BamH I插入到帶有左右同源臂的pCR II質(zhì)粒中，即獲得所需Donor質(zhì)粒。所得 Donor質(zhì)粒的序列如SEQ ID N0:29所示。
[0080] 表 1PCR引物
[0081]
【主權(quán)項】
1. 一種原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，為：通過同源重組技術(shù)，在受體的靶基 因啟動子之后，靶基因的基因序列之前，插入一個第二啟動子及篩選標(biāo)記基因，并通過篩選 標(biāo)記篩選獲得陽性結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，包括下列步 驟： 1)構(gòu)建特異識別靶序列TALEN質(zhì)粒； 2)設(shè)計并構(gòu)建Donor質(zhì)粒,所述Donor質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串聯(lián)的第二啟 動子及篩選標(biāo)記基因； 3)將步驟1)和2)構(gòu)建的TALEN質(zhì)粒和Donor質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，通過同源重組對受 體細(xì)胞進(jìn)行基因組改造，培養(yǎng)受體細(xì)胞并根據(jù)篩選標(biāo)記篩選獲得陽性結(jié)果并驗證。
3.如權(quán)利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，步驟1)中， 所述TALEN質(zhì)粒所針對的靶位點位于靶基因的啟動子與其基因起始序列之間；步驟2)中， 所述Donor質(zhì)粒對應(yīng)的同源重組靶序列位于靶基因的啟動子與其基因起始序列之間。
4.如權(quán)利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，所述第二啟 動子選自CMV啟動子或EFlalpha啟動子；所述篩選標(biāo)記基因為抗性基因和熒光蛋白標(biāo)記基 因。
5.如權(quán)利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，所述Donor 質(zhì)粒的左右同源臂之間，篩選標(biāo)記基因之后，還順序插入有終止序列及可誘導(dǎo)的啟動子。
6.如權(quán)利要求2所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，所述Donor 質(zhì)粒的左右同源臂之間包括順序串聯(lián)的CMV啟動子、puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白 標(biāo)記基因；所述左右同源臂之間，EGFP熒光蛋白標(biāo)記基因之后可選擇地順序插入有BGH和 SV40兩種終止序列以及Ptight啟動子。
7.如權(quán)利要求6所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征在于，所述 puromycin抗性基因和EGFP熒光蛋白標(biāo)記基因之間插入有T2A序列。
8.如權(quán)利要求1-7任一權(quán)利要求所述原位激活長非編碼RNA基因的表達(dá)方法，其特征 在于，所述長非編碼RNA基因以編碼基因替代。
9.如權(quán)利要求1-7中任一權(quán)利要求所述的表達(dá)方法的用途，為用于原位激活長非編碼 RNA基因的過表達(dá)，從而應(yīng)用于LncRNA的功能研究領(lǐng)域。
10. 如權(quán)利要求8所述的表達(dá)方法的用途，為用于原位激活編碼基因的過表達(dá)，從而應(yīng) 用于編碼基因的功能研究領(lǐng)域。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用基因組編輯技術(shù)實現(xiàn)原位激活基因的表達(dá)方法及其應(yīng)用。本發(fā)明通過同源重組技術(shù)，在受體的靶基因啟動子之后，靶基因的基因序列之前，插入一個第二啟動子及篩選標(biāo)記基因，并通過篩選標(biāo)記篩選獲得陽性結(jié)果，從而實現(xiàn)原位激活基因的表達(dá)。本發(fā)明的表達(dá)方法可用于原位激活基因的過表達(dá)，從而應(yīng)用于基因的功能研究領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N15-11, C12N15-65, C12Q1-68
【公開號】CN104845994
【申請?zhí)枴緾N201410051873
【發(fā)明人】陳玲玲, 楊力, 向劍鋒
【申請人】中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2014年2月14日