本發(fā)明涉及crispr/cas9的基因修飾
技術領域：
，特別是涉及一種內源性啟動子驅動外源基因表達的方法。
背景技術：
：crispr/cas9(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat/crispr-associatednuclease9)基因編輯系統(tǒng)是基于古細菌抵御外源核酸入侵的免疫機制為基礎開發(fā)出來的一種新型基因編輯技術。相對于傳統(tǒng)的基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)具有突變效率高、制作簡單及成本低等特點。目前該技術成功應用于人類細胞、斑馬魚和小鼠以及細菌的基因組精確修飾，修飾類型包括基因定點敲除、基因定點敲入、兩位點同時突變和小片段的缺失。目前已有用該技術將外源熒光蛋白定點敲入斑馬魚的不同基因的不同區(qū)域，如2015年，《cell》上發(fā)表了用crispr/cas9技術將外源egfp蛋白定點敲入斑馬魚基因的內含子中，利用基因組中原本的啟動子驅動了外源egfp綠色熒光蛋白的表達，并且成功地遺傳下去。在其他模式生物中利用該技術也成功地將外源基因敲入基因組中。在現(xiàn)有的crispr/cas9基因定點敲入技術中均存在以下弊端：首先，破壞了生物體基因組本身的結構與功能，雖然敲入的基因可以表達蛋白，但是其插入位點的基因功能被破壞，若此基因在生物體中扮演重要角色，那么將導致致畸或致死的可能；其次，同源性重組進行基因敲入的效率低且不好掌握，有研究表明，基因敲入的非同源性重組比同源性重組的效率高。此外，敲入的外源基因自帶啟動子而非基因組中的啟動子，這使得載體構建復雜，不易操作。技術實現(xiàn)要素：鑒于以上所述現(xiàn)有技術的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種內源性啟動子驅動外源基因表達的方法，用于解決現(xiàn)有技術中crispr/cas9基因定點敲入時易破壞生物體基因組本身的結構和功能等問題。為實現(xiàn)上述目的及其他相關目的，本發(fā)明提供一種內源性啟動子驅動外源基因表達的方法，包括如下步驟：步驟a：選擇內源性基因，確定內源性基因的打靶位點以及打靶序列，合成grna；步驟b：構建外源性基因重組表達載體；步驟c：將cas9cappedrna、步驟a獲得的grna、步驟b獲得的重組表達載體共同注射入動物的受精卵中，使得目的基因整合進入基因組，選育得到內源性啟動子驅動外源性基因表達的動物體。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟b中，所述外源基因選自熒光蛋白基因，但不僅限于該基因，也可以選擇其他的標記基因。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟a中，打靶序列如seqidno.1所示，當然，根據(jù)需要，也可以選擇其他序列作為打靶序列。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟a中，打靶序列的正向引物如seqidno.2所示，反向引物如seqidno.3所示。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟a中，內源性基因選自gfap基因，但不僅限于該基因，也可選擇其他便于觀察的蛋白，將其基因作為本發(fā)明的內源性基因。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟a中，在內源性基因的3’utr區(qū)域選擇打靶位點以及打靶序列。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟a中，將打靶序列反轉錄為grna，將該grna與cas9cappedrna共同注射入動物受精卵中，培育受精卵，通過檢測獲得突變序列，篩選得到打靶位點，備用。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟b中，外源性基因重組表達載體包括打靶位點、前同源臂、融合蛋白t2a、外源基因、打靶位點與外源基因之間的3’utr區(qū)、密碼子置換后的打靶位點、后同源臂。外源性基因重組表達載體各區(qū)段的序列可以根據(jù)實際需要進行設計。在本發(fā)明的一些實施例中，所述打靶位點序列如seqidno.19所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述前同源臂序列如seqidno.20所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述融合蛋白t2a序列如seqidno.21所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述外源基因序列如seqidno.22所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述打靶位點與外源基因之間的3’utr區(qū)序列如seqidno.23所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述密碼子置換后的打靶位點序列如seqidno.24所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述后同源臂序列如seqidno.25所示。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟b中，外源性基因重組表達載體的基因序列如seqidno.12所示。在本發(fā)明的一些實施例中，步驟c中，將cas9cappedrna、步驟a獲得的grna、步驟b獲得的重組表達載體共同注射入動物的受精卵后，培育得到由內源性啟動子驅動外源性插入熒光蛋白表達的嵌合體f0代，將嵌合體f0代與野生型動物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體f1代，將f1代發(fā)熒光的個體與野生型動物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體f2代，將f2代雌性個體與雄性個體自交，篩選得到發(fā)熒光的純合體f3代。在本發(fā)明的一些實施例中，所述動物選自魚、鼠、兔等中的任一種。在本發(fā)明的一些實施例中，所述動物選自斑馬魚。本發(fā)明第二方面提供一種外源性基因重組表達載體，包括打靶位點、前同源臂、融合蛋白t2a、外源基因、打靶位點與外源基因之間的3’utr區(qū)、密碼子置換后的打靶位點、后同源臂。在本發(fā)明的一些實施例中，所述打靶位點序列如seqidno.19所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述前同源臂序列如seqidno.20所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述融合蛋白t2a序列如seqidno.21所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述外源基因序列如seqidno.22所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述打靶位點與外源基因之間的3’utr區(qū)序列如seqidno.23所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述密碼子置換后的打靶位點序列如seqidno.24所示。在本發(fā)明的一些實施例中，所述后同源臂序列如seqidno.25所示。在本發(fā)明的一些實施例中，外源性基因重組表達載體的基因序列如seqidno.12所示。本發(fā)明第三方面提供上述外源性基因重組表達載體在培養(yǎng)轉基因動物體中的用途。如上所述，本發(fā)明的一種內源性啟動子驅動外源基因表達的方法，具有以下有益效果：本發(fā)明不破壞基因原有的功能，運用微同源技術將外源基因進行同源重組，明顯提高重組效率；并且，由內源性啟動子驅動外源基因的表達，有助于外源基因與內源靶基因等量表達，利用外源基因真實地重現(xiàn)內源靶基因的表達模式，同時有效避免復雜性啟動子的擴增。附圖說明圖1顯示為本發(fā)明實施例中構建入的重組載體中的gfap-mcherry-3’utr片段的結構圖；圖2顯示為打靶位點經(jīng)t7e1檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖,兩個白色尖頭表示被t7e1酶切開的片段大小；圖3-a顯示為將重組表達載體與grna、cas9cappedrna共同注射入待處理魚種的單細胞期受精卵中所得的f0，將其剪尾提取基因組dna進行前面接頭檢測的測序結果；圖3-b顯示為將重組表達載體與grna、cas9cappedrna共同注射入待處理魚種的單細胞期受精卵中所得的f0，將其剪尾提取基因組dna進行后面接頭檢測的測序結果；圖4-a和圖4-b顯示為f0所產卵的熒光顯微鏡拍攝結果；圖5顯示為f0所產的魚卵進行real-timepcr結果，p>0.05，無顯著性差異。具體實施方式以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所介紹的方法輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。以下實施例以斑馬魚進行實驗，需要說明的是，本發(fā)明也適用于鼠、兔等其他動物，也可適用于其他魚類。一、打靶位點的選擇以下實施例中選擇的基因為斑馬魚膠質纖維酸性蛋白gfap，其主要表達于斑馬魚中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質細胞，這種基因在斑馬魚全身普遍存在，便于觀察。為了不破壞基因的原有結構與功能，將打靶位點選擇在該基因的3’utr區(qū)域內。根據(jù)crispr/cas9的編輯特點，其位點一般為緊鄰ngg特征序列之前的20bp序列，因此，在3’utr區(qū)域內確認打靶序列。二、質粒構建相關元件的選擇以下實施例中實現(xiàn)轉基因的技術包括crispr/cas9基因編輯技術、密碼子置換與同源重組技術。以下實施例中，是將紅色熒光蛋白加入重組質粒中，從而將載體插入待處理模式生物中，例如斑馬魚的基因組中，實現(xiàn)穩(wěn)定表達。此外，在紅色熒光蛋白之前加上融合蛋白，使之能與基因組中的基因融合，將基因本身的終止密碼子放到紅色熒光蛋白之后，終止表達進程。三、基因整合的方法與鑒定把構建好的重組載體與cas9cappedrna以及grna通過顯微注射同時注射到待處理斑馬魚的受精卵中，等待這些受精卵發(fā)育成幼魚。魚體透明，目的序列整合到魚的基因組之后，魚的特定位置會顯示出特定熒光。將這些魚收集并培育養(yǎng)大，得到由內源性gfap啟動子驅動表達特定熒光的斑馬魚(更具體地，此時得到的是嵌合體f0)。四、獲得穩(wěn)定表達的子代選擇生殖細胞中表達熒光的嵌合體f0并與野生型進行雜交，后代中如果仍然有熒光的個體，屬于雜合體f1。將這些發(fā)熒光的雜合體f1的單個個體與野生型再次進行雜交，它們的后代仍然有熒光的是雜合體f2，由于雜合體f2來自同一個父母(雜合體f1和野生型)，因此，插入的熒光片段在基因組中的位置是一樣的。將雜合體中的雌魚和雄魚進行雜交，在雜交得到的后代中，有1/4的概率得到內源性啟動子驅動特定熒光蛋白表達的斑馬魚純合體f3，由于純合體帶有兩倍于雜合體的基因，因此，熒光強度強于后者，可以通過熒光強度的方法進行區(qū)分。為了進一步驗證以下實施例沒有破壞基因組中基因的功能，將候選的熒光魚剪去部分組織，通過realtime-pcr技術進行鑒定。實施例1gfap啟動子驅動紅色熒光蛋白mcherry的表達步驟1：構建打靶序列的grna序列首先，在ncbi(美國國家生物技術信息中心)的網(wǎng)站上查到斑馬魚的gfap基因的基因組序列。找到3’utr區(qū)域，鎖定的打靶序列為agctagtggtcagagcaggt(seqidno.1)。然后，為構建打靶序列grna，合成以下引物：grna-f:taatacgactcactataggagctagtggtcagagcaggtgttttagagctagaaatagc(seqidno.2)；grna-r:agcaccgactcggtgccac(seqidno.3)。以帶有grna骨架的質粒(中國科學院重慶綠色智能技術研究院環(huán)境與健康研究中心實驗室已有質粒)為模板，以終濃度為10μm的grna-f和grna-r為引物擴增grna的dna序列。配方如表1所示：表1pcr程序設計：第一步：95℃2min；第二步：95℃20s；第三步：55℃20s；第四步：72℃10s；第五步：返回到第二步，循環(huán)35次；第六步：72℃10min；反應結束。將pcr所得產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，在1％的瓊脂糖凝膠電泳上加入10％的加樣緩沖液，混勻后，加入瓊脂糖凝膠的樣孔中，150v電壓15min電泳。切膠回收步驟(天根試劑盒)：在紫外的照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，將目的條帶(100bp)切下(割膠盡可能的小，提高后續(xù)回收效率)，向膠塊中加入等體積的pn溶液(如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlpn溶液)，50℃水浴放置，期間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。柱平衡步驟：向吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將上一步所得溶液加入一個吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液pw，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。12000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液，將吸附柱ca2置于室溫下放置數(shù)分鐘，徹底地晾干吸附柱，再將ca2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20μlddh2o，室溫放置2min。12000rpm離心2min，收集dna溶液。步驟2：體外轉錄及rna回收將切膠純化的產物轉錄成rna，用mmessagemmachinekit(ambion公司)進行體外轉錄，配方如表2所示：表2組分用量dna模板600ng10×transcriptionbuffer2μl10mmntpmix1μl酶混合液1μl無核酸酶水補足至20μl將上述混合液放入pcr儀中，37℃、3h進行轉錄。向rna產物中加入dnasei酶，去除dna影響，pcr儀中37℃反應15min。rna的純化(天根試劑盒)：在rna樣品中加入rnase-free水，補足至100μl，加入350μl溶液rk，充分混勻。加入250μl無水乙醇，充分混勻，立即進行下一步。將上一步所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱cr2中，12000rpm離心30sec，棄掉收集管中的廢液。向吸附柱cr2中加入500μl已加入乙醇的漂洗液rw，室溫放置2min后，12000rpm離心30sec，棄廢液，將cr2放入收集管中。12000rpm離心5min，去除殘余液體。將吸附柱cr2轉入一個新離心管中，加14μlrnase-free水，室溫放置2min后，12000rpm離心2min，得到grna，置于-80℃下保存。步驟3：cas9的體外轉錄和rna回收體外轉錄：cas9-dna序列如seqidno.17所示，將cas9-pxt表達載體線性化處理，具體地，取800ngcas9-pxt7質粒(購自國家斑馬魚資源中心)，加入xbai內切酶1μl、10x緩沖液2μl，加入ddh20補足至20μl，配成20μl的酶切體系，放在37℃的水浴鍋內酶切2小時。將反應產物通過膠回收試劑盒(購自北京全式金生物技術有限公司，以下簡稱全式金公司)的柱子回收dna。首先，混合3倍體積的gsb溶液，加入膠回收柱子，靜置1分鐘。12,000rpm離心1min。加入500μl漂洗液，12000rpm離心1min。加入45μl水洗脫，12,000rpm離心1min，得到線性化產物。用mmessagemmachinekit(購自ambion公司)進行體外轉錄?；旌弦号浞饺绫?所示配方：表3組分用量2×ntp/cap10μl10×t7reactionbuffer2μl線性模板dna1μg酶混合液2μl無核酸酶水補足至20μl將上述混合液放入pcr儀中進行轉錄，條件為37℃、3h。將rna產物加入dnasei酶，去除dna影響，pcr儀中37℃反應15min。rna的純化(天根試劑盒)：在rna樣品中加入rnase-free水補足至100μl，加入350μl溶液rk，充分混勻。加入250μl無水乙醇，充分混勻，立即進行下一步。將上一步所得溶液和沉淀一起轉入吸附柱cr2中，12,000rpm離心30sec，棄掉收集管中的廢液。向吸附柱cr2中加入500μl已加入乙醇的漂洗液rw，室溫放置2min后，12,000rpm離心30sec，棄廢液，將cr2放入收集管中，12,000rpm離心5min，去除殘余液體。將吸附柱cr2轉入一個新離心管中，加14μlrnase-free水，室溫放置2min后，12,000rpm離心2min，得到cas9cappedrna，置于-80℃保存。將前述步驟得到的grna與cas9cappedrna共同注射入斑馬魚單細胞期受精卵中；24小時之后收集30顆魚卵，提取基因dna，將30顆魚卵放入1.5ml離心管中研磨(越細越好)，加100μl裂解液、1μl蛋白酶k，50℃保溫1小時，直到組織完全解體，加150μl氯仿，混勻，10000rpm離心4分鐘。取上清液于新離心管，用等體積異戊醇抽提。待dna沉淀形成白色絮狀物后，10000rpm離心4分鐘，棄去上清，加入70％乙醇，10000rpm離心2分鐘，棄去上清，晾干沉淀，加20μlddh2o，-20℃保存或直接進行pcr擴增，擴增條帶應包含打靶位點，將pcr產物加入t7e1酶(北京唯尚立德生物科技有限公司)進行t7e1檢測，能被該酶切開的序列即為突變序列，篩選出能把被酶切開的靶位點作為打靶位點備用。步驟4：構建重組載體(1)插入片段的擴增與獲取以帶有2a-mcherry序列的質粒(購自takara生物技術公司)為模板，用以下引物pcr擴增插入片段2a-mcherry：2a-mcherry-gfap-f：agctagtggtcagagcaggtgggggcagtggagagggcagaggaagtc(seqidno.4)2a-mcherry-gfap-r：caagccagtgtctgagcctcacttgtacagctcgtccatgccgccg(seqidno.5)其中，2a-mcherry-gfap-f中下劃單直線標記的為打靶序列與識別位點的組合序列，前20個堿基為打靶序列，最后3個堿基為識別位點，以便cas9蛋白能將插入序列從載體上剪切下來，下劃雙波浪線標記的是與基因組中gfap基因同源的一段同源臂序列，無下劃線的序列是融合蛋白t2a的一段序列。其中，2a-mcherry-gfap-r中下劃單直線標記的為基因組中gfap基因3’utr區(qū)域的一段序列，下劃雙波浪線標記的是終止密碼子，無下劃線的序列為mcherry的一段序列。2a-mcherry的序列如seqidno.13所示。配方如表4所示。表4組分用量primestarmaxpremix(2×)12.5μl2a-mcherry-gfap-f1μl2a-mcherry-gfap-r1μl模板1μlddh2o9.5μl總計25μlpcr程序設計：第一步：98℃5min；第二步：98℃10s；第三步：62℃5s；第四步：72℃、1min；第五步：返回到第二步，循環(huán)35次；第六步：72℃、10min；反應結束。其中，pcr模板來源于人工合成的帶有2a-mcherry的質粒。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀釋為10μl的工作濃度。primestarmaxpremix(2×)購自于takara生物公司?？偟膒cr體積為25μl。反應結束后，pcr管內產物放在4℃冰箱保存或直接進行下一步。電泳：取pcr產物，加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，條帶應在800bp左右。(2)打靶位點與插入片段之間3’utr序列的擴增與獲取pcr擴增目的片段：用以下引物pcr擴增目的片段3’utr-gfap-f:cggcggcatggacgagctgtacaagtgaggctcagacactggcttg(seqidno.6)3’utr-gfap-r:cccacctgctctgaccactagctcacatcttgtcctactgttta(seqidno.7)其中，3’utr-gfap-f中下劃單直線標記的堿基是mcherry的一段序列，下劃雙波浪線標記的是終止密碼子，無下劃線的是3’utr區(qū)域的一段序列。其中，3’utr-gfap-r中下劃單直線標記的堿基為打靶序列，最前端的ccc為識別位點，以便cas9蛋白能將插入序列從載體上剪切下來，下劃雙波浪線標記的堿基是與打靶位點之后基因組中gfap基因3’utr區(qū)域同源的一段同源臂序列，下劃雙直線標記的堿基是經(jīng)過密碼子置換后的打靶序列，無下劃線的是3’utr區(qū)域打靶位點前與插入片段之間的一段序列。配方如表5所示。表5組分用量primestarmaxpremix(2×)12.5μl2a-mcherry-gfap-f1μl2a-mcherry-gfap-r1μl模板1μlddh2o9.5μl總計25μlpcr程序設計：第一步：98℃5min；第二步：98℃10s；第三步：60℃5s；第四步：72℃1min；第五步：返回到第二步，循環(huán)35次；第六步：72℃10min；反應結束。其中，pcr模板來源于斑馬魚的基因組。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀釋為10μl的工作濃度。primestarmaxpremix(2×)購自takara生物公司。總的pcr體積為50μl。反應結束后，pcr管內產物放在4℃冰箱保存或直接進行下一步。電泳：向pcr產物中加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)，混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，條帶應在400bp左右。(3)2a-mcherry-3’utr的合成重組pcr:將步驟(1)和(2)所得的dna片段用以下引物進行重組，得到2a-mcherry-3’utr重組片段：2a-mcherry-gfap-f:agctagtggtcagagcaggtgggggcagtggagagggcagaggaagtc(seqidno.4)3’utr-gfap-r:cccacctgctctgaccactagctcacatcttgtcctactgttta(seqidno.7)其中，步驟(1)、(2)中的引物2a-mcherry-gfap-r與3’utr-gfap-f是互補序列，以便于進行重組pcr。2a-mcherry-3’utr序列如seqidno.14。配方如表6和表7所示。表6組分用量primestarmaxpremix(2×)12.5μl模板(1)1μl模板(2)1μlddh2o8.5μl總計23μl表7組分用量2a-mcherry-gfap-f1μl3’utr-gfap-r1μl總計2μlpcr程序設計：第一步：98℃5min；第二步：98℃10s；第三步：62℃5s；第四步：72℃1min；第五步：返回到第二步，循環(huán)6次；六個循環(huán)之后暫停pcr儀，將表4引物混合后加入pcr儀中繼續(xù)以下反應。第一步：98℃5min；第二步：98℃10s；第三步：62℃5s；第四步：72℃2min；第五步：返回到第二步，循環(huán)30次；第六步：72℃10min；反應結束。其中，pcr模板來源于步驟(1)和(2)的pcr產物，將產物稀釋100倍。正向和反向引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，其被稀釋為10μl的工作濃度。primestarmaxpremix(2×)購自takara生物公司?？偟膒cr體積為25μl。反應結束后，pcr管內產物放在4℃冰箱保存或直接進行下一步。電泳并回收pcr產物：取pcr產物，加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，條帶應在1200bp左右，切下目的片段的瓊脂糖膠。用購自天根生化科技(北京)有限公司的膠回收試劑盒進行膠回收，步驟如下：向膠塊中加入等體積的溶液pn(如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlpn溶液)，50℃水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。柱平衡步驟：向吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)加入500μl平衡液bl，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將上一步所得溶液加入一個吸附柱ca2中(吸附柱放入收集管中)，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。12,000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液,將吸附柱ca2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干將吸附柱，將ca2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20μlddh2o，室溫放置2min。12,000rpm離心2min收集dna溶液。(4)連接將1μl的peasy⑩-blunt3cloningvector(購自全式金公司)、2μlpcr產物、2μlh2o混合，形成5μl的連接體系，混勻后，22℃恒溫保持10min。(5)轉化涂板，鑒定陽性克隆連接產物轉化和涂板：將連接產物加入感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產物)，冰浴30min，加入到42℃水浴鍋中30s，立即至于冰上2min，加入800μllb培養(yǎng)基，37℃搖床內復蘇1h后取出，6000rpm離心3min，棄去500μl上清，將余下部分混勻后涂板，涂在amp+抗性的平板上，待液體完全干為止，平板放在37℃培養(yǎng)箱中過夜。鑒定陽性克?。捍溟L出來后，用10μl的白槍頭挑單菌落，在10μl超純水中混勻，取1μl做pcr模板，加入2a-mcherry-gfap-f和3’utr-gfap-r兩種引物，62℃進行pcr反應35個循環(huán)。取pcr產物，加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，在1200bp左右有條帶的菌落為陽性菌落。加入5ml帶有5μlamp+的培養(yǎng)基搖菌，37℃過夜后提質粒。提質粒的步驟如下(采用天根試劑盒)：向吸附柱cp3中加入500μl的平衡液bl，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清，向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液p1，用渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。向離心管中加入250μl溶液p2，溫和地上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。向離心管中加入350μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min。將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱cp3中，12,000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cp3放入收集管中，向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp3放入收集管中12,000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱cp3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸將吸附柱cp3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加35μlddh2o，靜置2min，12,000rpm離心2min，將質粒溶液收集到離心管中。用m13-f作為測序引物，進行測序，比對序列，與預期結果一致的序列即為構建成功的重組載體，完整的重組載體(即外源性插入熒光蛋白重組表達載體)序列如seqidno.12所示。m13-f引物序列：gtaaaacgacggccagt(seqidno.18)。步驟5：顯微注射受精卵收卵：在喂完斑馬魚晚間食物并等待30分鐘后，在配魚的專用魚缸中加入雌雄比為2:1、放置數(shù)量不多于八條的斑馬魚，用隔板將雌雄分開，放入三分之二的養(yǎng)魚水。第二天早晨抽去隔板，雄魚開始追逐雌魚，一般在15分鐘后雌魚開始排卵，雄魚將精子排入水中使卵受精，收集卵到平板培養(yǎng)皿中，去除死卵和雜物，用養(yǎng)魚水洗滌幾次，等待注射。注射：制備注射皿，30ml的2％瓊脂糖加熱融化，倒入直徑10cm的玻璃皿中，將模具輕輕覆蓋于腳面，待膠凝固后，移走模具。加入少量養(yǎng)魚水，保持界面濕潤。準備注射針，將外徑為1.02mm、內徑為0.58mm的玻璃毛細管用拉針儀拉成針形。受精卵排出后，再過約10分鐘，卵膜膨脹，隨后數(shù)分鐘內細胞形態(tài)變得規(guī)整，此時可以開始注射。用無齒鑷在體視鏡最高倍放大率下將針頭折斷少許，盡量斷成斜切面。用微量上樣吸頭吸取1-5μl胚胎纖維注射液從針尾穿入注射針上樣，隨后將注射針插入持針器中固定。將胚胎清洗后，放入注射模具中，排列成行，吸去多余的液體，使液面剛剛沒過魚卵。注射時，注射針從胚胎動物極插入到細胞質中和從卵黃中穿過，抵達胞質中。將cas9-pxt7載體轉錄出的cas9cappedrna(稀釋至300ng/μl)、grna(20ng/μl)和重組2a-mcherry-3’utr載體(30ng/μl)共同打入斑馬魚的單細胞期受精卵中。每枚卵注射cas9cappedrna量為25pg、grna量為25pg、2a-mcherry-3’utr載體量為25pg的混合物。用針尖撥動注射凹槽中的胚胎使細胞質方向與針尖方向一致或者相對，與水平面約成45度下針，扎入到位后踩動踏板注射，略保持后迅速退針，整個過程注意手不要抖動。注射結束后，將胚胎移至盛有養(yǎng)魚水的10cm培養(yǎng)皿中，再轉移到28.5℃的環(huán)境中培養(yǎng)，等待孵化。這段時間需要定期檢測，去除死胚和脫下的卵膜，并更換養(yǎng)魚水。大約到4-5天時，胚胎可以進食草履蟲，此時應轉移至小魚喂養(yǎng)盒中。幼魚12天起可以開始用草履蟲和鹵水混合喂養(yǎng)，注意及時清理魚缸，保持水質良好。待幼魚全部吃鹵水時(此時幼魚的腹部呈紅色)，可轉入魚房喂養(yǎng)。步驟6：嵌合體f0代的篩選與鑒定1、熒光篩選熒光蛋白在注射48h后出現(xiàn)表達，在熒光顯微鏡下觀察幼魚，挑出表達紅色熒光蛋白的幼魚，將幼魚放在10cm的皿中，再次檢查是否都有熒光，將沒有熒光的幼魚丟棄，剩下的就是嵌合體f0。2、分子生物學驗證(1)熒光鑒定后還可以用分子生物學進行驗證，用pcr分子生物學手段，證實2a-mcherry-3’utr序列是否精確無誤的插入基因中gfap基因的3’utr區(qū)域內。在顯微鏡下挑出有熒光的幼魚10條左右，提取基因組后進行pcr，檢測前面接頭處與后面接頭處，引物設計如下：gfap-qian-f:ttaggatcccacacaactcaaa(seqidno.8)gfap-qian-r:gccagtgtctgagcctcatt(seqidno.9)gfap-hou-f:accggcggctggacgagctgta(seqidno.10)gfap-hou-r:tcaaatagcaccgctgacca(seqidno.11)配方如表8所示。表8pcr程序設計：第一步：94℃3min；第二步：94℃5s；第三步：60℃15s；第四步：72℃10s；第五步：返回到第二步，循環(huán)35次；第六步：72℃10min；反應結束。其中，pcr模板來源于斑馬魚的基因組。正向和反向引物由金唯智生物公司合成，其被稀釋為10μl的工作濃度。taqdnapolymerasekit購自于全式金生物公司?？偟膒cr體積為20μl。反應結束后，pcr管內產物放在4℃冰箱保存或直接進行下一步。電泳：取pcr產物，加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，測定前接頭的產物條帶應在1200bp左右，測定后接頭的產物條帶應在650bp左右。切下目的片段的瓊脂糖膠。用購自天根公司的膠回收試劑盒進行膠回收，步驟如下：向膠塊中加入等體積的溶液pn，50℃水浴放置，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充分溶解。向吸附柱ca2中加入500μl平衡液bl，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。將上一步所得溶液加入一個吸附柱ca2中，室溫放置2min，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。向吸附柱ca2中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱ca2放入收集管中。12,000rpm離心2min，盡量除盡漂洗液，將吸附柱ca2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底地晾干將吸附柱，將ca2放到一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20μlddh2o，室溫放置2min。12,000rpm離心2min收集dna溶液。(2)連接將0.5μlpmd19-tvector(購自takara生物公司)、2μlsolutioni、2μlpcr產物、0.5μlh2o混合，形成在5μl的連接體系，混勻后，16℃恒溫30min。(3)轉化涂板，鑒定陽性克隆連接產物轉化和涂板：將連接產物加入感受態(tài)細胞中(在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產物)，冰浴30min，加入到42℃水浴鍋中45s，立即置于冰上2min，加入800μl的lb培養(yǎng)基，37℃搖床內復蘇1h后取出，6000rpm離心3min，棄去500μl上清，將余下部分混勻后涂板，涂在amp+抗性的平板上，待液體完全干為止，平板放在37℃培養(yǎng)箱中過夜。鑒定陽性克?。捍溟L出來后，用10μl的白槍頭挑單菌落，在10μl超純水中混勻，分別取前街頭的pcr產物和后接頭的pcr產物1μl做模板，各加入對應的上游引物和下游引物，62℃進行pcr反應35個循環(huán)。取pcr產物，加入10％的加樣緩沖液(loadingbuffer)混勻，加入配好的1％的瓊脂糖凝膠的樣槽中，150v恒壓15min電泳。把瓊脂糖凝膠放在紫外照射下，對比參照梯狀條帶(ladder)，測定前接頭的產物條帶應在1200bp左右，測定后接頭的產物條帶應在650bp左右，為陽性菌落。分別加入5ml帶5μlamp+的培養(yǎng)基搖菌，37℃過夜后提質粒。提質粒的步驟如下(采用天根試劑盒)：向吸附柱cp3中加入500μl的平衡液bl，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。取5ml過夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12,000rpm離心1min，盡量吸除上清，向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液p1，用渦旋振蕩器徹底懸浮細菌沉淀。向離心管中加入250μl溶液p2，溫和地上下翻轉6-8次，使菌體充分裂解。向離心管中加入350μl溶液p3，立即溫和地上下翻轉6-8次，充分混勻，此時將出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10min。將上一步收集的上清液用移液器轉移到吸附柱cp3中，12,000rpm離心1min，倒掉廢液，將吸附柱cp3放入收集管中，向吸附柱cp3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cp3放入收集管中12,000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。將吸附柱cp3開蓋，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸將吸附柱cp3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加35μlddh2o，靜置2min，12,000rpm離心2min將質粒溶液收集到離心管中。(4)用m13-f作為測序引物，進行測序，比對序列，與預期結果一致的序列即為插入片段被精確插入到基因組的序列。圖3-a顯示為前面接頭檢測的測序結果，具體序列如seqidno.15所示；圖3-b顯示為后面接頭檢測的測序結果，具體序列如seqidno.16所示。3、realtime-pcr檢測原有gfap表達量變化選取已剪尾鑒定的將重組片段精準插入基因組的可遺傳f0代斑馬魚，用f0與野生型斑馬魚產卵，提取3組斑馬魚卵基因組dna，每組30顆，并且以相同的組分顆數(shù)的野生型魚卵作對照，通過實時定量pcr(realtime-pcr)來檢測gfap表達量變化。根據(jù)圖5結果可見，gfap的表達量并未受到插入熒光蛋白基因的影響。步驟7：純合子的獲得和鑒定(1)純合子的獲得由于嵌合體不是穩(wěn)定表達的，因此需要進一步獲得可以穩(wěn)定表達的后代。取步驟6培育得到由內源性啟動子驅動表達外源性插入熒光蛋白的嵌合體f0代，將嵌合體f0代與野生型動物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體f1代，f1代熒光魚是熒光基因已經(jīng)整合在基因組當中的個體，將f1代發(fā)熒光的個體與野生型動物體雜交，篩選得到發(fā)熒光的雜合體f2代，將f2代雌性個體與雄性個體自交，有1/4概率得到純合體f3，從中篩選得到發(fā)熒光的純合體f3代。(2)純合體的鑒定首先通過熒光鑒定，在熒光鏡下通過觀察熒光強度的辦法來簡單區(qū)分開，純合體帶有兩倍于雜合體的基因，因此獲得的純合體熒光亮度高于嵌合體。純合體熒光魚在激發(fā)光刺激下所發(fā)熒光特點見圖4-a和圖4-b。綜上所述，本發(fā)明為了在一定程度上克服現(xiàn)有技術的缺點，將打靶位點選在3’utr區(qū)，不僅能夠標記基因的表達部位，而且最大程度地不破壞基因原有功能，且運用了微同源技術將外源基因進行同源重組，明顯提高重組效率；并且，由內源性啟動子驅動外源基因的表達，有助于外源基因與內源靶基因等量表達，利用外源基因真實地重現(xiàn)內源靶基因的表達模式，同時有效避免復雜性啟動子的擴增。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術領域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發(fā)明的權利要求所涵蓋。sequencelisting<110>中國科學院重慶綠色智能技術研究院<120>一種內源性啟動子驅動外源基因表達的方法<130>171968<160>25<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>打靶序列<400>1agctagtggtcagagcaggt20<210>2<211>59<212>dna<213>artificial<220><223>grna-f<400>2taatacgactcactataggagctagtggtcagagcaggtgttttagagctagaaatagc59<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>grna-r<400>3agcaccgactcggtgccac19<210>4<211>73<212>dna<213>artificial<220><223>2a-mcherry-gfap-f<400>4agctagtggtcagagcaggtgggcactacggagaggaaggatctgccaggcagtggagag60ggcagaggaagtc73<210>5<211>49<212>dna<213>artificial<220><223>2a-mcherry-gfap-r<400>5caagccagtgtctgagcctcattacttgtacagctcgtccatgccgccg49<210>6<211>49<212>dna<213>artificial<220><223>3'utr-gfap-f<400>6cggcggcatggacgagctgtacaagtaatgaggctcagacactggcttg49<210>7<211>92<212>dna<213>artificial<220><223>3'utr-gfap-r<400>7cccacctgctctgaccactagctccaaaaaaaaaaaaaacactatatttccctccggccc60ttacaaccagctacatcttgtcctactgttta92<210>8<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>gfap-qian-f<400>8ttaggatcccacacaactcaaa22<210>9<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>gfap-qian-r<400>9gccagtgtctgagcctcatt20<210>10<211>22<212>dna<213>artificial<220><223>gfap-hou-f<400>10accggcggctggacgagctgta22<210>11<211>20<212>dna<213>artificial<220><223>gfap-hou-r<400>11tcaaatagcaccgctgacca20<210>12<211>4251<212>dna<213>artificial<220><223>外源性基因重組表達載體<400>12gggcgaattgggcccgacgtcgcatgctcccggccgccatggcggccgcgggaattcgat60tggatcgcccttgagctagtggtcagagcaggtgggcactacggagaggaaggatctgcc120aggcagtggagagggcagaggaagtctgctaacatgcggtgacgtcgaggagaatcctgg180cccaatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgctt240caaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcga300gggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccct360gcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaa420gcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtggga480gcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgca540ggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccc600cgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgagga660cggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacga720cgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaa780cgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagta840cgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaatgagg900ctcagacactggcttggctgcagaagaagatctccttcactaatgcttcaggaagctgtg960tttgtcaaaccttgtattttctcaccaactttccctgcttctctcctggtatatatagtt1020catggaaactgtattcactgtttttagcaactacctatatgttttgatctccttttcttc1080ctgggcttctctttttatctgtctgtttcttctgtggcagagtctttgcaagatagtaga1140ctagtttatcgcagaatgtgctataaaaagtcatggttggacagatgaaagtaaacagta1200ggacaagatgtagctggttgtaagggccggagggaaatatagtgttttttttttttttgg1260agctagtggtcagagcaggtgggaagggcgatcccaatcactagtgaattcgcggccgcc1320tgcaggtcgaccatatgggagagctcccaacgcgttggatgcatagcttgagtattctat1380agtgtcacctaaatagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgtt1440atccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtg1500cctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgg1560gaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc1620gtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgc1680ggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggata1740acgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccg1800cgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgct1860caagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaa1920gctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttc1980tcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgt2040aggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcg2100ccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactgg2160cagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttct2220tgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgc2280tgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccg2340ctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctc2400aagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgtt2460aagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaa2520aatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaat2580gcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcct2640gactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctg2700caatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccag2760ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctatta2820attgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttg2880ccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccg2940gttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagct3000ccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggtta3060tggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactg3120gtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcc3180cggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattg3240gaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcga3300tgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctg3360ggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaag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