專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基因載體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用的材料，尤其是一種基因載體材料的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療為人類(lèi)許多重要的疾病如遺傳疾病、腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病提供了廣闊的治療前景?；蛑委熓菍⑼庠茨康幕蛲ㄟ^(guò)載體或其它途徑導(dǎo)入體內(nèi)并在靶組織和靶細(xì)胞中顯示出相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)而達(dá)到治療疾病的一種手段，而具備有效性和安全性的治療載體仍是努力攻克的課題。
有效性(1)所介導(dǎo)的目的基因能夠高效地進(jìn)入所期望的靶細(xì)胞；(2)不被血漿或組織細(xì)胞中各種補(bǔ)體以及各種酶所破壞；(3)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因能夠透過(guò)核膜，進(jìn)入細(xì)胞核，并整合到染色體DNA中，從而獲得轉(zhuǎn)基因的高效、穩(wěn)定表達(dá)而發(fā)揮治療作用。
安全性(1)用于基因轉(zhuǎn)移的載體不會(huì)引起宿主嚴(yán)重的免疫反應(yīng)；(2)不會(huì)導(dǎo)致生殖細(xì)胞的感染；(3)不會(huì)導(dǎo)致插入位點(diǎn)的基因失活與基因突變等。
為了克服病毒載體的缺陷，一系列的非病毒型載體正被人們認(rèn)識(shí)和利用。如陽(yáng)離子脂質(zhì)體(lipofectin)、多聚賴(lài)氨酸(ploy-L-lysine)、聚乙烯亞胺(PEI)、樹(shù)枝狀高聚物(dendrimers)。表現(xiàn)出低毒、低免疫、大容量、易操作、易制備、易修飾等多種潛在的優(yōu)越性，使設(shè)計(jì)和研制新的更理想的基因治療載體成為可能。非病毒載體目前還面臨著許多挑戰(zhàn)，如脂質(zhì)體雖在某些細(xì)胞水平上基因轉(zhuǎn)染效率較高，但在體內(nèi)即使注入腫瘤，其效率仍然不高，而且無(wú)靶向性。因此建立一種非病毒、無(wú)免疫原性、具有靶向性的高效安全的基因體內(nèi)靶向轉(zhuǎn)移載體，已是基因治療的當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種羥基磷灰石作為基因載體，它的結(jié)構(gòu)與骨和牙齒相似，是具有良好生物相容性的生物陶瓷材料，在基因治療中是具備有效性和安全性的治療載體。
本發(fā)明的技術(shù)方案包括羥基磷灰石納米顆粒的制備、羥基磷灰石納米顆?；鞈乙褐苽浼凹毙远拘栽囼?yàn)、羥基磷灰石納米顆粒與DNA結(jié)合及納米顆粒-DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染，具體制備過(guò)程如下(1)羥基磷灰石納米顆粒制備將分析純Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分別溶于去離子水中，配成1mol/L的溶液，將Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以體積比5∶3的比例在1500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下混合，并用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值在11～12范圍，攪拌10小時(shí)后，老化24小時(shí)；再將得到的沉淀物放入高壓釜中，在200℃、200mv、200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下處理4小時(shí)，再經(jīng)清洗、過(guò)濾、干燥得到羥基磷灰石納米顆粒；(2)羥基磷灰石納米顆?；鞈乙褐苽浼凹毙远拘栽囼?yàn)取羥基磷灰石納米顆粒0.5g，放入離心管，加去離子水20ml，用超聲波分散制備羥基磷灰石混懸液，并加入分散劑，使混懸液充分分散和穩(wěn)定。用濃度梯度分別為4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙何察o脈注射小白鼠，連續(xù)兩周觀察動(dòng)物的死亡及毒性反應(yīng)；(3)羥基磷灰石納米顆粒生物相容性實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板；加入不同濃度的納米顆?；鞈乙?，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT測(cè)定。比色法確定有活力的細(xì)胞數(shù)，方差分析方法采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。
(4)羥基磷灰石納米顆粒與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)取瓊脂糖粉制凝膠羥基磷灰石納米顆?；鞈乙合♂尲覲EGFP-N1混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，靜置30min，離心；以PEGFP-N11μg為對(duì)照，取上清液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。羥基磷灰石納米顆?；鞈乙翰⑵湔{(diào)至不同的pH值，將其分別放入eppendorf管與PEGFP-N1混合，混均，室溫靜置30min，離心；取上清液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(5)納米顆粒-DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞按接種于培養(yǎng)皿加入配有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)皿加入納米顆粒DNA復(fù)合體；以單純PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA以及與脂質(zhì)體結(jié)合的PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA作為對(duì)照?；旌吓囵B(yǎng)分別于24，48，72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；羥基磷灰石納米顆粒制備方法中，原料還可用CaCI2和H3PO4為原料，可用HNO3和NH4NO3來(lái)調(diào)節(jié)溶液pH值。
羥基磷灰石納米顆粒除了可與PEGFP-N1基因結(jié)合作為基因載體外，還可攜帶抗腫瘤和抗病毒基因進(jìn)行抗腫瘤和抗病毒治療；可制成實(shí)驗(yàn)室常用的基因轉(zhuǎn)染試制；與保濕因子等基因結(jié)合可制成護(hù)膚產(chǎn)品，與生長(zhǎng)因子結(jié)合可用于治療燒傷。
本發(fā)明制備的結(jié)構(gòu)與骨和牙齒相似，具有良好生物相容性的生物陶瓷材料——羥基磷灰石基因載體，克服了其它載體材料因生物相容性差等原因引起缺陷。納米級(jí)羥基磷灰石可根據(jù)應(yīng)用的要求制備成所需要的幾何形態(tài)、三維結(jié)構(gòu)、密度、孔口徑、機(jī)械強(qiáng)度和純度，具有小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)等特點(diǎn)；顆粒具有大的表面能，增強(qiáng)其攜帶DNA的能力，解決了基因載體轉(zhuǎn)導(dǎo)率低、藥物易從脂質(zhì)體中滲漏和難制備等問(wèn)題。通過(guò)對(duì)納米級(jí)羥基磷灰石顆粒進(jìn)行表面改性，保證了其在使用過(guò)程中的分散穩(wěn)定性，滿足了基因治病的有效性和安全性。
本發(fā)明工藝簡(jiǎn)單，原料來(lái)源廣泛，所制備的羥基磷灰石納米顆粒具有良好的生物相容性，無(wú)急性毒性作用，能與PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA完全結(jié)合，對(duì)DNA有保護(hù)作用并能將DNA運(yùn)送到器官或組織并表達(dá)，最大轉(zhuǎn)染效率約為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的效率的80％。


圖1 本發(fā)明的工藝流程圖；圖2 HA納米顆粒透射照片；圖3 HA納米顆粒與SGC-7901細(xì)胞混合培養(yǎng)-良好的生物相容性；圖4 HA納米顆粒與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)電泳分析顯示DNA被納米顆粒吸收；圖5 HA納米顆粒與PEGFP-N1結(jié)合后轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞(100x視野)；圖6 羥基磷灰石納米顆粒作為基因轉(zhuǎn)染載體將PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染入細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)；圖7 羥基磷灰石納米顆粒-DNA復(fù)合體尾靜脈注射小白鼠后，腦組織切片綠色熒光蛋白表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1①羥基磷灰石納米粉制備將分析純Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分別溶于去離子水中，配成1mol/L的溶液，將Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以體積比5∶3的比例在1500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下混合，并用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值在11～12范圍，攪拌10小時(shí)后，老化24小時(shí)。再將得到的沉淀物放入高壓釜中，在200℃、200mv、200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下處理4小時(shí)，再經(jīng)清洗、過(guò)濾、干燥得到羥基磷灰石納米顆粒。
②羥基磷灰石納米顆?；鞈乙褐苽淙×u基磷灰石納米顆粒0.5g，放入離心管，加去離子水20ml，濃度為25mg/ml，用超聲波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710，USA)，靜置觀察2h，羥基磷灰石納米顆?；鞈乙簾o(wú)分層，呈乳狀。將納米顆?；鞈乙褐萌?0ml玻璃瓶，高壓滅菌后保存。取1ml納米顆?；鞈乙簶颖拘须婄R分析。
③羥基磷灰石納米顆粒與SGC-7901細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板，104細(xì)胞一孔，加10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，置換新鮮培養(yǎng)基，每孔100μl。加入50μl不同濃度的納米顆?；鞈乙?，濃度從0、7.5、15.6、31.2、62.3、125、250、至500μg/ml，振蕩混均，繼續(xù)培養(yǎng)48h后行MTT測(cè)定。將MTT溶液過(guò)濾除菌，以正常生長(zhǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，每孔加8μlMTT溶液，培養(yǎng)4h，棄上清，加入二甲基亞砜(DimehylSulfoxide)100μl每孔，顯微鏡下觀察有MTT結(jié)晶形成，振蕩10min，每孔取100μl置于OD測(cè)定板，測(cè)OD值，波長(zhǎng)595nm，比色法確定有活力的細(xì)胞數(shù)，方差分析方法采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。
④羥基磷灰石納米顆粒與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)取瓊脂糖粉1g，制凝膠，將已消毒的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙合♂?0倍，濃度2.5mg/ml，測(cè)pH值為6.5，各取混懸液20μl置入5管eppendorf管中，分別加入不同量的PEGFP-N1(1，3，5μg)，混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，靜置30min，離心(eppendorfCentrifuge5415R離心機(jī)，USA，13200rpm，10min)，以PEGFP-N11μg為對(duì)照，取上清瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。各取50μl的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙翰⑵湔{(diào)至不同的pH值(2，7，12)；將其分別放入eppendorf管與2μgPEGFP-N1混合，混均10min，室溫靜置30min，離心(eppendorfCentrifuge5415R離心機(jī)，13200r/min，10min)，取上清瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
⑤納米顆粒-DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞按1x105接種于培養(yǎng)皿(CellCultureDish，35×10mn2)，加入配有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好。用1xDMEM洗脫兩次，按每培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg加入納米顆粒DNA復(fù)合體，以單純PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg以及與脂質(zhì)體結(jié)合的PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg作為對(duì)照，混合培養(yǎng)8h后更換10％的小牛血清培養(yǎng)，分別于24，48，72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
⑥羥基磷灰石納米顆粒懸液的急性毒性試驗(yàn)昆明種小白鼠，健康無(wú)病，60只，雌雄各半，體重17g-21g，當(dāng)天下午禁食16h(不禁水)后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只，一次給予最大體積0.4ml/20g納米顆粒懸液，濃度梯度分別為4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml，尾靜脈注射小白鼠，觀察二周動(dòng)物的死亡及毒性反應(yīng)。
⑦羥基磷灰石納米顆粒及納米顆粒-DNA復(fù)合體昆明種小白鼠，健康無(wú)病，30只，雌雄各半，體重17g-21g，當(dāng)天下午禁食16h(不禁水)后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，一組用最大體積0.4ml/20g濃度梯度為1.5mg/ml的納米顆粒懸液尾靜脈注射小白鼠，一組用納米顆粒-DNA復(fù)合體尾靜脈注射小白鼠，復(fù)合體為體積0.4ml/20g、濃度梯度1.5mg/ml的納米顆粒懸液與PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒1μg結(jié)合。另一組為對(duì)照，生理鹽水0.4ml尾靜脈注射小白鼠。分別于24h，48h后處死動(dòng)物，取小白鼠肝、腎及腦組織，分別放入凍存管和2％戊二醛溶液，分別行冰凍切片和電子顯微鏡檢查，觀察組織內(nèi)是否有綠色熒光蛋白表達(dá)和納米顆粒分布。
權(quán)利要求
1.一種基因載體的制備方法，其特征在于(1)羥基磷灰石納米顆粒制備將分析純Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分別溶于去離子水中，配成1mol/L的溶液，將Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以體積比5∶3的比例在1500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下混合，并用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值在11～12范圍，攪拌10小時(shí)后，老化24小時(shí)；再將得到的沉淀物放入高壓釜中，在200℃、200mv、200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下處理4小時(shí)，再經(jīng)清洗、過(guò)濾、干燥得到羥基磷灰石納米顆粒；(2)羥基磷灰石納米顆?；鞈乙褐苽浼凹毙远拘栽囼?yàn)取羥基磷灰石納米顆粒0.5g，放入離心管，加去離子水20ml，用超聲波分散制備羥基磷灰石混懸液，并加入分散劑，使混懸液充分分散和穩(wěn)定。用濃度梯度分別為4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙何察o脈注射小白鼠，連續(xù)兩周觀察動(dòng)物的死亡及毒性反應(yīng)；(3)羥基磷灰石納米顆粒生物相容性實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板；加入不同濃度的納米顆粒混懸液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后進(jìn)行MTT測(cè)定。比色法確定有活力的細(xì)胞數(shù)，方差分析方法采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。(4)羥基磷灰石納米顆粒與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)取瓊脂糖粉制凝膠羥基磷灰石納米顆?；鞈乙合♂尲覲EGFP-N1混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，靜置30min，離心；以PEGFP-N11μg為對(duì)照，取上清液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。羥基磷灰石納米顆?；鞈乙翰⑵湔{(diào)至不同的pH值，將其分別放入eppendorf管與PEGFP-N1混合，混均，室溫靜置30min，離心；取上清液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；(5)納米顆粒-DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞按接種于培養(yǎng)皿加入配有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)皿加入納米顆粒DNA復(fù)合體；以單純PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA以及與脂質(zhì)體結(jié)合的PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA作為對(duì)照?；旌吓囵B(yǎng)分別于24，48，72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體的制備方法，其特征在于羥基磷灰石納米顆粒制備，可用CaCI2和H3PO4為原料；可用HNO3和NH4NO3來(lái)調(diào)節(jié)溶液pH值。
3.一種基因載體的應(yīng)用，其特征在于羥基磷灰石納米顆?？蓴y帶抗腫瘤和抗病毒基因進(jìn)行抗腫瘤和抗病毒治療；可制成實(shí)驗(yàn)室常用的基因轉(zhuǎn)染試制；與保濕因子結(jié)合可制成護(hù)膚產(chǎn)品；與生長(zhǎng)因子結(jié)合可用于治療燒傷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因載體的制備方法，其特征在于①羥基磷灰石納米粉制備將分析純Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4分別溶于去離子水中，配成1mol/L的溶液，將Ca(NO3)2和(NH4)H2PO4溶液以體積比5∶3的比例在1500轉(zhuǎn)/min的轉(zhuǎn)速下混合，并用NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值在11～12范圍，攪拌10小時(shí)后，老化24小時(shí)；5再將得到的沉淀物放入高壓釜中，在200℃、200mv、200轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下處理4小時(shí)，再經(jīng)清洗、過(guò)濾、干燥得到羥基磷灰石納米顆粒；②羥基磷灰石納米顆?；鞈乙褐苽淙×u基磷灰石納米顆粒0.5g，放入離心管，加去離子水20ml，濃度為25mg/ml，用超聲波分散60min(UltrasonicHemogenizer-4710，USA)，靜置觀察2h，羥基磷灰石納米顆?；鞈乙簾o(wú)分層，呈乳狀；將納米顆粒混懸液置入50ml玻璃瓶，高壓滅菌后保存；取1ml納米顆?；鞈乙簶颖拘须婄R分析；③羥基磷灰石納米顆粒與SGC-7901細(xì)胞生物相容性實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞接種于96孔組織培養(yǎng)板，104細(xì)胞一孔，加10％小牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁，置換新鮮培養(yǎng)基，每孔100μl；加入50μl不同濃度的納米顆?；鞈乙?，濃度從0、7.5、15.6、31.2、62.3、125、250、至500μg/ml，振蕩混均，繼續(xù)培養(yǎng)48h后行MTT測(cè)定；將MTT溶液過(guò)濾除菌，以正常生長(zhǎng)細(xì)胞為對(duì)照組，每孔加8μlMTT溶液，培養(yǎng)4h，棄上清，加入二甲基亞砜(DimehylSulfoxide)100μl每孔，顯微鏡下觀察有MTT結(jié)晶形成，振蕩10min，每孔取100μl置于OD測(cè)定板，測(cè)OD值，波長(zhǎng)595nm，比色法確定有活力的細(xì)胞數(shù)，方差分析方法采用SPSS9.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行；④羥基磷灰石納米顆粒與DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)取瓊脂糖粉1g，制凝膠，將己消毒的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙合♂?0倍，濃度2.5mg/ml，測(cè)pH值為6.5，各取混懸液20μl置入5管eppendorf管中，分別加入不同量的PEGFP-N1(1，3，5μg)，混均10min(VORTEX2GENIE，USA)，靜置30min，離心(eppendorfCentrifuge5415R離心機(jī)，USA，13200rpm，10min)，以PEGFP-N11μg為對(duì)照，取上清瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；各取50μl的羥基磷灰石納米顆?；鞈乙翰⑵湔{(diào)至不同的pH值(2，7，12)；將其分別放入eppendorf管與2μgPEGFP-N1混合，混均10min，室溫靜置30min，離心(eppendorfCentrifuge5415R離心機(jī)，13200r/min，10min)，取上清瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；⑤納米顆粒-DNA復(fù)合體體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)將SGC-7901細(xì)胞按1×105接種于培養(yǎng)皿(CellCultureDish，35×10mn2)，加入配有小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察見(jiàn)細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好；用1×DMEM洗脫兩次，按每培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg加入納米顆粒DNA復(fù)合體，以單純PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg以及與脂質(zhì)體結(jié)合的PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒DNA2μg作為對(duì)照，混合培養(yǎng)8h后更換10％的小牛血清培養(yǎng)，分別于24，48，72h后熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；⑥羥基磷灰石納米顆粒懸液的急性毒性試驗(yàn)昆明種小白鼠，健康無(wú)病，60只，雌雄各半，體重17g-21g，當(dāng)天下午禁食16h(不禁水)后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組15只，一次給予最大體積0.4ml/20g納米顆粒懸液，濃度梯度分別為4.5mg/ml、1.5mg/ml、0.5mg/ml，尾靜脈注射小白鼠，觀察二周動(dòng)物的死亡及毒性反應(yīng)；⑦羥基磷灰石納米顆粒及納米顆粒-DNA復(fù)合體昆明種小白鼠，健康無(wú)病，30只，雌雄各半，體重17g-21g，當(dāng)天下午禁食16h(不禁水)后，隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，一組用最大體積0.4ml/20g濃度梯度為1.5mg/ml的納米顆粒懸液尾靜脈注射小白鼠，一組用納米顆粒-DNA復(fù)合體尾靜脈注射小白鼠，復(fù)合體為體積0.4ml/20g、濃度梯度1.5mg/ml的納米顆粒懸液與PEGFP-N1表達(dá)質(zhì)粒1μg結(jié)合。另一組為對(duì)照，生理鹽水0.4ml尾靜脈注射小白鼠。分別于24h，48h后處死動(dòng)物，取小白鼠肝、腎及腦組織，分別放入凍存管和2％戊二醛溶液，分別行冰凍切片和電子顯微鏡檢查，觀察組織內(nèi)是否有綠色熒光蛋白表達(dá)和納米顆粒分布。
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域用的材料，尤其是一種基因載體材料的制備方法，其特征在于將Ca(NO
文檔編號(hào)A61K48/00GK1712070SQ20041002334
公開(kāi)日2005年12月28日 申請(qǐng)日期2004年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月25日
發(fā)明者周科朝, 朱曬紅, 黃蘇萍, 李志友 申請(qǐng)人:中南大學(xué)