專利名稱：家畜用去勢(shì)疫苗基因及重組基因載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因及重組基因載體，用于生產(chǎn)家畜家禽去勢(shì)用促黃體素釋放激素(LHRH)基因工程亞單位疫苗，屬于生物技術(shù)高科技領(lǐng)域。
(二)技術(shù)背景促黃體素釋放激素(Luteinizing hormore releasing hormore，LHRH)是由動(dòng)物下丘腦分泌的一種十肽激素，其主要生物學(xué)功能是控制腦下垂體前葉細(xì)胞合成和分泌促黃體激素(LH)及促卵泡激素(FSH)，這些激素能促進(jìn)性腺及性器官的正常發(fā)育，維持動(dòng)物的生殖功能。去勢(shì)疫苗可免疫調(diào)控動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)的性相關(guān)激素水平，抑制動(dòng)物性器官發(fā)育，使動(dòng)物喪失性行為和性功能，從而防止混亂交配(引起畜群退化)和爭(zhēng)斗，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，改善胴體組成和肉質(zhì)(使肉質(zhì)鮮嫩并防止膻味)，提高飼料報(bào)酬。其機(jī)理是通過LHRH合成抗原或重組抗原作疫苗免疫動(dòng)物后，在體內(nèi)形成LHRH抗體，中和內(nèi)源性LHRH，從而顯著降低睪酮及雌激素等性激素水平，達(dá)到溫和去勢(shì)的目的。與傳統(tǒng)手術(shù)去勢(shì)相比，疫苗去勢(shì)不僅簡(jiǎn)便易行，給管理上帶來極大的方便，尤其適合于規(guī)?；B(yǎng)殖和放牧畜群，而且可防止手術(shù)去勢(shì)導(dǎo)致的出血、感染及應(yīng)激造成的減食和體重下降，另外疫苗去勢(shì)可適用于大動(dòng)物或小動(dòng)物(雞等小動(dòng)物手術(shù)較困難)、雌性或雄性動(dòng)物、幼齡和成年動(dòng)物、畜禽和其他動(dòng)物，再者疫苗去勢(shì)可通過配套技術(shù)實(shí)現(xiàn)可逆性控制。
通過免疫方法促使動(dòng)物產(chǎn)生抗LHRH的抗體，以中和LHRH的生理作用，從而抑制性腺的發(fā)育以達(dá)到去勢(shì)的目的，其可行性已被國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者證實(shí)，但大多數(shù)研究都集中在合成肽疫苗，雖然免疫效果顯著，終因成本太高而無法進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用。王彩平等將LHRH/HBsAg融合蛋白在家蠶桿狀病毒中進(jìn)行表達(dá)，但也因表達(dá)產(chǎn)量低，提純工藝繁瑣而未能推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是設(shè)計(jì)動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因，構(gòu)建能高效表達(dá)LHRH融合蛋白的動(dòng)物去勢(shì)疫苗重組基因載體，可以用于研制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、低成本、工藝簡(jiǎn)便，適合規(guī)模生產(chǎn)、使用方便，而且安全性高，無殘留，無潛在危險(xiǎn)的動(dòng)物去勢(shì)基因工程疫苗，免疫動(dòng)物，替代傳統(tǒng)的手術(shù)去勢(shì)。
技術(shù)方案 本發(fā)明所提供的動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因，其通式為5′--保護(hù)性堿基--限制性酶切位點(diǎn)--框架保證堿基--LHRH基因--終止子--限制性酶切位點(diǎn)--保護(hù)性堿基--3′其中，保護(hù)性堿基可以是A、T、G、C任選；限制性酶切位點(diǎn)是指Nco I、EcoR I、HindIII、Xho I、BamH I等限制性酶的切點(diǎn)；框架保證堿基可以是A、T、G、C任選；LHRH基因是指家畜LHRH基因，或者是家禽LHRH基因，或者是LHRH基因和家禽LHRH基因串聯(lián)。
上述動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因，例舉具體的基因序列如下家畜用去勢(shì)疫苗LHRH基因序列——L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子Xho I家禽用去勢(shì)疫苗LHRH基因序列——L25′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTNco ITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I畜/禽通用去勢(shì)疫苗LHRH基因序列之1——L35′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I畜/禽通用去勢(shì)疫苗LHRH基因序列之2——L45′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNco IGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 Xho I用上述動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因構(gòu)建的重組基因載體，pET-32c LHRHn-N/X重組表達(dá)質(zhì)粒，是通過以下方法構(gòu)建獲得的1.LHRH基因片段的退火將人工合成的動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因片段的正鏈和負(fù)鏈，分別用滅菌超純水溶解成濃度為100pmol/μl(相當(dāng)于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超純凈水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存?zhèn)溆茫?.LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對(duì)退火后的LHRH基因進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物直接用于連接反應(yīng)；3.pET-32c質(zhì)粒的提取、酶切及回收pET-32c質(zhì)粒的提取后，用NcoI及XcoI對(duì)pET-32c質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存?zhèn)溆茫?.連接DNA連接反應(yīng)體系如下PET-32c雙酶切回收產(chǎn)物 2.5μlLHRH基因酶切產(chǎn)物 7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應(yīng)30min后立即用于轉(zhuǎn)化；5.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備；6.轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μl大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，平板置37℃溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即為重組基因載體pET-32c LHRHn-N/X重組質(zhì)粒。
有益效果 本發(fā)明所提供的動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因及其重組基因載體，可高效表達(dá)LHRH-Trx融合蛋白(表達(dá)量30％以上)，用于生產(chǎn)家畜家禽去勢(shì)用促黃體素釋放激素(LHRH)基因工程亞單位疫苗。由于鳥類和哺乳動(dòng)物的LHRH有一個(gè)氨基酸不同，分別構(gòu)建了表達(dá)鳥類、哺乳類及不同數(shù)量鳥類/哺乳類相間串聯(lián)的LHRH基因的重組表達(dá)質(zhì)粒(Ll、L2、L3、L4)。經(jīng)檢驗(yàn)測(cè)試，本發(fā)明所提供的重組基因載體，在表達(dá)量、免疫原性、生產(chǎn)簡(jiǎn)便性、去勢(shì)有效性、安全性、成本等各方面均符合產(chǎn)業(yè)化要求。用其制造疫苗，生產(chǎn)簡(jiǎn)易，成本低廉，安全有效。4種質(zhì)粒中，L1表達(dá)產(chǎn)物對(duì)家畜有效，L2對(duì)家禽有效，L3及L4家畜家禽通用，L4免疫產(chǎn)生期及免疫持續(xù)期等方面的效力又優(yōu)于L3，可根據(jù)各種不同的應(yīng)用需要加以選擇。
采用該工程體在實(shí)驗(yàn)室條件下生產(chǎn)L1、L2、L3和L4苗樣各3批，其表達(dá)產(chǎn)量穩(wěn)定，表達(dá)產(chǎn)物蛋白量均達(dá)菌體總蛋白量的30％以上。表達(dá)產(chǎn)物均穩(wěn)定具有良好的免疫原性，表現(xiàn)在(1)表達(dá)產(chǎn)物與Sigma公司的LHRH標(biāo)準(zhǔn)抗體發(fā)生特異性反應(yīng)；(2)免疫動(dòng)物后能有效激發(fā)產(chǎn)生高效價(jià)的LHRH抗體，該抗體能在體外試驗(yàn)中與LHRH發(fā)生特異性反應(yīng)。共免疫小鼠210只，兔50只，土雞30只，豬640頭，貓6只，狗4只，免疫動(dòng)物后均能有效激發(fā)抗體，性成熟期觀測(cè)，在性行為、性功能、性激素水平、性器官發(fā)育抑制等各方面綜合評(píng)定，可有效去勢(shì)，明顯改善肉質(zhì)，并可明顯促進(jìn)增重和提高飼料報(bào)酬。以公兔為例，免疫組平均睪丸重量為1.32±0.38g，對(duì)照組平均睪丸重為3.18±0.47g，組織學(xué)觀察證實(shí)，免疫組睪丸實(shí)質(zhì)萎縮，多無精子形成能力(個(gè)別有精子，但活檢時(shí)沒有活力)。
A.正常對(duì)照兔睪丸組織切片B.表達(dá)產(chǎn)物免疫兔睪丸組織切片
1.1.家畜用疫苗LHRH基因序列——L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子XhoI1.2.家禽用疫苗LHRH基因序列——L25′-GGCCATGGCTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTNcoITAATGAAC TCGAGCA-3′終止子 XhoI1.3.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之1——L35′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNcoIGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI1.4.畜/禽通用疫苗LHRH基因序列之2——L45′-GGCCATGGCTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTNcoIGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACACTGGTCCTACGGTCTGCGTCCGGGTGGCGGTGAGCACTGGTCTTACGGCCTGCAGCCGGGTGGCGGTGAACATTGGTCTTACGGTCTGCGCCCGGGTTAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI2.LHRH基因克隆(

圖1)2.1.LHRH基因片段的退火將人工合成的動(dòng)物去勢(shì)疫苗基因片段的正鏈和負(fù)鏈，分別用滅菌超純水溶解成濃度為100pmol/μl(相當(dāng)于1.82μg/μl)的溶液，各取2μl加入72μl超純水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.2.LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對(duì)退火后的LHRH基因進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物直接用于連接反應(yīng)。
2.3.pET-32c質(zhì)粒的提取、酶切及回收pET-32c質(zhì)粒的提取用堿裂解法，參照文獻(xiàn)[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法。用NcoI及XhoI對(duì)pET-32c質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴中融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 2.4.連接DNA連接反應(yīng)體系如下pET-32c雙酶切回收產(chǎn)物 2.5μlLHRH基因酶切產(chǎn)物 7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應(yīng)30min后立即用于轉(zhuǎn)化。
2.5.感受態(tài)細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。
2.6.轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，具體操作參照文獻(xiàn)[美]J.薩姆布魯克等著，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》介紹的方法進(jìn)行。取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，同時(shí)設(shè)未轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照(陰性對(duì)照)及pET-32c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照(陽(yáng)性對(duì)照)。平板置37℃溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)。
2.7.重組質(zhì)粒的酶切篩選
pET-32c質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)有EcoRI及HandIII酶切位點(diǎn)，當(dāng)插入LHRH基因后這兩個(gè)酶切位點(diǎn)應(yīng)該消失，而NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)仍然存在。據(jù)此原理，挑取轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，分別用HindIII、EcoRI、NcoI及XhoI進(jìn)行單酶切，挑選HindIII及EcoRI酶切位點(diǎn)消失而NcoI及XhoI酶切位點(diǎn)仍存在的陽(yáng)性克隆。
2.8.重組質(zhì)粒的序列測(cè)定挑選經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒，以T7 Terminater primer作為測(cè)序引物，由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
3.pET-32c LHRHn-N/X重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)3.1.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備方法同1.2.5。
3.2.轉(zhuǎn)化用堿裂解法小量提取經(jīng)序列測(cè)定的重組質(zhì)粒及pET-32c質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，方法同2.6。
3.3.重組質(zhì)粒在BL21(DE3)中的表達(dá)挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落接種5ml含Amp 50μg/ml的LB肉湯，37℃搖震培養(yǎng)過夜(轉(zhuǎn)速為250rpm，下同)，次日按1％接種量接種于30ml含Amp 50μg/min的LB肉湯中，于37℃搖床中培養(yǎng)至OD600達(dá)0.5左右，取出1ml菌液置Eppendorf管中2000r/min離心1min，棄上清于-20℃凍存?zhèn)溆?，作為誘導(dǎo)前對(duì)照，其余培養(yǎng)物加入終濃度為1mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)3-4小時(shí)，取1ml誘導(dǎo)后菌液同樣離心棄上清保留沉淀。同時(shí)對(duì)pET-32c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行同樣操作作為對(duì)照。
3.4.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將誘導(dǎo)前菌體，誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌及誘導(dǎo)后pET-32c載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌沉淀用蒸餾水重懸加等體積的2×載體buffer，煮沸5min，各取10μl進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE(濃縮膠5％，分離膠13％)。電泳結(jié)束后，凝膠用考馬斯亮藍(lán)(R250)進(jìn)行染色。用凝膠成像處理系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度掃描，測(cè)定表達(dá)融合蛋白與菌體總蛋白之比。
3.5.表達(dá)蛋白的可溶性將LHRH-pET-32c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌過夜培養(yǎng)物按1％接種量接種100ml LB肉湯，37℃搖床培養(yǎng)至OD600＝0.5左右時(shí)，加入IPTG至終濃度1mM，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，離心棄上清，全部菌體沉淀用10ml PBS(pH7.4)重懸，超聲波破碎(冰浴)5min，超聲功率為240W，離心后將上清轉(zhuǎn)移至另一容器中，沉淀用10ml PBS重懸，各取50μl上清及沉淀懸液加入等體積的2×載樣buffer，進(jìn)行SDS-PAGE；同時(shí)，對(duì)pET-32c質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行上述同樣操作作對(duì)照。另外設(shè)未用超聲波裂解的全菌對(duì)照。對(duì)凝膠進(jìn)行灰度掃描確定目的蛋白的含量。
4.LHRH-Trx融合蛋白的免疫原性鑒定4.1.試驗(yàn)動(dòng)物小鼠200只，兔50只，土雞30只，豬600頭，貓6只，狗4只。
4.2.免疫方案將表達(dá)產(chǎn)物用弗氏佐劑及白油佐劑等配制疫苗，通過皮內(nèi)注射和肌肉注射等免疫途徑注射動(dòng)物，免疫劑量0.2-2ml不等，視動(dòng)物體重大小而定。一般在動(dòng)物性成熟前免疫。
4.3.免疫動(dòng)物性功能及性器官檢查4.3.1.性功能檢查在性成熟期后，將試驗(yàn)動(dòng)物與同種異性健康成年動(dòng)物合養(yǎng)，觀察性行為、性征及繁殖能力等情況。
4.3.2.性腺、性器官檢查剖解檢查，采集睪丸、卵巢，其一立即置中性福爾馬林中固定，作組織切片分析，其二稱重、測(cè)量大小和檢查睪丸有無精子及精子活力等。
結(jié)果分析1.四種能穩(wěn)定、高效表達(dá)LHRH-Trx融合蛋白的重組質(zhì)粒構(gòu)建了表達(dá)鳥類、哺乳類及不同數(shù)量鳥類/哺乳類相間串聯(lián)的LHRH融合蛋白的4種重組表達(dá)質(zhì)粒。序列分析表明基因合成和插入正確。質(zhì)粒經(jīng)保存后多次轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達(dá)量及表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性均很穩(wěn)定，表達(dá)水平始終在菌體總蛋白的30％以上。
2.可溶性的表達(dá)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)了LHRH-Trx融合蛋白的可溶性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物幾乎完全以可溶性形式存在(而非包涵體)。用滲透休克方法對(duì)LHRH融合蛋白及pET-32c載體蛋白進(jìn)行提取，結(jié)果LHRH重組菌經(jīng)高滲處理后能將LHRH-Trx融合蛋白單一地釋放出來，而且純度達(dá)90％以上，而pET-32c空載體蛋白仍存在于菌體中不能釋放出來。為提取和純化表達(dá)產(chǎn)物制備疫苗提供了極大的方便。
3.表達(dá)產(chǎn)物有很強(qiáng)的LHRH抗原性表達(dá)產(chǎn)物和LHRH抗體有很好的反應(yīng)性，該反應(yīng)能被LHRH標(biāo)準(zhǔn)品阻斷；免疫動(dòng)物能有效激發(fā)LHRH抗體，中和內(nèi)源性LHRH，從而顯著降低睪酮及FSH等性激素水平，達(dá)到溫和去勢(shì)的目的，而且，疫苗免疫可防止手術(shù)去勢(shì)導(dǎo)致的出血、感染及應(yīng)激造成的減食和體重下降。
權(quán)利要求
1.家畜用去勢(shì)疫苗LHRH基因，其具體的基因序列如下5′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI
2.含權(quán)利要求1所述家畜用去勢(shì)疫苗基因的重組表達(dá)載體，是通過以下方法構(gòu)建獲得的2.1LHRH基因片段的退火人工合成的家畜用去勢(shì)疫苗基因片段L15′-GGCCATGGCTGAGCATTGGTCTTATGGCCTGCGCCCAGGTNcoITAATGAACTCGAGCA-3′終止子 XhoI將人工合成的家畜用去勢(shì)疫苗基因片段的正鏈和負(fù)鏈，分別用滅菌超純?nèi)芙獬蓾舛葹?00pmol/l的溶液，各取2μl加入72μl超純水中混勻，置沸水浴中2min后緩慢冷卻至室溫，-20℃凍存?zhèn)溆茫?.2 LHRH基因的酶切用NcoI及XhoI對(duì)退火后的LHRH基因進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物直接用于連接反應(yīng)；2.3 pET-32c質(zhì)粒的提取、酶切及回收pET--32c質(zhì)粒的提取后，用NcoI及XhoI對(duì)PET-32c質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切大片段，置液氮中凍5min，而后置37℃水浴融化，10000r/min離心10min，吸取上清-20℃凍存?zhèn)溆茫?.4連接DNA連接反應(yīng)體系如下PET-32c雙酶切回收產(chǎn)物 2.5μlLHRH基因酶切產(chǎn)物7.5μlDNA Ligation Kit Solution I 10μl上述混合物16℃反應(yīng)30min后立即用于轉(zhuǎn)化；2.5.大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備；2.6轉(zhuǎn)化取10μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化200μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞，取200μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含Amp 50μg/ml的LB瓊脂平板，平板置37℃溫箱中培養(yǎng)18小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化后的單個(gè)菌落，接種含Amp的LB肉湯擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明家畜用去勢(shì)疫苗基因及重組基因載體，用于生產(chǎn)家畜家禽去勢(shì)基因工程亞單位疫苗，屬于生物技術(shù)高科技領(lǐng)域。其方法如下人工合成畜用、禽用或畜禽通用的LHRH基因片段，其5′端和3′端分別加有NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)，插入pET－32c質(zhì)粒，構(gòu)建成4種表達(dá)LHRH－Trx融合蛋白的pET－32c LHRHn－N/X重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，表達(dá)產(chǎn)物為可溶性蛋白，便于提取純化，家畜、家禽通用，免疫雞、豬、羊、兔、犬、貓等動(dòng)物，可有效去勢(shì)。圖為重組質(zhì)粒pET－32c LHRHn(L1、L2、L3、L4)－N/X的構(gòu)建。
文檔編號(hào)C07H21/04GK1436789SQ02155220
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月10日
發(fā)明者吉傳義, 杜念興, 朱杰青, 龔光明, 王凌, 龔曉明 申請(qǐng)人:成都瑞盛高科技有限責(zé)任公司