專利名稱：近紅外熒光造影劑和熒光成像的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種近紅外熒光造影劑以及使用所述造影劑的熒光成像。
在治療疾病方面，在疾病的早期階段檢測由疾病引起的活體中的形態(tài)與功能性變化至關(guān)重要。尤其是在治療癌癥時，腫瘤的位置與大小是有效治療方案的重要的決定性因素。用于這一目的的已知方法包括通過穿刺進行活檢及類似方法，以及成像診斷如X射線成像、MRI、超聲成像及類似方法。活檢對確診是有效的，但同時它給受試者施加很大的負擔，并且它不適用于追蹤損傷的時間過程變化。X射線成像和MRI不可避免地將受試者暴露于輻射和磁波中。另外，如上面提到的常規(guī)成像診斷需要復雜的操作和長的時間用于測定和診斷。用于這一目的的大型設(shè)備也使在操作中運用這些方法變得困難。
成像診斷的一種是熒光成像(Lipspn R.L.等，J.Natl.CancerInst.，26，1-11(1961))。這一方法使用當暴露于具有特定波長的激發(fā)光時發(fā)射熒光的物質(zhì)作為造影劑。因而，體被暴露于來自體外的激發(fā)光，由體內(nèi)熒光造影劑發(fā)出的熒光可被檢測到。
這樣的熒光造影劑可以是，例如，在腫瘤中累積的卟啉化合物，它被用于光動力學治療(PDT)，如血卟啉。其它例子包括光敏鈉和benzoporphyrin(見Lipspn R.L.等，supra，Meng T.S.等，SPIE，1641，90-98(1992)，WO 84/04665等)。這些化合物最初用于PDF并具有光毒性，因為這是PDF所需要的。因此，這些并不是理想的診斷試劑。
同時，使用已知的熒光染料如熒光黃、fluorescamin和riboflabin的視網(wǎng)膜循環(huán)微血管造影術(shù)已為人所知(美國專利第4945239號)。這些熒光染料在400-600nm的可見光區(qū)發(fā)射熒光。在這一區(qū)域，穿透活組織的光傳輸很慢，因此體內(nèi)深層部位損傷的檢測幾乎是不可能的。
另外，包括吲哚花青綠(本文以下略為ICG)在內(nèi)的花青化合物作為熒光造影劑的用途已有文件記載(Haglund M.M.等，Neurosurgery，35，930(1994)，Li，X.等，SPIE，2389，789-797(1995))，吲哚花青綠用于測定肝功能和心輸出量。花青化合物在近紅外區(qū)(700-1300nm)顯示吸收。
近紅外光顯示高的穿透活組織的傳輸，并且能夠穿透大小約10cm的頭骨。因此，它在臨床醫(yī)學上日益引起人們的注意。例如，使用介質(zhì)光傳輸?shù)墓釩T技術(shù)已作為新技術(shù)在臨床領(lǐng)域引起人們的注意。這是因為近紅外光能夠穿透活體，并能被用于監(jiān)控活體中的氧濃度和循環(huán)。
花青化合物在近紅外區(qū)發(fā)射熒光。這一區(qū)域的熒光能穿透活組織而提供作為熒光造影劑的潛力。近年來已經(jīng)開發(fā)了許多花青化合物，并被嘗試用作熒光造影劑(WO96/17628、WP97/13490等)。然而，具有足夠水溶性且對活體安全，并具有區(qū)分正常組織和疾病組織能力(對成像靶位的選擇性)的試劑還不存在。
發(fā)明概述因而本發(fā)明的目的之一是提供一種熒光造影劑。本發(fā)明的試劑是低毒性的，并具有優(yōu)越的水溶性。另外，它發(fā)射能夠穿透活組織的近紅外區(qū)的熒光，形成腫瘤和/或血管的特定影像。
本發(fā)明的另一目的是提供一種使用所述近紅外熒光造影劑的熒光成像方法。
本發(fā)明基于將三個或更多個磺酸基團引入到花青染料化合物中導致產(chǎn)生具有高水溶性的熒光造影劑的發(fā)現(xiàn)。還發(fā)現(xiàn)當使用該造影劑時可建立一種熒光成像方法。
因而，本發(fā)明提供以下(1)一種近紅外熒光造影劑，包括分子中具有三個或更多個磺酸基團的化合物，它可用分子式[I]表示 其中R1和R2相同或不同，各自是取代或未取代的烷基；Z1和Z2各自是形成取代或未取代的稠苯環(huán)或稠萘環(huán)所需的非金屬原子；r是0、1或2；L1-L7相同或不同，各自是取代或未取代的次甲基，條件是r是2時，同時出現(xiàn)的L6和L7相同或不同；以及X和Y相同或不同，各自是下列分子式中的一個基團 其中R3和R4相同或不同，各自是取代或未取代的烷基，或其藥學可接受的鹽。
(2)上述(1)中的近紅外熒光造影劑，分子中沒有羧酸基團。
(3)上述(1)或(2)中的近紅外造影劑，其中，在分子式[I]中，r是1。
(4)上述(1)到(3)中任一項中的近紅外熒光造影劑，其中分子中具有4個或更多個磺酸基團。
(5)上述(1)到(4)中任一項中的近紅外熒光造影劑，其中分子中具有10個或低于10個磺酸基團。
(6)上述(1)到(4)中的任一項中的近紅外熒光造影劑，其中分子中具有8個或低于8個磺酸基團。
(7)上述(1)到(6)中的任一項中的近紅外熒光造影劑，其中藥學可接受的鹽是鈉鹽。
(8)上述(1)到(7)中的任一項中的近紅外熒光造影劑，用于腫瘤成像和/或血管造影術(shù)。
(9)分子式[II]的化合物的鈉鹽，分子中具有三個或更多個磺酸基團 其中，R1、R2、L1-L7、X和Y如上定義，R5到R16相同或不同，各自是氫原子、磺酸基團、羧基、羥基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酰基或(磺烷基)氨基磺?；?，不包括以下分子式

(10)上述(9)中的鈉鹽，其中，在分子式[II]中，R1和R2各自是具有1到5個碳原子的被磺酸基團取代的低級烷基，且X和Y相同或不同，各自是分子式如下的基團 其中R17和R18是未取代的具有1到5個碳原子的低級烷基。
(11)上述(10)中的鈉鹽，具有如下分子式 (12)如分子式[III-1]的分子中具有三個或更多個磺酸基團的化合物的鈉鹽 其中L1-L7如上定義，R19和R20是具有1到5個碳原子的被磺酸基團取代的低級烷基，R21-R28相同或不同，各自是氫原子、磺酸基團、羧基、羥基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺?；?磺烷基)氨基磺?；?，且X’和Y’相同或不同，各自是以下分子式中的一個基團 其中R17和R18如上定義，不包括以下分子式
(13)上述(12)中的鈉鹽，其中，在分子式[III-1]中，L4是被具有1到4個碳原子的烷基取代的次甲基。
(14)上述(12)中的鈉鹽，是分子中具有三個或更多個磺酸基團的如分子式[III-2]的化合物的鈉鹽， 其中R19-R28、X’和Y’如上定義，Z3是形成5-或6-元環(huán)所需的非金屬原子基團，且A是氫原子或一價基團。
(15)上述(14)中的鈉鹽，具有如下分子式 (16)上述(12)中的鈉鹽，具有如下分子式 (17)上述(9)、(10)、(12)、(13)和(14)中的任一項中的鈉鹽，分子中包括4個或更多個磺酸基團。
(18)上述(9)、(10)、(12)、(13)、(14)和(17)中的任一項中的鈉鹽，分子中包括10個或低于10個磺酸基團。
(19)上述(9)、(10)、(12)、(13)、(14)和(17)中的任一項中的鈉鹽，分子中包括8個或低于8個磺酸基團。
(20)一種包括上述(9)到(19)中的任一項中的鈉鹽的近紅外造影劑。
(21)上述(20)中的近紅外造影劑，用于腫瘤成像和/或血管造影術(shù)。
(22)一種熒光成像方法，包括將上述(1)中的近紅外熒光造影劑引入活體中，將體暴露于激發(fā)光，并檢測來自造影劑的近紅外熒光。
(23)上述(9)中的鈉鹽，至少是選自由下列分子式的化合物組成的組的一員

以及
(24)上述(12)中的鈉鹽，至少是選自由下列分子式的化合物組成的組的一員






(25)上述(1)中的近紅外熒光造影劑，包括至少一種選自由下列分子式的化合物組成的組的化合物












以及
(26)上述(14)中的鈉鹽，其中一價基團A是取代或未取代的烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、低級烷氧基，任選地是取代的氨基、烷基羰氧基(alkylcarbonyloxy)、取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的芳硫基、氰基、硝基或鹵素原子。
附圖的簡要說明

圖1到4是給予化合物24小時后的熒光成像照片，其中給予的是AICG(5mg/Kg)，BNK-1967(5mg/Kg)，C化合物(29)(0.5mg/Kg)和D化合物(6)的K鹽(5mg/Kg)。
圖5是給予化合物24小時后的熒光成像照片，其中給予的是E化合物(31)(5mg/Kg)。
圖6到9是給予化合物(5mg/Kg)20秒和5分鐘后的熒光成像照片，其中給予的是AICG(20秒后)，BICG(5分鐘后)，C化合物(29)(20秒后)和D化合物(29)(5分鐘后)。
圖10是給予化合物0.5、1、4和24小時后在血漿中的化合物濃度的圖，其中縱軸是在各時間點血漿中的化合物濃度(μg/ml)。
圖11是化合物(29)的紅外吸收譜圖。
圖12是化合物(31)的紅外吸收譜圖。
圖13是化合物(6)的紅外吸收譜圖。
圖14是化合物(54)的紅外吸收譜圖。
發(fā)明詳述本說明書所用術(shù)語定義如下。
本發(fā)明中的近紅外熒光造影劑指發(fā)射近紅外區(qū)熒光的造影劑。
在本發(fā)明中，當磺酸基團被用于形成內(nèi)鹽時，所述磺酸基團可以指磺酸根(-SO3-)。在本發(fā)明中，優(yōu)選的X和Y是以下分子式 其中R3和R4相同或不同，各自是取代或未取代的烷基。
在R1、R2、R3和R4中的“取代或未取代的烷基”的烷基優(yōu)選為直鏈或支鏈的具有1到5個碳原子的低級烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、2-甲基丙基、1，1-二甲基丙基等。取代基可以是，例如磺酸基團、羧基、羥基等。取代的烷基的例子包括羥甲基、1-羥乙基、2-羥乙基、2-羥丙基、3-羥丙基、4-羥丁基、羧甲基、羧乙基、羧丁基、磺甲基、2-磺乙基、3-磺丙基、4-磺丁基等。優(yōu)選的R1和R2是被磺酸基團取代的具有1到5個碳原子的低級烷基(如2-磺乙基、3-磺丙基、4-磺丁基等)，R3和R4是未取代的具有1到5個碳原子的低級烷基(如甲基、乙基等)。
R17和R18的具有1到5個碳原子的未取代低級烷基以以上提到的那些關(guān)于R1、R2、R3和R4的“取代的或未取代的烷基”的烷基作為例子。
R19和R20的被磺酸基團取代的具有1到5個碳原子的低級烷基的烷基基團以以上提到的那些關(guān)于R1、R2、R3和R4的“取代或未取代的烷基”的烷基作為例子，具有1到5個碳原子的取代的低級烷基的例子包括2-磺乙基、3-磺丙基和4-磺丁基。
R21-R28的烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺酸基團和(磺烷基)氨基磺酸基團的烷基部分優(yōu)選是具有1到5個碳原子的直鏈或支鏈低級烷基，以以上提到的那些關(guān)于R1、R2、R3和R4的“取代或未取代的烷基”的烷基為例子。
在本發(fā)明中，“形成取代或未取代的稠苯環(huán)或稠萘環(huán)所需的非金屬原子”指形成稠苯環(huán)或稠萘環(huán)所需的連接基團，它是分子式如下的一個基團 當稠苯環(huán)或稠萘環(huán)有取代基時，所述的連接基團可以具有取代基。
其特定的例子包括碳原子、氮原子、氧原子、氫原子、硫原子、鹵素原子(如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)等。
由非金屬原子Z1和Z2形成的稠苯環(huán)或稠萘環(huán)的取代基以磺酸基團、羧基、羥基、鹵素原子(如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子)、氰基、取代的氨基(如二甲氨基、二乙氨基、乙基4-磺丁氨基，二-(3-磺丙基)氨基等)，以及以上定義的直接或通過二價連接基團鍵合于環(huán)上的取代或未取代的烷基為例子。優(yōu)選的二價連接基團可以是，例如-O-、-NHCO-、-NHSO2-、-NHCOO-、-NHCONH-、-COO-、-CO-、-SO2-等。直接或通過二價連接基團鍵合于環(huán)的取代或未取代的烷基的烷基優(yōu)選地以甲基、乙基、丙基和丁基為例子，取代基優(yōu)選地以磺酸基團、羧基和羥基為例子。
L1-L7的次甲基的取代基以取代或未取代的烷基(如上定義)、鹵素原子(如上定義)、取代或未取代的芳基、低級烷氧基等為例子?！叭〈蛭慈〈姆蓟钡姆蓟员交⑤粱葹槔?，優(yōu)選為苯基。取代基的例子包括鹵素原子(如上定義，優(yōu)選為氯原子)等。取代的芳基包括，如4-氯苯基等。低級烷基優(yōu)選為具有1到6個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，特定地是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基等，優(yōu)選為甲氧基和乙氧基。另外，L1-L7的次甲基的取代基可以相互連接形成具有三個次甲基基團的環(huán)，該環(huán)可以進一步與具有另外的次甲基基團的環(huán)形成稠環(huán)。通過L1-L7的次甲基的取代基連接而形成的具有三個次甲基基團的環(huán)以4，4-二甲基環(huán)己環(huán)等為例子。
由L1-L7基團組成的具有一個環(huán)的共軛次甲基鏈優(yōu)選為分子式(a)的基團 其中Z3表示形成5-或6-元環(huán)所需的非金屬原子，A是氫原子或一價基團。
“形成5-或6-元環(huán)所需的非金屬原子”以以上提到的那些原子為例子。
在分子式(a)和后面將提到的分子式[III-2]中，Z3的5-或6-元環(huán)以環(huán)戊烯環(huán)、環(huán)己烯環(huán)、4，4-二甲基環(huán)己烯環(huán)等為例子，特別優(yōu)選的是環(huán)戊烯環(huán)。
A代表的一價基團包括，如取代或未取代的烷基(如上定義)、取代或未取代的芳基(如上定義)、取代或未取代的芳烷基、低級烷氧基(如上定義)、被任選地取代的取代的氨基、烷基羰氧基(如乙酰氧基)、取代或未取代的烷硫基、取代或未取代的芳硫基、氰基、硝基、鹵素原子(如上定義)等。如本文所用的，“取代或未取代的芳烷基”的芳烷基以苯甲基、2-苯乙基、1-苯乙基、3-苯丙基等為例子，取代基可以是磺酸基團、羧基、羥基、取代或未取代的烷基(如上定義)、烷氧基(如上定義)、鹵素原子(如上定義)等?！叭〈陌被钡谋蝗芜x地取代的取代的氨基包括，例如，烷氨基(如甲氨基、乙氨基等)、二烷氨基(二甲氨基、二乙氨基等)、二苯基氨基、甲基苯基氨基、環(huán)狀氨基(如嗎啉代、imidazolidino、ethoxycarbonylpiperadino等)等。關(guān)于“被任選地取代的取代的氨基”的任選的取代的取代基包括磺酸基團、羧基等?！叭〈蛭慈〈耐榱蚧钡耐榱蚧梢允牵?，甲硫基、乙硫基等。取代基的例子包括磺酸基團、羧基等?！叭〈蛭慈〈姆剂蚧钡姆剂蚧员搅蚧⑤亮蚧葹槔?。取代基的例子包括磺酸基團、羧基等。
A代表的一價基團優(yōu)選為氟原子、氯原子、二烷基氨基(優(yōu)選具有6個或低于6個碳原子，且任選地成環(huán))或嗎啉代。該基團特別優(yōu)選地具有磺酸基團。
在分子式[I]中，r優(yōu)選為1。
藥學可接受的鹽可以是與分子式[I]的化合物形成的任何無毒鹽。其例子包括堿金屬鹽如鈉鹽、鉀鹽，堿土金屬鹽如鎂鹽、鈣鹽等，有機銨鹽如銨鹽、三乙基銨鹽、三丁基銨鹽、吡啶鹽等，氨基酸鹽如賴氨酸鹽、精氨酸鹽等。特別優(yōu)選的是在活體內(nèi)引起更低毒性的鈉鹽。
用于活體的熒光造影劑特別地應(yīng)該是水溶性的。在本發(fā)明中，因在上述化合物中引入3個或更多個磺酸基團而使近紅外熒光造影劑具有顯著提高的水溶性。為了有更好的水溶性，磺酸基團的數(shù)目優(yōu)選為4個或更多。為合成簡單起見，磺酸基團的數(shù)目不超過10個，優(yōu)選不超過8個。水溶性的提高可以通過測定各化合物的分配系數(shù)來確定，例如，可以在丁醇/水的兩相體系中測定。更具體地說，3個或更多個磺酸基團的引入導致正丁醇/水的分配系數(shù)logPo/w不超過-1.00。
磺酸基團特別優(yōu)選是引入到分子式[I]的R1、R2、Z1和/或Z2的位置和分子式[II]的R1、R2、R5、R7、R11和/或R13的位置上。
另外，這些磺酸基團優(yōu)選通過二價基團如亞烷基引入到上述分子式(a)的共軛次甲基鏈在位置A的L4上。
在分子中具有3個或更多個磺酸基團的分子式[II]的化合物的鈉鹽中，優(yōu)選的是以下化合物的鈉鹽，其中R1和R2是具有1到5個碳原子的被磺酸基團取代的低級烷基，X和Y相同或不同，各自是如下分子式的基團 其中R17和R18相同或不同，各自是具有1到5個碳原子的未取代的烷基，所述的鹽分子中具有3個或更多個磺酸基團，特別優(yōu)選的是分子式如下的化合物 在分子中具有3個或更多個磺酸基團的分子式[I]的化合物及其藥學可接受的鹽中，優(yōu)選的是分子式[III-1]的化合物的鈉鹽
其中L1-L7如上定義，R19和R20是被磺酸基團取代的具有1到5個碳原子的低級烷基，R21到R28相同或不同，各自是氫原子、磺酸基團、羧基、羥基、烷基(磺烷基)氨基、二(磺烷基)氨基、磺烷氧基、(磺烷基)磺?；?磺烷基)氨基-磺酰基，且X’和Y’相同或不同，各自是如下分子式的基團 其中R17和R18如上定義，所述的分子中具有3個或更多個磺酸基團的鹽，特別優(yōu)選的是如下分子式的化合物 在分子中具有3個或更多個磺酸基團的分子式[III-1]的化合物的鈉鹽中，優(yōu)選的是分子式[III-2]的化合物的鈉鹽 其中R19-R28、X’和Y’如上定義，Z3是形成5-或6-元環(huán)所需的非金屬原子，A是氫原子或一價基團，所述的分子中具有3個或更多個磺酸基團的鹽，特別優(yōu)選的是如下分子式的化合物
包含于本發(fā)明的近紅外熒光造影劑中的化合物可以是任何具有分子式[I]或[II]，分子中還具有3個或更多個，優(yōu)選為4個或更多個磺酸基團的化合物。這些化合物可根據(jù)已知的花青染料化合物的生產(chǎn)方法來合成，這些方法在《花青染料和相關(guān)化合物》(The CyanineDyes and Related Compounds)，F(xiàn).M.Hamer，John Wiley和Sons，紐約，1964，《血細胞計數(shù)》(Cytometry)，10，3-10(1989)，《血細胞計數(shù)》，11，418-430(1990)，《血細胞計數(shù)》，12，723-730(1990)，《生物共軛化學》(Bioconjugate Chem.)，4，105-111(1993)，《生物分析化學》(Anal.Biochem.)，217，197-204(1994)，《四面體》(Tetrahedron)，45，4845-4866(1989)，EP-A-0591820A1，EP-A-0580145A1等中被公開?；蛘?，它們可以通過已知方法從商品化的花青染料半合成。具體地說，它們可以通過將dianyl化合物與雜環(huán)季鹽反應(yīng)而合成。
本發(fā)明的分子式[I]的化合物可通過以下方法合成。
(i)當r＝0時(a)L1＝L5，X＝Y(jié)，R1＝R2，Z1＝Z2分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽(2摩爾)
其中L1、X、Z1和R1如上定義，與分子式[V-1]的dianyl化合物(1摩爾) 其中L2、L3和L4如上定義，在堿和溶劑的存在下反應(yīng)，生成分子式[VI-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、R1、Z1和X如上定義，該化合物[VI-1](1摩爾)和需要摩爾量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1是有機酸殘基，反應(yīng)生成上述分子式[VI-1]的化合物的鈉鹽。
(b)L1≠L5或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽化合物(1摩爾)和上述分子式[V-1]的diany化合物(1摩爾)在堿和溶劑的存在下反應(yīng)生成分子式[VIII-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、R1、Z1和X如上定義，該化合物[VIII-1](1摩爾)和分子式[XI-1]的雜環(huán)季鹽化合物 其中L5、Y、Z2和R2如上定義，反應(yīng)生成分子式[X-1]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定義，該分子式[X-1]的化合物(1摩爾)和需要摩爾量的上述分子式[VII]的化合物反應(yīng)生成上述分子式[X-1]的化合物的鈉鹽。
(ii)當r＝1時(a)L1＝L7，X＝Y(jié)，R1＝R2且Z1＝Z2分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽化合物(2摩爾)
其中L1、X、Z1和R1如上定義，和分子式[V-2]的diany化合物(1摩爾) 其中L2、L3、L4、L5和L6如上定義，在堿和溶劑的存在下反應(yīng)生成分子式[VI-2]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、R1、Z1和X如上定義，該分子式[VI-2]的化合物(1摩爾)和需要摩爾量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1如上定義，反應(yīng)生成上述分子式[VI-2]的化合物的鈉鹽。
(b)L1≠L7或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽化合物(1摩爾)和上述分子式[V-2]的diany化合物(1摩爾)在堿和溶劑的存在下反應(yīng)生成分子式[VIII-2]的化合物
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、R1、Z1和X如上定義，該化合物[VIII-2](1摩爾)和分子式[IX-2]的雜環(huán)季鹽化合物(1摩爾) 其中L7、Y、Z2和R2如上定義，反應(yīng)生成分子式[X-2]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定義，該分子式[X-2]的化合物(1摩爾)和需要摩爾量的上述分子式[VII]的化合物反應(yīng)，生成上述分子式[X-2]的化合物的鈉鹽。
(iii)當r＝2時當r是2時，L6和L7在分子式[I]中重疊。為了避免這一點，重疊的L6和L7被稱為L8和L9以清楚表達。
(a)L1＝L9，X＝Y(jié)，R1＝R2且Z1＝Z2分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽化合物(2摩爾)
其中L1、X、Z1和R1如上定義，和分子式[V-3]的dianyl化合物(1摩爾) 其中L2、L3、L4、L5、L6和L7如上定義，L8是被任選地取代的次甲基基團，在堿和溶劑的存在下反應(yīng)，生成分子式[VI-3]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、R1、Z1和X如上定義，該化合物[VI-3](1摩爾)和需要摩爾量的分子式[VII]的化合物T1-Na [VII]其中T1如上定義，反應(yīng)生成上述分子式[VI-3]的化合物的鈉鹽。
(b)L1≠L9或X≠Y或R1≠R2或Z1≠Z2上述分子式[IV-1]的雜環(huán)季鹽化合物(1摩爾)和上述分子式[V-3]的dianyl化合物(1摩爾)在堿和溶劑的存在下反應(yīng)，生成分子式[VIII-3]的化合物
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、R1、Z1和X如上定義，該化合物[VIII-3](1摩爾)和分子式[IX-3]的雜環(huán)季鹽化合物(1摩爾) 其中Y、Z2和R2如上定義，L9是被任選地取代的次甲基基團，反應(yīng)生成分子式[X-3]的化合物 其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、R1、R2、Z1、Z2、X和Y如上定義。該分子式[X-3]的化合物(1摩爾)和需要摩爾量的上述分子式[VII]的化合物反應(yīng)，生成上述分子式[X-3]的化合物的鈉鹽。
需要摩爾量的分子式[VII]的化合物是不少于與分子式[I]的化合物的目標鈉鹽的一個分子中含有的鈉的量相等的量。
L8和L9的取代的次甲基基團的取代基以上述L1到L7的次甲基基團的取代基為例子。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，化合物[IV-1]和[V-1]的反應(yīng)，化合物[VIII-1]和[XI-1]的反應(yīng)，化合物[IV-1]和[V-2]的反應(yīng)，化合物[VIII-2]和[IX-2]的反應(yīng)，化合物[IV-1]和[V-3]的反應(yīng)，以及化合物[VIII-3]和[IX-3]的反應(yīng)在-20℃到80℃，優(yōu)選在-10℃到40℃的溫度間，優(yōu)選在酰化試劑如乙酸酐的存在下進行。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，化合物[IV-1]和[VII]的反應(yīng)，化合物[X-1]和[VII]的反應(yīng)，化合物[VI-2]和[VII]的反應(yīng)，化合物[X-2]和[VII]的反應(yīng)，化合物[VI-3]和[VII]的反應(yīng)，以及化合物[X-3]和[VII]的反應(yīng)在0℃到40℃的溫度間，優(yōu)選在溶劑如乙醇和水的存在下進行。
在上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中，所用的堿可以是，例如，三乙胺、三丁胺、嘧啶、二氮雜雙環(huán)十一烯(diazabicycloundecene)、甲醇鈉等；所用溶劑可以是，例如，酰胺化合物如N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮和N，N-二乙基甲酰胺，或醇類如甲醇；有機酸殘基可以是，例如，CH3COO等。
關(guān)于前述分子式[I]的化合物的各種藥學可接受的鹽的生產(chǎn)，分子式[I]的化合物的銨鹽和鉀鹽可通過，例如分子式[VII]的化合物，其中鈉原子變成銨基團或鉀原子，取代上述合成方法(i)、(ii)和(iii)中使用的分子式[VII]的化合物而得到；前述分子式[I]的化合物的不同陽離子鹽可以通過按需要使用離子交換樹脂將所述銨鹽和鉀鹽轉(zhuǎn)換成不同的陽離子鹽而得到。
包括分子式[II]的化合物在內(nèi)的用于本發(fā)明的上述分子式[I]的化合物特定地以以下分子為例子，本發(fā)明并不限于它們。












包含于本發(fā)明的近紅外熒光造影劑中的上述化合物在700-1300nm，特別是約700-900nm的近紅外區(qū)具有吸收和熒光，摩爾吸光系數(shù)不小于100,000。
只要本發(fā)明的近紅外熒光造影劑具有分子式[I]或[II]的化合物和/或其藥學可接受的鹽，且分子中具有3個或更多個，優(yōu)選為4個或更多個磺酸基團，它不受到特別的限制。該化合物或其鹽可以獨自或以組合形式包含于所述造影劑中。
具體地說，所述造影劑包括所述化合物或在溶劑，如注射用蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液等中懸浮或溶解的所述化合物。當需要時，可以加入藥學可接受的添加劑如載體、賦形劑等。這些添加劑含有如藥學可接受的電解質(zhì)、緩沖劑、洗滌劑以及調(diào)節(jié)滲透壓并提高穩(wěn)定性和溶解性的物質(zhì)(例如環(huán)糊精、脂質(zhì)體等)的物質(zhì)。在相關(guān)領(lǐng)域中常用的各種添加劑可以被使用。當本發(fā)明的近紅外熒光造影劑打算供藥用時，它優(yōu)選通過殺菌過程制備。
所述造影劑可以通過注射、噴霧或涂敷、血管內(nèi)(靜脈內(nèi)的、動脈內(nèi)的)、口服、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、囊內(nèi)或氣管內(nèi)給予。優(yōu)選地，該劑以水溶液劑、乳劑或混懸劑給予到血管中。
只要劑量使要最終診斷的部位能夠被檢測，本發(fā)明的近紅外熒光造影劑的劑量沒有特別地限制。它依賴于所使用的發(fā)出近紅外熒光的化合物的種類、給藥對象的年齡、體重和目標器官等而被適當?shù)卣{(diào)節(jié)。通常，劑量在0.1-100mg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選為0.5-20mg/kg體重，以所述化合物的量計。
除了人以外，本發(fā)明的造影劑可以被適當?shù)赜糜诟鞣N動物。給藥形式、途徑和劑量依賴于目標動物的體重和癥狀而被適當?shù)卮_定。
另外，在本發(fā)明中，上述分子中具有3個或更多個，優(yōu)選為4個或更多個磺酸基團的分子式[I]，特別是分子式[II]的化合物，傾向于顯著地積聚于腫瘤組織。利用這一特性，使用本發(fā)明的熒光造影劑，腫瘤組織能夠被特定地成像。另外，一系列所述化合物能夠長時間地存在于血管中，它們預期能被很好地用作血管造影術(shù)的造影劑。
本發(fā)明的熒光成像方法的特征是本發(fā)明的近紅外熒光造影劑的使用。該方法用已知方法實施，各個參數(shù)，如激發(fā)波長和所檢測的熒光波長，是依賴于要給予的近紅外熒光造影劑的種類和給藥目標而被適當?shù)卮_定以實現(xiàn)最佳的影像和評價。從給予測定目標的本發(fā)明的近紅外熒光造影劑到開始用本發(fā)明的熒光成像方法測定的時間花費依賴于所使用的近紅外熒光造影劑的種類和給藥目標而變化。例如，當該劑含有腫瘤成像用的分子式[1]的化合物時，間隔時間是給藥后約4-120小時。在分子式[II]的化合物情況中，間隔時間是給藥后約24-120小時。當間隔時間太短時，熒光太強以至于靶部位與其它部位不能被清楚地區(qū)分。當間隔時間太長時，所述造影劑可能從體內(nèi)被清除。當需要進行血管成像時，分子式[I]或[II]的化合物在給藥后立即或在其后約30分鐘后被檢測。
該方法通常包括以下步驟。
即，給予檢測目標本發(fā)明的近紅外熒光造影劑并將檢測目標暴露于來自激發(fā)光源的激發(fā)光。然后，來自近紅外造影劑的由所述激發(fā)光源導致的熒光用熒光檢測器檢測。
激發(fā)波長依賴于所使用的近紅外熒光造影劑而變化。只要所述化合物在近紅外區(qū)有效地發(fā)射熒光，它沒有限制。優(yōu)選地，使用具有較好生物傳輸能力的近紅外光。
所檢測的近紅外熒光的波長也依賴于所使用的造影劑而變化。概括而言，使用具有600-1000nm，優(yōu)選為700-850nm波長的激發(fā)光，檢測700-1000nm，優(yōu)選為750-900nm區(qū)的近紅外熒光。在這種情況中，激發(fā)光源可以是常規(guī)的激發(fā)光源，如各種激光(如離子激光器、染料激光器、半導體激光器)、鹵素光源、氙光源等。當需要時，可使用各種濾光片來得到最佳激發(fā)波長。同樣，可以使用各種濾光片來測定熒光，以僅得到來自所述近紅外熒光造影劑的熒光。
檢測到的熒光作為熒光信息進行數(shù)據(jù)處理并被用于產(chǎn)生能被記錄的熒光影像。熒光影像通過照射包括靶組織在內(nèi)的較大區(qū)域，用CCD相機檢測熒光并對得到的熒光信息進行影像處理而產(chǎn)生?；蛘?，可以使用光學CT設(shè)備，可以使用內(nèi)窺鏡，或者可以使用眼底照相機。
本發(fā)明的熒光成像方法使人們能夠目測全身疾病、腫瘤、血管等而不損傷活體。
本發(fā)明通過實施例和試驗實施例的方式進行詳細解釋，但本發(fā)明不限于這些實施例。在以下實施例和實驗例中的化合物序號與結(jié)構(gòu)式表示的化合物序號一致。其中在化合物序號后有標明“鉀鹽”、“鈣鹽”或“吡啶鹽”的符號的化合物(如化合物(29)K鹽)是指除了抗衡離子是鉀鹽、鈣鹽或吡啶鹽而不是鈉鹽之外與該化合物序號表示的化合物(鈉鹽)相同的化合物。例如，“化合物(31)K鹽”是指除了抗衡離子是鉀而不是鈉之外，與化合物(31)相同的化合物；“化合物(31)Ca鹽”是指除了抗衡離子是鈣而不是鈉之外，與化合物(31)相同的化合物；“化合物(31)吡啶鹽”是指除了抗衡離子是吡啶而不是鈉之外，與化合物(31)相同的化合物。
得到作為本發(fā)明的近紅外熒光造影劑的活性成分的化合物的合成方法在實施例中得到解釋。
以下合成方法主要由表1中列出的雜環(huán)季鹽化合物和表2和3中列出的dianyl化合物的反應(yīng)組成。
表1雜環(huán)季鹽化合物
表2 Dianyl化合物-1
表3 Dianyl化合物-2
實施例在以下實施例中，為方便起見，化合物用表1到3中的符號表示(如A1、Q1等)實施例1化合物(29)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q1(5g)中加入甲醇(100ml)、N，N-二甲基甲酰胺(25ml)、三乙胺(5.6ml)、dianyl化合物A1(1.83g)和乙酸酐(3ml)，混合物在室溫下攪拌4小時。加入三乙胺(2.2ml)和乙酸酐(2ml)，混合物在室溫下攪拌3小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(2g)在甲醇(15ml)中的溶液，接著在室溫下攪拌1小時。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加入水(20ml)溶解得到的粗晶體(3.5g)。加入乙酸鈉(1g)，然后加入甲醇(30ml)，接著攪拌1小時。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成3g化合物(29)。得到的化合物(29)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)780nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)243,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)802nm使用傅利葉變換紅外光譜儀(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化鉀壓片法測定得到的化合物(29)的紅外吸收光譜。檢測到以下峰。光譜如圖11所示。
IR(＜max(KBr))1414，1086，1037，995，889cm-1實施例2化合物(34)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q2(2.13g)中加入甲醇(20ml)，混合物冷至10℃。向其中加入dianyl化合物A2(0.75g)、三乙胺(4ml)和乙酸酐(2ml)，混合物攪拌20分鐘。加入乙酸酐(2ml)，混合物在10℃下攪拌4小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(2g)在少量甲醇中的溶液。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加水(7ml)溶解得到的粗晶體。加入甲醇(7ml)沉淀晶體。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成1.2g化合物(34)。得到的化合物(34)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)794nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)176,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)812nn實施例3化合物(6)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q3(9.5g)中加入甲醇(50ml)、三乙胺(7ml)、dianyl化合物A3(3.1g)和乙酸酐(3.9ml)，混合物在室溫下攪拌7小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(5g)在少量甲醇中的溶液?；旌衔锓胖眠^夜。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加水(30ml)溶解晶體。加入乙酸鈉(2g)，然后加入甲醇(30ml)。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥生成化合物(6)。
實施例4化合物(45)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q3(4.8g)中加入甲醇(50ml)、三乙胺(4ml)、dianyl化合物A4(1.7g)和乙酸酐(2ml)，混合物在室溫下攪拌3小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(4g)在少量甲醇中的溶液。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加水(10ml)溶解晶體。然后加入甲醇(10ml)。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并風干，生成1.6g化合物，除次甲基鏈上的取代基是-Cl而不是-SCH2CH2SO3Na外，該化合物與化合物(45)相同。
重復以上步驟，生成4.2g所述化合物。向其中加入水(30ml)、三乙胺(1.2ml)和2-巰基乙烷磺酸鈉(0.8g)，混合物在室溫下攪拌4小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(2g)在少量甲醇中的溶液。過濾收集生成的晶體，用甲醇(20ml)洗滌并風干，生成2.3g化合物(45)。得到的化合物(45)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)815nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)196,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)827nm實施例5化合物(2)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q3(4.7g)中加入甲醇(25ml)、三乙胺(2.8ml)、dianyl化合物A5(1.5g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物在室溫下攪拌1小時。向其中另外加入三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(1.5ml)，混合物在室溫下攪拌3.5小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(3g)在少量甲醇中的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加入水(15ml)溶解晶體。然后加入甲醇(15ml)。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成化合物(2)。
實施例6化合物(43)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q3(3.75g)中加入甲醇(25ml)、三乙胺(3.5ml)、dianyl化合物A6(1.95g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物在室溫下攪拌1小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(3.9g)在少量甲醇中的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?小時。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加入水(10ml)溶解晶體。加入乙酸鈉(2g)，然后加入甲醇(10ml)。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成1.8g化合物(43)。得到的化合物(43)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)773nm
摩爾吸光系數(shù)(H2O)204,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)789nm實施例7化合物(4)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q3(3.5g)中加入甲醇(20ml)、三乙胺(3.5ml)、dianyl化合物A7(1.2g)和乙酸酐(1.9ml)，混合物在室溫下攪拌10小時，然后放置過夜。混合物在加熱下在50℃攪拌5小時。加水(2ml)并濾除不溶物。向濾液中加入乙酸鈉(5g)在少量甲醇中的溶液?；旌衔镌谑覝叵聰嚢?0分鐘。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成化合物(4)。
實施例8化合物(31)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q4(3.5g)中加入甲醇(35ml)、三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(2ml)，攪拌下分批加入dianyl化合物A2(1.8g)，混合物在室溫下另外攪拌1小時。加入乙酸酐(2ml)，混合物在室溫下攪拌5小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(4g)在少量甲醇中的溶液。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加入水(10ml)溶解晶體。加入甲醇(10ml)，混合物在室溫下攪拌2小時。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成1.3g化合物(31)。得到的化合物(31)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)755nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)228,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)774nm使用傅利葉變換紅外光譜儀(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化鉀壓片法測定得到的化合物(31)的紅外吸收光譜。檢測到以下峰。光譜如圖12所示。
IR(vmax(KBr))1518，1183，1149，1111，995cm-1
實施例9化合物(41)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q1(12g)中加入甲醇(120ml)、三乙胺(13.6ml)、dianyl化合物A8(4.4g)和乙酸酐(2.4ml)，混合物攪拌30分鐘。加入乙酸酐(2.4ml)，混合物攪拌1.5小時，然后加入乙酸酐(2.4ml)，混合物在室溫下攪拌6小時。另外加入雜環(huán)季鹽化合物Q1(1g)、三乙胺(3ml)和乙酸酐(3ml)，混合物在室溫下攪拌2小時?；旌衔锓胖眠^夜。加入乙酸鈉(5g)，過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。加水(200ml)溶解得到的粗晶體。濾除不溶物并向濾液中加入乙酸鈉(10g)。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。向晶體中加入水(200ml)和三乙胺(10ml)，加入乙酸鈉(10g)在甲醇(10ml)中的溶液以生成晶體。重復該步驟兩次。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，生成9.7g化合物(41)。得到的化合物(41)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)811nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)230,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)822nm實施例10化合物(3)的合成根據(jù)實施例5，使用雜環(huán)季鹽化合物Q3和相應(yīng)的dianyl化合物，生成化合物(3)。
實施例11除了使用乙酸鉀(2g)而不是乙酸鈉(2g)以外，用與實施例1中化合物(29)的合成的相同方式合成與化合物(29)相同的化合物，除了其抗衡離子是鉀而不是鈉。在下文中，這一化合物指代為化合物(29)鉀鹽。獲得的化合物(29)鉀鹽在焰色試驗中顯示紫色。
最大吸收波長(H2O)780nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)254,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)800nm其它前面提到的化合物用與該實施例相同的方式處理，得到具有鉀抗衡離子而不是鈉的化合物。
這些具有鉀抗衡離子的化合物通過在相應(yīng)化合物序號后附加“K鹽”來與上述化合物區(qū)分開。
實施例12用與實施例11相同的方式，得到化合物(6)K鹽。得到的化合物(6)K鹽在焰色試驗中顯示紫色。
最大吸收波長(H2O)788nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)226,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)806nm實施例13用與實施例11相同的方式，得到化合物(2)K鹽。得到的化合物(2)K鹽在焰色試驗中顯示紫色。
最大吸收波長(H2O)743nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)266,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)762nm實施例14用與實施例11相同的方式，得到化合物(4)K鹽。得到的化合物(4)K鹽在焰色試驗中顯示紫色。
最大吸收波長(H2O)753nm
摩爾吸光系數(shù)(H2O)212,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)767nm實施例15用與實施例11相同的方式，得到化合物(3)K鹽。得到的化合物(3)K鹽在焰色試驗中顯示紫色。
最大吸收波長(H2O)751nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)241,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)767nm實施例16化合物(6)K鹽(50mg)溶于少量水中并通過離子交換樹脂將化合物(6)K鹽的鉀轉(zhuǎn)化成質(zhì)子。向其中加入用乙酸鈉飽和的甲醇以沉淀晶體。重復該過程兩次。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，得到化合物(6)(32mg)。得到的化合物(6)在焰色試驗中顯示黃色。
使用傅利葉變換紅外光譜儀(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化鉀壓片法測定得到的化合物(6)的紅外吸收光譜。檢測到以下峰。光譜如圖13所示。
IR(vmax(KBr))1395，1372，1188，1102，1020cm-1實施例17化合物(54)的合成向雜環(huán)季鹽化合物Q4(3.5g)中加入甲醇(20ml)、三乙胺(3.5ml)和乙酸酐(2ml)，攪拌下分批加入dianyl化合物A1(1.4g)，混合物另外攪拌20分鐘。加入乙酸酐(1ml)，混合物在室溫下攪拌1.5小時。濾除不溶物，向濾液中加入乙酸鈉(4g)在少量甲醇中的溶液。過濾收集生成的晶體并用少量甲醇洗滌。將晶體溶于少量水中。然后溶液用甲醇(10ml)稀釋，混合物在室溫下攪拌1小時。過濾收集生成的晶體，用少量甲醇洗滌并干燥，得到1.5g化合物(54)。得到的化合物(54)在焰色試驗中顯示黃色。
最大吸收波長(H2O)743nm摩爾吸光系數(shù)(H2O)244,000最大熒光發(fā)射波長(H2O)766nm使用傅利葉變換紅外光譜儀(VALOR-III，JASCO制造)，用溴化鉀壓片法測定得到的化合物(54)的紅外吸收光譜。檢測到以下峰。光譜如圖14所示。
IR(vmax(KBr))1511，1421，1099，1004，926cm-1實驗例1測定了化合物(29)、化合物(43)、化合物(45)、化合物(31)、化合物(3)K鹽、化合物(11)[NK-3261，來自NipponKankoh-Shikiso Kenkyusho CO.、LTD.]、化合物(6)K鹽、化合物(2)K鹽、化合物(4)K鹽、化合物(34)和化合物(54)的正丁醇/水分配系數(shù)(logPo/w)。
作為對照化合物，所用的是分子中只具有2個磺酸基團的NK-1967(Nippon Kankoh-Shikiso Kenkyusho CO.，LTD.)和ICG(TokyoKasei Kogyo)。結(jié)果列于表4。
表4
實驗例2熒光成像試驗(1)小鼠結(jié)腸癌(結(jié)腸26癌)的腫瘤組織碎片被皮下移植到BALB/c裸鼠(5周大，Clea Japan，Inc.)左肺。10天后當腫瘤長到直徑約8厘米時，此裸鼠用于試驗。
鈦藍寶石激光被用作熒光激發(fā)光源。使用環(huán)形光導向設(shè)備(Sumita Optical Glass Co.)，試驗小鼠被均勻地暴露于激光中，其中光照的分散作用在10％以內(nèi)。光照功率輸出被調(diào)節(jié)到在小鼠皮膚表面附近約為40μW/cm2。在各化合物的最大激發(fā)波長下激發(fā)熒光，來自小鼠的熒光發(fā)射通過短波長截止濾光片(IR84，IR86，IR88，F(xiàn)ujiPhoto Film CO.，LTD)用CCD相機(C4880，Hamamatsu PhotonicsK.K.)檢測并照相。選擇截止濾光片以適合于化合物的激發(fā)波長。暴露時間依賴于各化合物的熒光強度而調(diào)節(jié)。
所用的測試化合物是本發(fā)明的化合物(29)、化合物(31)和化合物(6)K鹽，以及作為對照化合物的分子中只具有2個磺酸基團的NK-1967和ICG。各測試化合物(0.5mg/ml)溶于蒸餾水中并經(jīng)尾靜脈給予小鼠?；衔?31)、化合物(6)K鹽、NK-1967和ICG的劑量是5.0mg/Kg，化合物(29)的劑量是0.5mg/Kg。給予化合物24小時后，小鼠用乙醚麻醉，小鼠整個身體的熒光影像被拍攝下來。結(jié)果如圖1到5所示。
與具有2個磺酸基團的對照化合物(具有苯并三羰花青結(jié)構(gòu)的NK-1967和具有三羰花青結(jié)構(gòu)的ICG)相比，具有苯并三羰花青結(jié)構(gòu)和6個磺酸基團的化合物(29)和兩者均具有三羰花青結(jié)構(gòu)和4個磺酸基團的化合物(6)K鹽和化合物(31)明顯產(chǎn)生清楚的腫瘤影像。特別地，化合物(29)即使在低劑量時也能清楚的描繪出腫瘤并顯著地有效。
實驗例3熒光成像試驗(2)本試驗使用裸鼠。在用七氟醚連續(xù)吸入麻醉下，本發(fā)明的化合物(29)和對照化合物ICG以5.0mg/Kg的劑量從尾靜脈被注入。同時，開始間歇地拍攝熒光影像。為了拍攝熒光影像，進行暴露于激發(fā)激光并通過濾光片提取熒光，其中暴露時間是1秒鐘。給予化合物20秒后，血管被適當?shù)爻上瘛Ｅ臄z熒光影像直到給藥5分鐘后。圖6到9顯示了小鼠給藥20秒和5分鐘后的整個身體的熒光影像。
ICG不能在5分鐘后選擇性地顯示血管，而化合物(29)能夠使血管成像的時間長于ICG。
實驗例4在血管中的停留用實驗例2中相同的方式，腫瘤組織碎片被移植到CDF1小鼠(雌性，5周大，日本SLC，Inc.)，約2周后當腫瘤長到直徑約1厘米時，小鼠用于試驗測試。
測試的化合物是具有苯并三羰花青結(jié)構(gòu)和6個磺酸基團的化合物(29)K鹽和化合物(41)K鹽，具有三羰花青結(jié)構(gòu)和4-5個磺酸基團的化合物(6)K鹽、化合物(4)K鹽、化合物(45)K鹽、化合物(31)、化合物(31)K鹽、化合物(3)K鹽、化合物(2)K鹽、化合物(43)K鹽和化合物(11)，以及對照化合物ICG和NK-1967。各測試化合物溶于蒸餾水中(0.5mg/ml)使用。得到的各化合物的溶液從小鼠尾靜脈注入(0.5mg/Kg)。在給藥0.5、1、4和24小時后從小鼠取血并離心出血漿。
血漿的熒光強度通過熒光分光光度計(RF 5300 PC，SHIMADZUCORPORATION)測定。作出各化合物的校正曲線，計算血漿中化合物的濃度。結(jié)果如圖10所示。
本發(fā)明的化合物長時間高濃度地保留在血漿中。
實驗例5急性毒性研究了通過引入磺酸基團和轉(zhuǎn)化成鈉鹽降低毒性。
測試化合物列于表5中。
各化合物溶于蒸餾水中得到化合物的溶液。該溶液從尾靜脈靜脈注射入有知覺的小鼠。給藥后，小鼠被監(jiān)測3天，評估急性毒性[LD50(mg/Kg體重)]。結(jié)果列于表5。
表5

分子中磺酸基團數(shù)目的增加或轉(zhuǎn)化為鈉鹽導致急性毒性明顯下降。
本發(fā)明的近紅外熒光造影劑被激發(fā)光激發(fā)并發(fā)射近紅外熒光。該近紅外熒光在穿透生物組織方面較為優(yōu)越。因而，使測定活體深層部分的損傷成為可能。另外，發(fā)明的造影劑在水溶性和低毒性方面較為優(yōu)越，因而它能被安全地使用。
權(quán)利要求
1.分子式如下的鈉鹽
2.一種包括權(quán)利要求1的鈉鹽的近紅外熒光造影劑。
3.權(quán)利要求1和2的近紅外熒光造影劑，其用于腫瘤成像。
4.權(quán)利要求1和2的近紅外熒光造影劑，其用于血管造影術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子式如下的鈉鹽，以及包括該鈉鹽的近紅外熒光造影劑。所述近紅外熒光造影劑用于腫瘤成像和/或血管造影術(shù)。
文檔編號C07D401/14GK1515552SQ0215484
公開日2004年7月28日 申請日期1999年9月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月18日
發(fā)明者三輪直人, 史, 稻垣陸史, 明, 江口博明, 奧村正文, 文, 夫, 稻垣由夫, 原田徹 申請人:舍林股份公司, 富士膠片株式會社