專(zhuān)利名稱：提高轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，具體涉及一種提高轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá) 外源基因水平的方法。
背景技術(shù)：
目前應(yīng)用的昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)主要有兩個(gè)，一個(gè)以苜蓿尺蠖夜蛾核型 多角體病毒為載體，以秋粘蟲(chóng)細(xì)胞，菜青蟲(chóng)細(xì)胞或昆蟲(chóng)為宿主另一為以家蠶 核型多角體病毒為載體，以家蠶細(xì)胞或家蠶蟲(chóng)體及蛹體為表達(dá)宿主。兩個(gè)表達(dá) 系統(tǒng)都以各自病毒載體的多角體蛋白基因或P10基因或極早期基因IE-1等強(qiáng) 啟動(dòng)子為外源基因表達(dá)的調(diào)控元件，通過(guò)將外源目的基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子控制之 下的重組病毒感染宿主細(xì)胞，有重組桿狀病毒在宿主和細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)行大量復(fù) 制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物大量積累，在較短時(shí)間內(nèi)得 到髙效表達(dá)。與上述昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)相比，利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)外源基因有其 自身的優(yōu)勢(shì)(1) 翻譯后加工完善，天然活性髙且穩(wěn)定，可持續(xù)傳代，生產(chǎn)效率髙；(2) 通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)，整個(gè)過(guò)程中不涉及桿狀病毒，生物安全性相對(duì)提髙， 并且，外源基因整合進(jìn)細(xì)胞基因組，不會(huì)出現(xiàn)因病毒感染而影響細(xì)胞功能的現(xiàn) 象，因此，表達(dá)產(chǎn)物能夠得到更為有效的加工，如果借助無(wú)血清昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng) 技術(shù)和分泌表達(dá)技術(shù)，表達(dá)產(chǎn)物將非常容易純化。通常情況下，通過(guò)抗生素壓力篩選可以獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞。運(yùn)用G418篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)化細(xì)胞已有較多的報(bào)道，但通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆 蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因的報(bào)道并不多見(jiàn)。Jarvis等用攜帶neo標(biāo)記基因和ie-l(苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒的極早期基因)啟動(dòng)子控制e -半乳糖苷酶基因表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染sf-9細(xì)胞，通過(guò)G418壓力篩選，獲得轉(zhuǎn)化sf-9細(xì)胞純系，傳 代50次(約6個(gè)月)后的細(xì)胞仍保留整合的質(zhì)粒序列，傳代IOO次的細(xì)胞仍能表達(dá)同質(zhì)的e-半乳糖苷酶，但表達(dá)水平較低，約為桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)的1% (J Cell Biochem， 1990,42:181-191)。最近，Invitrogeii公司開(kāi)發(fā)了一種能在昆蟲(chóng)sf細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源基因的載 體pIZT/V5-His,該載體利用黃杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)核型多角體 病毒的ie-2啟動(dòng)子控制外源基因，通過(guò)Zeochi的抗性標(biāo)記篩選可獲得穩(wěn)定表 達(dá)外源基因的細(xì)胞系。鑒于利用轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因具有的優(yōu)越性，因此，獨(dú)立研發(fā)提 高穩(wěn)定轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因的水平的方法具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的是提供一種提髙轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的方法。 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 一種提高轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表 達(dá)外源基因水平的方法，包括以下具體步驟(1) 構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的載體；(2) 構(gòu)建帶有增強(qiáng)子元件en的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的帶有報(bào)告基因的載 體pigA3-en;(3) 雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的片段，克隆進(jìn) 同樣雙酶切的pigA3-en,得帶有增強(qiáng)子en和啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的載體；(4) 構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因neo的重組 載體；(5) 酶切步驟(4)所得載體，回收啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因的片段 Y-Neo,克隆進(jìn)同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因 表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的 重組轉(zhuǎn)基因載體(6) 將步驟(5)所得重組轉(zhuǎn)基因載體與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)?；旌?，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng) 細(xì)胞系，通過(guò)G418的分段篩選獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞，其中G418的終濃度為 800-2000fig/ml。上述技術(shù)方案中，昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子X(jué)和Y選自桿狀病毒的 極早期基因(ie-1)啟動(dòng)子、家蠶肌動(dòng)蛋白(actin) A3啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus)的CMV啟動(dòng)子、昆蟲(chóng)熱激蛋白(hsp)啟動(dòng)子中的一種， 啟動(dòng)子X(jué)和啟動(dòng)子Y可以相同也可以不同；所述的增強(qiáng)子元件en選自家蠶絲 素蛋白輕鏈基因第1內(nèi)含子序列一一fiben、桿狀病毒的同源區(qū)一一hr3en中的 一種報(bào)告基因可以為熒光蛋白基因；昆蟲(chóng)細(xì)胞可以是家蠶細(xì)胞或者其他昆蟲(chóng) 組織建立的細(xì)胞系。上述技術(shù)方案中所述輔助質(zhì)粒的選擇為該技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)的技術(shù)，該領(lǐng)域 技術(shù)人員可以根據(jù)最后獲得的具體轉(zhuǎn)基因載體選擇相應(yīng)的輔助質(zhì)粒。優(yōu)選的技術(shù)方案中，昆蟲(chóng)細(xì)胞為家蠶細(xì)胞，啟動(dòng)子為桿狀病毒的極早期基 因(ie-l)啟動(dòng)子和家蠶肌動(dòng)蛋白(actin) A3啟動(dòng)子中的一種。上述技術(shù)方案中，轉(zhuǎn)座子piggyBAC因子又稱IFP2，是目前應(yīng)用比較廣 泛的昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)座子，已被證實(shí)在多種昆蟲(chóng)中可以發(fā)揮轉(zhuǎn)座作用，可以通過(guò)轉(zhuǎn)座而 將外源基因重組整合到昆蟲(chóng)基因組中，但據(jù)研究所知，piggyBac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基 因家蠶細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因的水平較低(周文林等，蠶業(yè)科學(xué)，2007 ， 33(1):30-35),而且尚無(wú)用基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體提髙昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基 因細(xì)胞表達(dá)外源基因的方法的報(bào)道。上述技術(shù)方案中，增強(qiáng)子(enhaiicer)指增加同它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率的 DNA序列。增強(qiáng)子是通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增加轉(zhuǎn)錄的。有效的增強(qiáng)子可以位于基因 的5'端，也可位于基因的3'端，有的還可位于基因的內(nèi)含子中。增強(qiáng)子的 效應(yīng)很明顯， 一般能使基因轉(zhuǎn)錄頻率增加10 200倍，有的甚至可以髙達(dá)上千 倍。增強(qiáng)子的作用同增強(qiáng)子的取向無(wú)關(guān)，甚至遠(yuǎn)離耙基因達(dá)幾千kb也仍有增 強(qiáng)作用。本發(fā)明的基本原理為構(gòu)建帶有啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子 元件、啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體 后，與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)?；旌希D(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞系，通過(guò)G418的分段篩選， 由于G418對(duì)一般細(xì)胞有殺傷作用，而轉(zhuǎn)染的目的質(zhì)粒上帶有NEO抗藥基因， 因此最后可以獲得將外源基因整合入系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞；同時(shí)，為了提髙 轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞對(duì)外源基因的表達(dá)水平，在構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體的過(guò)程中，克隆進(jìn) 了增強(qiáng)子，并使用了 piggyBAC轉(zhuǎn)座子，而且G418也可以給轉(zhuǎn)染細(xì)胞壓力， 使外源基因不易在染色體復(fù)制的過(guò)程中丟失。為進(jìn)一步提髙昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對(duì)外源基因的表達(dá)水平，可以采用進(jìn)一步的 技術(shù)方案，將獲得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞克隆技術(shù)結(jié)合外源基因表達(dá)水平的實(shí) 際檢測(cè)，獲得外源基因高水平表達(dá)的工程細(xì)胞。本發(fā)明可以采用分泌表達(dá)并結(jié)合昆蟲(chóng)細(xì)胞無(wú)血清發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，制備表達(dá) 產(chǎn)物工藝簡(jiǎn)單，成本低。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1. 由于采用轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因，而沒(méi)有采用昆蟲(chóng)桿狀病毒表 達(dá)載體系統(tǒng)，因而可以實(shí)現(xiàn)外源基因的持續(xù)表達(dá)；表達(dá)產(chǎn)物無(wú)桿狀病毒污染、 生物安全性髙；表達(dá)產(chǎn)物后加工完善、天然性好。2. 本發(fā)明在轉(zhuǎn)入外源基因時(shí)增加了可用于壓力篩選的抗性基因，不僅提 高轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選效率，同時(shí)G418也可以給轉(zhuǎn)染細(xì)胞壓力，使外源基因不易 在染色體復(fù)制的過(guò)程中丟失。3. 本發(fā)明的技術(shù)方案、原理不同于 Jarvis ( J Cell Biochem， 1990,42:181-191)的技術(shù)原理，也不同于Invitrogen公司開(kāi)發(fā)的一種能在昆蟲(chóng) sf細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源基因載體pIZT/V5-His的技術(shù)原理，并將增強(qiáng)子元件引入 載體，使用了 piggyBAC轉(zhuǎn)座子，并通過(guò)細(xì)胞克隆技術(shù)，結(jié)合外源基因表達(dá)水 平的實(shí)際檢測(cè)，篩選得到外源基因髙水平表達(dá)的工程細(xì)胞。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例一一種提高轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞表達(dá)人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I方法(A3 啟動(dòng)子控制下的IGF-I 、絲蛋白輕鏈基因第1內(nèi)含子fiben、 IE-1啟動(dòng)子控制 的neo)，具體包括以下步驟1.人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I基因的制備根據(jù)業(yè)已公開(kāi)的人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I基因的cDNA序列(GenBank登 錄號(hào)M11568)，按常規(guī)人工合成人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I活性肽對(duì)應(yīng)的DNA 序列TGGATATCACCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcagttc gtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaa gcctgccaagtcagctTAAGCTTCTCGAGAT為了便于克隆表達(dá)和提高表達(dá)水平，在5'端引入起始密碼子ATG和 EcoRV的酶切位點(diǎn)，3'端引入終止密碼子TAA和Xho I的酶切位點(diǎn)。2. 構(gòu)建帶有cDNA基因的pBluescriptII SK(+)重組質(zhì)粒 將人工合成的DNA序列用EcoRV和Xho I雙酶切，常規(guī)法回收酶切片段，與用EcoRV和Xho I雙酶切的pBluescriptlISK(+)質(zhì)粒(Stratagene公 司產(chǎn)品)連接。T4DNA連接酶為GIBCO BRL公司產(chǎn)品，連接條件為16'C, 12小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1菌株，通過(guò)藍(lán)白斑培養(yǎng)篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子， 小批量提取質(zhì)粒DNA (參見(jiàn)《分子克隆》，1989，科學(xué)出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鑒定，有一條約230bp的片段被克隆，經(jīng)測(cè)序證明已成功克隆了 IGF-I基因，所獲得的重組質(zhì)粒稱之為pSK-IGF。3. A3啟動(dòng)子控制IGF-I基因的構(gòu)建根據(jù) pigA3GFP(參見(jiàn)Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，設(shè)計(jì)特異性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg)和A3-2(ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c), 以pigA3GFP為模板，常規(guī)PCR擴(kuò) 增出A3啟動(dòng)子(約210 bp),經(jīng)EcoR I 、 EcoRV雙酶切后克隆進(jìn)同樣雙酶 的pSK-IGF載體，獲重組pSK-A3-IGF載體。根據(jù)GenBank已公開(kāi)的序列(GenBank登錄號(hào)M76430)設(shè)計(jì)特異性引 物TPFib隱L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt "g cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta cce act gtc caa tec acc gtc)，以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出約 290 bp的片段，測(cè)序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，該片段經(jīng)Xho I 和Kpnl雙酶切后，與同樣酶切的pSK-A3-IGF載體連接，獲得重組載體 pSK-A3-IGF-polyA。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建根據(jù)已公開(kāi)的絲蛋白輕鏈基因的序列(GenBank登錄號(hào)M76430)設(shè)計(jì)物 異性弓l物TPFib-L-5 (cgg ata tct atg ggc tcc agt aac c)和TPFib-L-6 (gcg tcg acg gtc agg tta gat taa cgg g),以家蠶基因組DNA為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增， 獲得絲素輕鏈基因第l內(nèi)含子中具有增強(qiáng)子功能的約400bp左右的序列，Sal I 和EcoRV雙酶切后，克隆進(jìn)經(jīng)Sal I和Sma I雙酶切的PigA3GFP質(zhì)粒，獲 帶有增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3-fiben。5. 帶有增強(qiáng)子元件和A3啟動(dòng)子控制IGF- I外源基因的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建pSK-A3-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I雙酶切，回收A3控制IGF- I基 因的片段，克隆進(jìn)EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-fiben載體，獲得的新載 體命名為pigA3-A3-IGF-fiben6. 構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體以家蠶核型多角體病毒的DNA為模板，用IE-1基因啟動(dòng)子的特異性引物 對(duì)(5'ttc gaa ttc gat ttg cag "c ggg ac3', 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3') 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用EcoRl 、 EcoRV雙酶切后，克隆在 pBluescriptnSK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子的載 體pSK隱IE。以pcDNA3.1載體(Invitrogen公司產(chǎn)品)為模板，以Neol (5'ctg ata tea tga "g aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c30為 引物，PCR擴(kuò)增出neo基因的編碼序列及其下游的polyA信號(hào)序列(約1,1 kb), 經(jīng)EcoRV、 Xho I酶切消化后，克隆進(jìn)經(jīng)過(guò)同樣處理的pSK-IE載體中，獲得 pSK-IE-Neo載體。7. 構(gòu)建帶有A3控制IGF- I表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因(neo) 和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3-A3-IGF-fiben質(zhì)粒，獲的重質(zhì)粒 命名為pigA3-A3-IGF-fiben-neo。8. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選采用常規(guī)脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別取二個(gè)eppendorf管，A管加 入重組質(zhì)粒pigA3-A3-IGF-fiben-neo 2fig,輔助質(zhì)粒helper 4pg(參見(jiàn)Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-deHved vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培養(yǎng)基(FBSFree)將總體積補(bǔ)至50^L,混勻 備用。B管加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofection) 10 ^L，以TC-100培養(yǎng)基(FBS Free)將總體積補(bǔ)至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min后轉(zhuǎn)染Bm-N 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染第4天，添加G418至終濃度1000Hg/mL,篩選培養(yǎng)l個(gè)月后，添 加G418至終濃度1，500ng/mL,繼續(xù)篩選2個(gè)月，獲轉(zhuǎn)IGF-I基因的細(xì)胞。9.克隆髙水平表達(dá)IGF- I的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞方法獲得的轉(zhuǎn)IGF- I基因細(xì)胞系通過(guò)極度稀釋分注到96孔板，倒置熒光顯微 鏡觀察尋找僅有一個(gè)熒光細(xì)胞的孔，注入正常的Bm-N細(xì)胞培養(yǎng)1周，添加 G418至終濃度lOOOjig/mL,篩選培養(yǎng)1個(gè)月后，添加G418至終濃度 1，500jig/mL,繼續(xù)篩選2個(gè)月，獲得克隆細(xì)胞株，對(duì)克隆細(xì)胞株進(jìn)行ELISA 檢測(cè)，篩選出髙水平(4pg/mL)表達(dá)IGF-I的克隆細(xì)胞，即工程細(xì)胞。實(shí)施例二 一種提髙轉(zhuǎn)基因草地夜蛾Sf細(xì)胞表達(dá)人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落 刺激因子的方法(A3啟動(dòng)子控制下的hGM-CSF、絲蛋白輕鏈第1內(nèi)含子fiben、 IE-l控制的neo),具體步驟包括1. 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的制備人的T-淋巴樣細(xì)胞系細(xì)胞100 mg,加液氮磨碎，加入GIBCOBRL公司 生產(chǎn)Trozol RNA提取液lmL,輕輕搖動(dòng)10分鐘后加入500 U L氯仿，在室溫 下放置10分鐘，12 OOOrpm離心10分鐘，取上清，加入2倍上清體積的100% 冷乙醇，混勻后，12 OOOrpm離心10分鐘，棄上清，加入反轉(zhuǎn)錄酶及4dNTPs 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，37'C, l小時(shí)，獲得由mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA。將獲得的 cDNA , 加入 hGM-CSF 基因的上游引物 (tggatatcACCATGGGCatgtggctgcagagcctgc ， atctcgagaagcttatcactcctggac tggctccc，)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度約為450 bp的hGM-CSF的cDNA片段。2. 構(gòu)建帶有hGM-CSF基因的pBluescriptn SK(+)重組質(zhì)粒獲得的hGM-CSF的cDNA片段用EcoRV和Xho I雙酶切，常規(guī)法回收 酶切片段，與用 EcoRV和 Xho I雙酶切的 pBluescriptll SK(+)質(zhì)粒 (Stratagene公司產(chǎn)品)連接。T4 DNA連接酶為GIBCO BRL公司產(chǎn)品，連 接條件為16'C, 12小時(shí)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGI菌株，通過(guò)藍(lán)白斑培養(yǎng)篩選獲得重組轉(zhuǎn)化子， 小批量提取質(zhì)粒DNA (參見(jiàn)《分子克隆》，1989,科學(xué)出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鑒定，有一條約450bp的片段被克隆，經(jīng)測(cè)序證明已成功克隆了 hGM-CSF基因，所獲得的重組質(zhì)粒稱之為pSK-hGM-CSF。3. A3啟動(dòng)子控制hGM-CSF基因的構(gòu)建根據(jù) pigA3GFP(參見(jiàn)Cary, L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，設(shè)計(jì)特異性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg， ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增出 A3啟動(dòng)子(約210 bp),經(jīng)EcoRl 、 EcoRV雙酶切后克隆進(jìn)同樣雙酶切的 pSK-hGM-CSF載體，獲重組pSK-A3-hGM-CSF載體。根據(jù)GenBank已公開(kāi)的序列(GenBank登錄號(hào)M76430)設(shè)計(jì)特異性引 物TPFib-L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta ccc act gtc caa tec acc gtc)，以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出約 290 bp的片段，測(cè)序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，該片段經(jīng)Xho I 和KpnI雙酶切后，與同樣酶切的pSK-A3-hGM-CSF載體連接，獲得重組載 體pSK國(guó)A3-hGM-CSF-polyA。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強(qiáng)子元件fibeii的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因 載體構(gòu)建同實(shí)施例一中步驟4。5. 帶有增強(qiáng)子元件fiben和A3啟動(dòng)子控制hGM-CSF外源基因的轉(zhuǎn)基因 載體的構(gòu)建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆進(jìn)EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-fiben載體，獲得的新載體命名為pigA3-A3-hGM-CSF-fiben。6. 構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體同實(shí)施例一中步驟6。7. 構(gòu)建帶有A3控制hGM-CSF表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因(neo) 和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoRl酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-fiben質(zhì)粒，獲的 重質(zhì)粒命名為pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo。8. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選采用常規(guī)脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別取二個(gè)eppendorf管，A管加 入重組質(zhì)粒pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo 2pg，輔助質(zhì)粒helper 4pg (參見(jiàn) Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培養(yǎng)基(FBSFree)將總體積補(bǔ)至50 |iiL,混勻 備用。B管加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofection) 10 pL,以TC-100培養(yǎng)基(FBS Free)將總體積補(bǔ)至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min后轉(zhuǎn)染草地 夜蛾Sf細(xì)胞。轉(zhuǎn)染第4天，添加G418至終濃度lOOOpg/mL,篩選培養(yǎng)1個(gè) 月后，添加G418至終濃度1，500ng/mL,繼續(xù)篩選2個(gè)月，獲轉(zhuǎn)hGM-CSF基 因的細(xì)胞。9. 克隆髙水平表達(dá)hGM-CSF的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞獲得的轉(zhuǎn)hGM-CSF基因細(xì)胞通過(guò)極度稀釋分注到96孔板，倒置熒光顯 微鏡觀察尋找僅有一個(gè)熒光細(xì)胞的孔，注入正常的sf細(xì)胞培養(yǎng)1周，添加G418 至終濃度lOOO^ig/mL,篩選培養(yǎng)l個(gè)月后，添加G418至終濃度l，500ng/mL， 繼續(xù)篩選2個(gè)月，獲得克隆細(xì)胞株，對(duì)克隆細(xì)胞株進(jìn)行ELISA檢測(cè)，篩選出 髙水平(5pg/mL)表達(dá)hGM-CSF的克隆細(xì)胞，即工程細(xì)胞。實(shí)施例三 一種提高轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞表達(dá)hGM-CSF的方法(A3啟動(dòng)子 控制下的hGM-CSF、 hr3的en、 IE-1控制的neo),具體包括下列步驟1. 人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子基因的制備 同實(shí)施實(shí)例二中步驟1。2. 構(gòu)建帶有hGM-CSF基因的pBluescriptII SK(+)重組質(zhì)粒 同實(shí)施實(shí)例二中步驟2。3. A3啟動(dòng)子控制hGM-CSF基因的構(gòu)建 同實(shí)施實(shí)例二中步驟3。4. 帶有hr3增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank登錄號(hào)L33180的公開(kāi)序列設(shè)計(jì)引物，以家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的基因組DNA為模板，以TPhr3-l(ctg gta ccg ccg tgc cca gtc acg tgt acg cc)和TPhr3隱2 (etc ccg ggg tga aca gcc cat tcg agg c) 為弓l物， 常規(guī)PCR擴(kuò)增，獲得家蠶核多角體病毒(BmNPV)同源區(qū)序列(homologous region)的hr3中具有增強(qiáng)子功能的約740 bp左右的序列，Kpn I和Sma I雙 酶切后，克隆進(jìn)經(jīng)Kpn I和Sma I雙酶切的PigA3GFP質(zhì)粒，獲帶有hr3增 強(qiáng)子元件的基于PiggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體，命名為pigA3-hr3en。5. 帶有增強(qiáng)子元件hr3和A3啟動(dòng)子控制hGM-CSF外源基因的轉(zhuǎn)基因載 體的構(gòu)建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆進(jìn)EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-hr3en載體， 獲得的新載體命名為pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en6. 構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體同實(shí)施例一中步驟6。7. 構(gòu)建帶有A3控制hGM-CSF表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因(neo) 和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en質(zhì)粒，獲的 重質(zhì)粒命名為pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo。8. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選同實(shí)施實(shí)例二中步驟8，所不同的是pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo被pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo所取代，細(xì)胞使用家蠶Bm-N細(xì)胞。 9.克隆髙水平表達(dá)hGM-CSF的轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞方法同實(shí)施實(shí)例二中步驟9。不同的是通過(guò)極度稀釋和ELISA實(shí)際檢測(cè) 獲得髙水平(5jig/mL)表達(dá)hGM-CSF的轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞。實(shí)施例四 一種提高轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞表達(dá)IGF- I的方法(IE啟動(dòng)子控制 下的IGF-I、 hr3增強(qiáng)子、IE-l控制的neo),具體包括以下步驟1. 人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I基因的制備 同實(shí)施例一中步驟1。2. 構(gòu)建帶有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重組質(zhì)粒 同實(shí)施例一中步驟2。3. IE啟動(dòng)子控制IGF-I基因的構(gòu)建根據(jù)GenBank登錄號(hào)L33180的公開(kāi)序列，以家蠶核型多角體病毒的DNA 為模板，用IE-1基因啟動(dòng)子的特異性引物(5'ttc gaa ttc gat ttg cag ttc ggg ac3'， 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3')進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物用 EcoRl、 EcoRV雙酶切后，克隆進(jìn)同樣雙酶的pSK-IGF載體，獲重組 pSK-IE-IGF載體。根據(jù)GenBank登錄號(hào)M76430的公開(kāi)序列，設(shè)計(jì)特異性引物TPFib-L-3 (ggc tcg agc aaa "g tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 ( gcg gta ccc act gtc caa tec accgtc),以家蠶菁松品種的基因組DNA為模板，擴(kuò)增出約290 bp的片段， 測(cè)序證明為絲素輕鏈基因的polyA信號(hào)序列，該片段經(jīng)Xho I和Kpn I雙酶 切后，與同樣酶切的pSK-IE-IGF載體連接，獲得重組載體pSK-IE-IGF-polyA。4. 帶有hr3增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建 同實(shí)施例三中步驟4。5. 帶有增強(qiáng)子元件和IE啟動(dòng)子控制IGF- I外源基因的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建pSK-IE-IGF-polyA用EcoR I和Kpnl雙酶切，回收IE啟動(dòng)子控制 IGF-I基因的片段，克隆進(jìn)EcoR I和Kpn I雙酶切的pigA3-hr3en載體，獲 得的新載體命名為pigA3-IE-IGF-hr3en6. 構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒IE-1基因啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因 neo的重組載體同實(shí)施例一中步驟6。7. 構(gòu)建帶有IE控制IGF- I表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因(neo) 和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體pSK-IE-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有IE啟動(dòng)子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3-IE-IGF-hr3en質(zhì)粒，獲的重質(zhì)粒 命名為pigA3-IE-IGF-hr3en-neo。8. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選同實(shí)施例一中步驟8。所不同的是這里使用了 pigA3-IE-IGF-hr3en-neo 替代pigA3-A3-IGF-fiben-neo。9. 克隆高水平表達(dá)IGF的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞方法 同實(shí)施例一中步驟9。實(shí)施例五 一種提髙轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞表達(dá)IGF- I的方法(A3啟動(dòng)子控制 下的IGF- I 、絲蛋白輕鏈第1內(nèi)含子fiben、 A3控制的neo)，具體包括下列 步驟1. 人胰島素樣生長(zhǎng)因子-I基因的制備 同實(shí)施例一中步驟1。2. 構(gòu)建帶有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重組質(zhì)粒 同實(shí)施例一中步驟2。3. A3啟動(dòng)子控制IGF-I基因的構(gòu)建 同實(shí)施例一中步驟3。4. 帶有絲蛋白輕鏈增強(qiáng)子元件的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建同實(shí)施例一中步驟4。5. 帶有增強(qiáng)子元件和A3啟動(dòng)子控制IGF- I外源基因的轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建同實(shí)施例一中步驟5。6. 構(gòu)建帶有家蠶核型多角體病毒A3啟動(dòng)子控制新霉素抗性基因iieo的 重組載體根據(jù) pigA3GFP(參見(jiàn)Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989, 172:156-69)的 序列，設(shè)計(jì)特異性引物A3-l "ag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg, ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP為模板，常規(guī)PCR擴(kuò)增出 A3啟動(dòng)子(約210 bp),經(jīng)EcoRl 、 EcoRV雙酶切后克隆進(jìn)同樣雙酶切的 pBhiescriptllSK(+)載體，獲得帶有家蠶核型多角體病毒A3啟動(dòng)子的載體 pSK-A3。以pcDNA3.1載體(Invitrogen公司產(chǎn)品)為模板，以Neol (5'ctg ata tea tga ttg aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c3')為 引物，PCR擴(kuò)增出neo基因的編碼序列及其下游的polyA信號(hào)序列(約1.1 kb)， 經(jīng)EcoRV、 Xho I酶切消化后，克隆進(jìn)經(jīng)過(guò)同樣處理的pSK-A3載體中，獲 得pSK-A3-Neo載體。7. 構(gòu)建帶有A3控制IGF- I表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、新霉素抗性基因(neo) 和熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體pSK-A3-Neo載體用EcoR I酶切，回收帶有A3啟動(dòng)子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆進(jìn)同樣酶切的pigA3-A3-IGF-fiben質(zhì)粒，獲的重質(zhì)粒 命名為pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo。8. 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選釆用常規(guī)脂質(zhì)體介導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。分別取二個(gè)eppendorf管，A管加 入重組質(zhì)粒pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo 2pg，輔助質(zhì)粒helper 4pg (參見(jiàn) Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori Lu using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84)，以TC-100培養(yǎng)基(FBSFree)將總體積補(bǔ)至50nL，混勻 備用。B管加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Lipofection) 10 jiL，以TC-100培養(yǎng)基(FBS Free)將總體積補(bǔ)至50 pL，將A、 B 二管混勻，室溫靜置30 min后轉(zhuǎn)染Bm-N 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染第4天，添加G418至終濃度1000jig/mL，篩選培養(yǎng)l個(gè)月后，添加G418至終濃度1，500ftg/mL,繼續(xù)篩選2個(gè)月，獲轉(zhuǎn)IGF-I細(xì)胞系。 9.克隆髙水平表達(dá)IGF-1的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞方法 方法同實(shí)施實(shí)例一中步驟9。
權(quán)利要求
1. 一種提高轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的方法，包括以下具體步驟(1)構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的載體；(2)構(gòu)建帶有增強(qiáng)子元件en的基于piggyBAC轉(zhuǎn)座子的帶有報(bào)告基因的載體pigA3-en；(3)雙酶切步驟(1)所得載體，回收啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的片段，克隆進(jìn)同樣雙酶切的pigA3-en，得帶有增強(qiáng)子en和啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因的載體；(4)構(gòu)建昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因neo的重組載體；(5)酶切步驟(4)所得載體，回收啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因的片段Y-Neo，克隆進(jìn)同樣酶切的步驟(3)所得載體，得到帶有啟動(dòng)子X(jué)控制外源基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子Y控制新霉素抗性基因、熒光蛋白報(bào)告基因的重組轉(zhuǎn)基因載體；(6)將步驟(5)所得重組轉(zhuǎn)基因載體與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒混合，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞系，通過(guò)G418的分段篩選獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提髙轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的 方法，其特征在于所述昆蟲(chóng)細(xì)胞為家蠶細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提髙轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的 方法，其特征在于所述增強(qiáng)子元件選自家蠶絲素蛋白輕鏈基因第1內(nèi)含子序 列或桿狀病毒的同源區(qū)中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提髙轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的 方法，其特征在于所述昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子選自桿狀病毒的極早期 基因IE-1啟動(dòng)子，也可以為家蠶肌動(dòng)蛋白A3啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒的CMV啟 動(dòng)子、昆蟲(chóng)熱激蛋白啟動(dòng)子中的一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提髙轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)外源基因水平的 方法，其特征在于將步驟(6)所得的轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞克隆技術(shù)，結(jié)合 外源基因表達(dá)水平的實(shí)際檢測(cè)，獲得表達(dá)外源基因的工程細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)外源基因的方法，將在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)具有活性的啟動(dòng)子控制的新霉素抗性基因表達(dá)盒、增強(qiáng)子元件和外源基因表達(dá)盒通過(guò)基因操作克隆進(jìn)以轉(zhuǎn)座子piggyBAC因子為基礎(chǔ)的帶有報(bào)告基因的載體，然后與表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒混合轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞系，通過(guò)G418的分段篩選獲得轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞。該轉(zhuǎn)基因細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞克隆技術(shù)，結(jié)合外源基因表達(dá)水平的實(shí)際檢測(cè)獲得外源基因高水平表達(dá)的工程細(xì)胞。本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因昆蟲(chóng)細(xì)胞高水平持續(xù)表達(dá)外源基因，表達(dá)產(chǎn)物無(wú)桿狀病毒污染，生物安全性高，后加工完善，天然性好。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101270366SQ200810025299
公開(kāi)日2008年9月24日 申請(qǐng)日期2008年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者周文林, 曹廣力, 沈衛(wèi)德, 薛仁宇, 貢成良 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)