楊樹(shù)耐鹽基因PtoeIF5A1的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種楊樹(shù)耐鹽基因PtoeIF5A1的應(yīng)用。本發(fā)明公開(kāi)了如下任一物質(zhì)在提高植株耐鹽性中的應(yīng)用：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白質(zhì)；（2）SEQ?ID?No.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因；（3）含有（2）的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。PtoeIF5A1基因有耐受高鹽的能力，該基因在使用基因工程手段提高林木或者作物耐鹽方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】楊樹(shù)耐鹽基因PtoelF5A1的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種楊樹(shù)耐鹽基因PtoeIF5Al的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]eIF5A是在真核生物中廣泛存在的一類(lèi)蛋白質(zhì)，研究表明，eIF5A是唯一含有羧腐胺賴(lài)氨酸(hypusine)殘基的蛋白質(zhì)。進(jìn)化分析顯示，eIF5A在各物種間高度保守。實(shí)驗(yàn)表明，eIF5A參與了細(xì)胞的多項(xiàng)生理活動(dòng)，如細(xì)胞增殖、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞衰老與凋亡等。在酵母體內(nèi)，當(dāng)eIF5A功能受到抑制或缺失時(shí)，部分蛋白合成減少。eIF5A的活性受到抑制時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)延緩或停滯。
[0003]植物中eIF5A確切的生物學(xué)功能還不明確。Thompson等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中存在3個(gè)表達(dá)特征不同的 eIF5A 編碼基因，AteIF5Al, AteIF5A2 和 AteIF5A3。Western Blotting分析表明，AteIF5Al只在衰老組織中表達(dá)，AteIF5A2在受機(jī)械損傷的組織中高水平表達(dá)，而AteIF5A3在細(xì)胞分裂很活躍的吸脹的種子中高水平表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種楊樹(shù)耐鹽基因PtoeIF5Al的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供了如下任一物質(zhì)在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用:
[0006](I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白質(zhì)；
[0007](2) SEQ ID N0.2所不蛋白質(zhì)的編碼基因；
[0008](3)含有(2)的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
[0009]上述應(yīng)用中，所述SEQ ID N0.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ ID N0.1所示。
[0010]上述任一所述的應(yīng)用中，所述耐鹽性為耐NaCl的性質(zhì)。
[0011]上述任一所述的應(yīng)用中，所述提高植物耐鹽性是指所述植物在含NaCl條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)好；和/或，在含NaCl條件下的種子萌發(fā)率高；
[0012]所述生長(zhǎng)狀態(tài)好是指所述植物的葉片較大、顏色較綠；
[0013]上述任一所述的應(yīng)用中，所述植物為擬南芥。
[0014]一種制備耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性增強(qiáng)。
[0015]上述方法中，所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PBI121的多克隆位點(diǎn)得到的。
[0016]上述任一所述的方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性增強(qiáng)是指所述轉(zhuǎn)基因植物在含NaCl條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)好于出發(fā)植物在含NaCl條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)；和/或，轉(zhuǎn)基因植物的種子在含NaCl條件下的萌發(fā)率高于出發(fā)植物在含NaCl條件下的萌發(fā)率。
[0017]所述NaCl 的濃度為 150mM-175mM。
[0018]上述任一所述的方法中，所述植物為擬南芥。[0019]上述任一所述的方法中，所述耐鹽性為耐NaCl的性質(zhì)。
[0020]本發(fā)明證明了 PtoeIF5Al基因有耐受高鹽的能力，該基因在使用基因工程手段提高林木或者作物耐鹽方面具有應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為Western-Blotting檢測(cè)PtoeIF5Al蛋白在轉(zhuǎn)基因擬南芥TO代植株以及對(duì)照擬南芥TO代植株中的表達(dá)。
[0022]圖2為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PtoeIF5Al基因的表達(dá)。
[0023]圖3為T(mén)2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥以及T2代純合轉(zhuǎn)空載體pBI 121擬南芥的耐鹽性檢測(cè)以及PtoeIF5Al蛋白的Western-Blotting檢測(cè)。
[0024]圖4為種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0026]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027]塔形毛白楊CV-BJHR01 (Populus tomentosa Carr, cv ‘BJHR01’)在文獻(xiàn)“張利姣，張杰偉，陳亞娟，等.毛白楊真核細(xì)胞翻譯起始因子5A基因(PtoeIF5A4)的克隆與表達(dá)分析[J].Journal of Agricultural Biotechnology, 2013，21 (8):949-956.” 中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0028]擬南芥(Arabidopsisthaliana, Columbia ecotype)在文獻(xiàn)“InitiativeA G.Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsisthaliana[J].Nature, 2000, 408(6814):796-815.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0029]克隆載體pGEM-T easy購(gòu)自Promega公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為A1360。
[0030]pBSK-Ω-Flag載體(modified pBluescript vector)在文獻(xiàn)“Su T, Xu J, Li Y, etal.Glutathione-1ndole-3-acetonitrile is required for camalexin biosynthesis inArabidopsis thaliana[J].The Plant Cell, 2011，23 (I): 364-380.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0031]植物表達(dá)載體pBI121 在文獻(xiàn) “Su T, Xu J, Li Y, et al.Glutathione-1ndole-3-acetonitrile is required for camalexin biosynthesis in Arabidopsis thaliana[J].The Plant Cell, 2011，23(1):364-380.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0032]農(nóng)桿菌GV3101在文獻(xiàn)“Li J F，Li L, Sheen J.Protocol: a rapid and economicalprocedure for purification of plasmid or plant DNA with diverse applications inplant biology [J].Plant Methods, 2010, 6 (I): 1-8.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。
[0033] 0.5%TBST溶液:該溶液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為T(mén)ris-HCl緩沖液、溶質(zhì)為NaCl和Tween20 ;Tris_HCl緩沖液的濃度為50mM，NaCl在0.5%TBST溶液中的濃度為150mM，Tween20在0.5%TBST溶液中的體積百分含量為0.05%，溶液pH=7.5。
[0034]一抗:鼠抗Flag M2單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，使用時(shí)用0.5%TBST溶液將其稀釋10000倍。
[0035]二抗:辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，使用時(shí)用0.5%TBST溶液將其稀釋10000倍。
[0036]實(shí)施例1、pBSK- Ω -Flag_PtoeIF5Al 載體的構(gòu)建
[0037]一、選取生長(zhǎng)時(shí)間為3個(gè)月的塔形毛白楊CV-BJHROI幼苗的葉片，液氮速凍后提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
[0038]二、通過(guò)毛果楊基因組文庫(kù)(http:1l genome.jg1-psf.0rg/Poptrll/Poptrll.home, html)分析，獲取預(yù)測(cè)的毛白楊PtreIF5Al基因的全序列，在其非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物，以步驟一獲得的塔形毛白楊CV-BJHR01的cDNA (以下簡(jiǎn)稱(chēng)毛白楊cDNA)為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。
[0039]巢式PCR體系如下:
[0040]第一輪PCR:
[0041]體系:毛白楊cDNA2.0yL, 10ymol/L 的上下游引物各 IyL, 2.0U/L 的 PhusionDNA 聚合酶 0.2 μ L，2.5mmol/L 的 dNTPs 混合液 1.6 μ L，5 X HF Buffer4.0 μ L，ddH20 為10.2 μ L0
[0042]上游引物:5’-CCTCTCTGGTACTCTCTGTG-3’ ；
[0043]下游引物:5’ -GCAGAACGTTACTTAAATGGGC-3 ’。
[0044]PCR 條件:98°C 30s ；98°C 10s，55。。30s，72。。lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C總延伸 IOmin0`[0045]第二輪PCR:
[0046]體系:第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.0 μ L，10 μ mol/L的上下游引物各lyL，2.0U/L的Phusion DNA 聚合酶 0.2 μ L，2.5mmol/L 的 dNTPs 混合液 1.6 μ L，5XHF Buffer4.0yL,ddH20 為 10.2 μ L0
[0047]上游引物:5’-CTCTTGATCAATCGCCGCC-3’ ；
[0048]下游引物:5’ -CTACAACTATCAGCAGTCAACC-3 ’。
[0049]PCR 條件:98°C 30s ；98°C 10s，55。。30s，72。。lmin，72°C總延伸 10min，30 個(gè)循環(huán)。
[0050]三、第二輪PCR結(jié)束后，回收500bp的片段并連接到pGEM_T easy載體上，得到重組載體，將重組載體測(cè)序，結(jié)果正確，將此重組質(zhì)粒命名為PGEM-T easy-PtoeIF5Al。
[0051]四、設(shè)計(jì)引物克隆PtoeIF5Al的編碼區(qū)，在上游引物的5’端引入NdeI酶切位點(diǎn)。
[0052]引物序列如下:
[0053]上游引物PtoeIF5AlF:5’ -CATATGTCTGACGAGGAGCAT-3，
[0054]下游引物PtoeIF5AlR:5’ -TTACTTGGGGCCAATGTCC-3，
[0055](下劃線(xiàn)所示序列為酶切識(shí)別位點(diǎn))
[0056]五、以pGEM-T easy_PtoeIF5Al 質(zhì)粒為模板，以 PtoeIF5AlF 和 PtoeIF5AlR 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PtoeIF5Al基因，將基因片段與pGEM_T easy載體連接得到重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確。
[0057]PtoeIF5Al基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。PtoeIF5Al蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0058]六、用NdeI和SpeI (SpeI位點(diǎn)是pGEM_T easy載體上的位點(diǎn))雙酶切步驟五得到的重組載體，得到PtoeIF5Al基因片段；用NdeI和SpeI雙酶切pBSK- Ω -Flag載體，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到pBSK-Q-Flag-PtoeIF5Al重組質(zhì)粒。
[0059]七、XhoI和 SpeI 雙酶切 pBSK-Ω-Flag_PtoeIF5Al，得到 Flag-Ω-PtoeIF5Al 基因片段；XhoI和SpeI雙酶切PBI121，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到PBI121-Ω -Flag-PtoeIF5Al重組質(zhì)粒，將質(zhì)粒送測(cè)序，測(cè)序正確。
[0060]八、將pBI121-Q-Flag_PtoeIF5Al轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到重組菌，將重組菌提質(zhì)粒，送測(cè)序，結(jié)果證明重組菌正確。同時(shí)將空載體PBI121轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，得到對(duì)照重組菌。
[0061]實(shí)施例2、花芽浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥
[0062]擬南芥轉(zhuǎn)基因的方法采用Clough等人的花芽浸泡法，具體過(guò)程如下:
[0063]一、挑取實(shí)施例1得到的重組菌和對(duì)照重組菌單菌落分別接入5ml LB中(含Kan5O μ g/ml、Gent25 μ g/ml), 28°C 培養(yǎng)一天。
[0064]二、以體積比1:100將培養(yǎng)得到的菌液分別轉(zhuǎn)接到200ml含同樣抗生素的LB中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D_=1.0, 5000g室溫離心lOmin，將菌體沉淀分別重懸于200ml 1/2MS培養(yǎng)基中(含5(^/1蔗糖、20(^1/1 Silwet L-77)中，得到重組菌和對(duì)照重組菌懸液。
[0065]三、將待轉(zhuǎn)基因的擬南芥倒置，使蓮座葉以上的花序在步驟二得到的重組菌或?qū)φ罩亟M菌懸液中浸泡5min，期間輕微晃動(dòng)2-3次，分別得到轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥(以下簡(jiǎn)稱(chēng)轉(zhuǎn)基因擬南芥)和轉(zhuǎn)空載體PBI121的擬南芥(以下簡(jiǎn)稱(chēng)對(duì)照擬南芥)。
[0066]四、將轉(zhuǎn)基因擬南·芥和對(duì)照擬南芥植株水平放置于22°C環(huán)境中，用不透光的塑料袋封住盆缽，約16h后將其取出，豎直培養(yǎng)直至收獲轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照擬南芥的TO代種子，種子經(jīng)室溫干燥后備用。
[0067]實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選
[0068]一、用體積百分含量為70%的乙醇水溶液將轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照擬南芥TO代種子處理Imin,滅菌水洗2min,再用次氯酸鈉處理13min,然后用無(wú)菌水洗5次,每次2min,將處理后的種子置于4°C春化2-3天。
[0069]二、將春化后的種子均勻鋪于1/2MS篩選培養(yǎng)基上(10g/l鹿糖、50 μ g/ml Kan、8g/l瓊脂、ρΗ=5.7)，移入22°C培養(yǎng)箱(16hr光照，8hr黑暗，光照強(qiáng)度為80_100Lux)萌發(fā)。
[0070]三、約6天后轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗的葉片綠、根較長(zhǎng)，而對(duì)照擬南芥雖然也能在1/2MS篩選培養(yǎng)基上萌發(fā)，但是幼苗較同時(shí)期轉(zhuǎn)基因幼苗葉片黃、根很短。分別將轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照擬南芥的幼苗移入新的1/2MS瓊脂平板(1(^/1蔗糖、5(^8/1111 Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)上，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)4片葉子，將其移入土中生長(zhǎng)。
[0071]四、提取轉(zhuǎn)基因擬南芥TO代植株以及對(duì)照擬南芥TO代植株的總蛋白進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè)，一抗為鼠抗Flag M2單克隆抗體，該抗體可以與Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白結(jié)合，二抗為辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG，結(jié)果如圖1所示。
[0072]圖1中，Vector代表對(duì)照擬南芥TO代植株；1、2、3代表三株轉(zhuǎn)基因擬南芥TO代植株。
[0073]圖1表明，轉(zhuǎn)基因擬南芥TO代植株有Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白的表達(dá)，從而有19kD目的條帶的出現(xiàn)，而對(duì)照擬南芥TO代植株沒(méi)有目的條帶。
[0074]挑選轉(zhuǎn)基因擬南芥和對(duì)照擬南芥TO代植株收獲得到Tl代種子。
[0075]五、將對(duì)照擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代種子繼續(xù)種于1/2MS篩選培養(yǎng)基(10g/l蔗糖、50 μ g/ml Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)，選擇后代植株的抗性與非抗性按孟德?tīng)栆?guī)律發(fā)生分離(3:1)的群體,再用Western-Blotting鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代植株。
[0076]收獲鑒定為陽(yáng)性的對(duì)照擬南芥和轉(zhuǎn)基因擬南芥Tl代種子，通過(guò)抗性及蛋白檢測(cè)得到轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代植株，收獲轉(zhuǎn)基因擬南芥T2代種子，如果T2代種子在1/2MS篩選培養(yǎng)基上(10g/l蔗糖、50 μ g/ml Kan、8g/1瓊脂、pH=5.7)全部具有抗性，則對(duì)應(yīng)的T2代種子便是純合體；同樣通過(guò)抗性檢測(cè)得到對(duì)照擬南芥T2代植株，收獲對(duì)照擬南芥T2代種子，如果T2代種子在1/2MS篩選培養(yǎng)基上(10g/l蔗糖、50 μ g/mlKan、8g/l瓊脂、pH=5.7)全部具有抗性，則對(duì)應(yīng)的T2代種子便是純合體，通過(guò)此方法最終得到T2代純合轉(zhuǎn)空載體PBI121的擬南芥株系和T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系(PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2 和 PtoeIF5Al_0E3)。
[0077]實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的檢測(cè)
[0078]一、取實(shí)施例3獲得的T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3以及T2代純合轉(zhuǎn)空載體pBI121的擬南芥株系，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0079]二、分別以四種植株的cDNA為模板，用引物Fl和Rl對(duì)基因PtoeIF5Al的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)用引物PtoACT9-F和PtoACT9-R對(duì)內(nèi)參基因PtoACT9進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。一次平行試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用2_ΛΛετ計(jì)算各株系中PtoeIF5Al基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0080]其中Λ ACT= (CT Target — CT Actin) Time x — (CT Target — CT Actin) TimeO
[0081]Time x表示任意時(shí)間點(diǎn)，TimeO表示經(jīng)PtoACT9校正后I倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。
[0082]Target 代表 PtoeIF5Al 基因，Actin 代表內(nèi)參基因 PtoACT9。
[0083]實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物如下:
[0084]PtoeIF5Al基因檢測(cè)引物:
[0085]Fl:5’ -TGTCACTTCGTTGGGATTGA-3’ ；
[0086]Rl:5，-CAAGATCTTTCCCCTCACCA-3，；[0087]內(nèi)參基因PtoACT9檢測(cè)引物:
[0088]PtoACT9-F:5， -TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3，；
[0089]PtoACT9-R: 5，-AATCCACATCTGCTGGAAGG-3，。
[0090]結(jié)果如圖2所示，圖2中Vector代表T2代純合轉(zhuǎn)空載體pBI121的擬南芥株系；5-0Ε1、5-0Ε2和5-0E3分別代表三個(gè)T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5A1基因的擬南芥株系PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al-0E2 和 PtoeIF5Al_0E3。
[0091]圖2表明，轉(zhuǎn)空載體pBI 121的擬南芥不表達(dá)基因PtoeIF5Al，而轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥植株中PtoeIF5Al的表達(dá)量均很高。
[0092]實(shí)施例5、轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因植株的耐鹽性
[0093]一、將4°C春化2天的T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的種子以及T2代純合轉(zhuǎn)空載體ΡΒΙ121擬南芥株系(對(duì)照組)的種子置于含OmM NaCl的1/2MS平板上，在22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養(yǎng)，12天后，三個(gè)T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系的幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)與對(duì)照組植株的幼苗沒(méi)有明顯區(qū)別。[0094]二、將4°C春化2天的T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的種子以及T2代純合轉(zhuǎn)空載體ΡΒΙ121擬南芥株系(對(duì)照組)的種子置于含150mM和175mM NaCl的1/2MS平板上，22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養(yǎng)，12天后，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因株系的幼苗均表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，其葉片較大、顏色較綠。
[0095]結(jié)果如圖3A所示，圖3B為各組幼苗的位置示意圖。
[0096]圖3B中，Vector代表對(duì)照組幼苗，5_0E1、5_0E2和5-0E3分別代表T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al 基因的擬南芥株系 PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3 這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的幼苗。 [0097]三、提取T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系和T2代純合轉(zhuǎn)空載體pBI121擬南芥(對(duì)照組)的總蛋白進(jìn)行Western-Blotting檢測(cè),一抗為鼠抗Flag M2單克隆抗體,該抗體可以與Flag-tag與PtoeIF5Al的融合蛋白結(jié)合，二抗為辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的羊抗鼠IgG。
[0098]結(jié)果如圖3C所示。
[0099]圖3C中，Vector代表對(duì)照組擬南芥；5-0Ε1、5_0Ε2和5-0E3分別代表三個(gè)T2代純合轉(zhuǎn) PtoeIF5Al 基因的擬南芥株系 PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3。
[0100]圖3C 表明，PtoeIF5Al-0El、PtoeIF5Al_0E2 和 PtoeIF5Al_0E3 這三個(gè)楊樹(shù)PtoeIF5Al基因超量表達(dá)株系均能檢測(cè)到PtoeIF5Al蛋白，而對(duì)照組中沒(méi)有檢測(cè)到目的條帶。
[0101]四、種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)
[0102]將4°C春化2天的T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al_0E3這三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的幼苗以及T2代純合轉(zhuǎn)空載體pBI 121擬南芥株系(對(duì)照組)的種子分別置于含O、150和175mM NaCl的1/2MS平板上，22°C，16hr光照/8hr黑暗條件下培養(yǎng)，從第I天起開(kāi)始統(tǒng)計(jì)各株系的萌發(fā)率(種子露白)，連續(xù)統(tǒng)
計(jì)一周。
[0103]結(jié)果如圖4所示。圖4中，Vector代表對(duì)照組；5-0Ε1、5_0Ε2和5-0E3分別代表三個(gè)T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al_0E2和PtoeIF5Al-0E3。
[0104]圖4A表明，T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3在OmM NaCl條件下的萌發(fā)率與對(duì)照組擬南芥沒(méi)有明顯差
巳升。
[0105]圖4B表明，T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3株系在150mM NaCl條件下的萌發(fā)率從第3天起明顯較對(duì)照組擬南芥高，為其2.3至2.6倍，從第4天至第7天均約為對(duì)照組擬南芥的1.3倍。
[0106]圖4C表明，T2代純合轉(zhuǎn)PtoeIF5Al基因的擬南芥株系PtoeIF5Al_0El、PtoeIF5Al-0E2和PtoeIF5Al-0E3株系在175mM NaCl條件下的萌發(fā)率從第3天起明顯較對(duì)照組擬南芥高，為其1.7至2倍，從第4天至第7天約為其1.3至1.8倍。
[0107]結(jié)果表明楊樹(shù)PtoeIF5Al基因的超量表達(dá)可以提聞植株的耐受聞鹽能力。
【權(quán)利要求】
1.如下任一物質(zhì)在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用: (1)SEQID N0.2所示的蛋白質(zhì)； (2)SEQ ID N0.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因； (3)含有(2)的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述SEQID N0.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因如SEQ ID N0.1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述耐鹽性為耐NaCl的性質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為擬南芥。
5.一種制備耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將SEQ ID N0.2所示蛋白質(zhì)的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性增強(qiáng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入的，所述重組表達(dá)載體是將所述編碼基因插入出發(fā)載體PBI121的多克隆位點(diǎn)得到的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述植物為擬南芥。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7·任一所述的方法，其特征在于:所述耐鹽性為耐NaCl的性質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C07K14/415GK103709238SQ201310700593
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月18日
【發(fā)明者】張杰偉, 魏建華, 王宏芝, 李瑞芬, 張中保, 陳亞娟, 丁莉萍 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院