專利名稱：具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用。特別涉及一種鹽藻 {Dunaliella viridis)硫氧還蛋白(thioredoxin)基因DvTRX的核苷酸序列,及其編碼蛋白及其在提高生物耐鹽能力和在改良農(nóng)作物性狀中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
世界人口日益增長，耕地面積日趨減少，提高農(nóng)作物產(chǎn)量成為了解決這對矛盾的重要途徑。然而，土壤鹽潰化、干旱、極端溫度和營養(yǎng)貧瘠等各種環(huán)境脅迫嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的生長和發(fā)育并降低其產(chǎn)量。植物遭受逆境脅迫時(shí)，在初期階段會造成植物體離子失衡和滲透紊亂；脅迫的延續(xù)或加重還常常會伴隨活性氧的產(chǎn)生和氧化脅迫的發(fā)生。鹽堿化是影響植物生長的最重要的環(huán)境壓力之一，它嚴(yán)重影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和生產(chǎn)力。世界20% 的可耕土地嚴(yán)重的鹽潰化，嚴(yán)重影響了糧食的產(chǎn)量。大量實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因植物中活性氧清除因子的過量表達(dá)，或具有更高活性氧清除功能的突變體對環(huán)境脅迫，具有更強(qiáng)的耐受性。 研究生物的抗鹽機(jī)制，利用分子生物學(xué)技術(shù)來獲得抗性基因，揭示植物與逆境之間的關(guān)系， 輔助作物育種，已經(jīng)成為了提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有效途徑之一。杜氏藻屬(JJunaliella)是自然界中廣泛存在的真核單細(xì)胞綠藻,廣泛分布于鹽湖、海洋、鹽土等高鹽度的環(huán)境中，尤其在高鹽水域中是主要種群，很容易從自然環(huán)境中分離得到。咎MiDunaliella ririt/is)是杜氏藻屬中具有代表性的一個種。該種又稱杜氏鹽藻、綠色杜氏藻、鹽生綠色杜氏藻等。對環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，是已知最耐鹽的真核生物能耐受高鹽、重金屬、強(qiáng)烈紫外線輻射等環(huán)境脅迫。因此，鹽藻成為了一個重要的耐逆基因資源寶庫。硫氧還蛋白(Thioredoxin，Trx)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的多功能酸性蛋白。硫氧還蛋TRX家族是一類小分子量(約12 kD)的蛋白質(zhì)，普遍存在于從原核生物到高等真核生物的幾乎所有生物個體中。硫氧還蛋白具有多種生物學(xué)功能，對維持生物體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)具有重要的作用。其功能絕大多數(shù)是依賴于硫氧還蛋白還原靶蛋白中的二硫鍵。所有硫氧還蛋白均有一個保守的氧化還原活性位點(diǎn)氨基酸基序， Cys-Gly-Pro-Cys (CGPC)，活性中心有兩個具有氧還活性的半胱氨酸殘基，2個Cys殘基可通過轉(zhuǎn)移2個電子和2個質(zhì)子可逆地形成二硫化物，為一系列生理反應(yīng)提供氧化還原對。除了還原靶蛋白的二硫鍵之外，它還作為H+供體參與對酶的調(diào)節(jié)，對轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行調(diào)控及在氧化逆境中發(fā)揮作用。Trx具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、抑制凋亡、調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等功能。Trx還與植物耐逆性相關(guān)，如參與植物抗旱、耐熱和抗氧化脅迫過程，調(diào)節(jié)抗逆基因的表達(dá)等。目前，還沒有文獻(xiàn)報(bào)到硫氧還蛋白具有耐鹽的功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種具有耐鹽功能的基因，該基因是從鹽藻
3{Dunaliella viridis)中分離出來的硫氧還蛋白(thioredoxin)基因,稱為iVTEf。本發(fā)明的目的之二在于提供該基因的編碼蛋白。本發(fā)明的目的之三在于提供一種載體，該載體含有本發(fā)明的基因。本發(fā)明的目的之四在于提供一種含有本發(fā)明基因的宿主細(xì)胞。本發(fā)明目的之五是提供利用基因提高生物耐鹽性方面的應(yīng)用，其特征在于含有 /VTET基因的鹽敏感酵母細(xì)胞可以獲得一定的耐鹽能力。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種具有耐鹽功能的基因，其特征在于該基因?yàn)镾EQ ID NO 1所不的DNA序列。上述的基因的編碼蛋白，其特征在于該蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。一種重組表達(dá)載體，該重組載體含有上述的基因。一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述的重組表達(dá)載體。一種上述的具有耐鹽功能的基因在提高生物體耐鹽能力中的應(yīng)用。一種上述的具有耐鹽功能的基因在改良農(nóng)作物性狀中的應(yīng)用。本發(fā)明通過逆境脅迫的方法，從鹽藻中克隆到了一個硫氧還蛋白基因，并通過實(shí)驗(yàn)證明了它還具有耐鹽的功能。隆分析鹽藻中TRX基因有助于深入理解鹽藻抗鹽機(jī)制，同時(shí)也會為生物耐鹽基因工程和分子育種提供了基因資源。本發(fā)明首次從鹽藻 viridis)中分離到硫氧還蛋白(thioredoxin)基因iVTET，并通過轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞證明該基因還具有耐鹽功能和改良農(nóng)作物性狀的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為本發(fā)明的/VTET基因編碼蛋白的物種間同源性分析圖。方框標(biāo)注為/VTET 基因具有氧化還原活性位點(diǎn)氨基酸基序，Cys-Gly-PiO-Cys (CGPC)。圖2為本發(fā)明的/VTET基因編碼的蛋白進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于硫氧還蛋白家族。圖3為本發(fā)明的融合GST標(biāo)簽的/VTET基因編碼蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。M:蛋白 marker ；1 :pGEX4T_l 全菌；2 :pGEX4T_l 上清；3 :pGEX4T_l 沉淀；4 pGEX4T-l-TRX 全菌；5 :pGEX4T-l_TRX 上清；6 :pGEX4T-l_TRX 沉淀；7 :未誘導(dǎo) PGEX4T-1-TRX全菌；8 :未誘導(dǎo)pGEX4T_l_TRX上清；9 :未誘導(dǎo)pGEX4T_l_TRX沉淀。以上紅色箭頭所示為誘導(dǎo)表達(dá)融合GST標(biāo)簽的/VTET基因編碼蛋白。圖4為本發(fā)明的/VTET基因在酵母突變體似沒中的功能分析。即含伽/ET完整 ORF的EST序列插入到酵母表達(dá)載體PAJ401中，轉(zhuǎn)化酵母鹽敏感突變體G19，在含不同濃度的NaCl的表型展示培養(yǎng)基上進(jìn)行表型測定。具體實(shí)施方法
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遺傳學(xué)方法(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al 編，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例一全長編碼區(qū)的克隆與分析
對鹽藻ft viridis受不同濃度鹽誘導(dǎo)的cDNA文庫EST序列(表達(dá)序列標(biāo)簽)進(jìn)行分析，通過序列比對，分離到了一個鹽藻硫氧還蛋白基因，命名為DvTRX。DvTRX的cDNA全長 841 bp，含有完整的開放閱讀框(ORF)、Kozak序列(GGCMeC)以及poly(A)結(jié)構(gòu)。實(shí)施例二 DvTRX編碼的蛋白結(jié)構(gòu)、同源分析
Vector NTI軟件的分析結(jié)果顯示該基因編碼一個含161個氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小為18.02 kDa，等電點(diǎn)為9. 44。/VTET編碼的蛋白有5個β鏈和4個α鏈。 iV/ET與其他物種的Thioredoxin基因具有較高的同源性。該基因編碼的蛋白N端還具有 Thioredoxin保守的Cys-Gly-Pro-Cys(CGPC)序列,這是硫氧還蛋白氧化還原活性位點(diǎn)氨基酸基序(圖I)。圖2為本發(fā)明的/VTET基因編碼的蛋白進(jìn)化分析圖，表明該編碼蛋白屬于硫氧還蛋白家族。實(shí)施例三/VTET編碼蛋白的定位預(yù)測及原核表達(dá)分析
通過WoLFPSORT軟件預(yù)測，DvTRX蛋白定位在葉綠體中，屬于TRX的X類亞家族。通過PCR的方法，在伽/ET基因的ORF兩端加入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcoRl和通ol，連接T載體測序正確后，及和通ol雙酶切目的片段連接到同樣雙酶切的原核表達(dá)載體PGEX4T-1 上，得到重組質(zhì)粒pGEX4T-l-DvTRX。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)菌株BL21中，ImM IPTG, 25°C誘導(dǎo)4個小時(shí)后超聲破碎菌體。圖3為融合GST標(biāo)簽的DvTRX蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。實(shí)施例四DvTRX在酵母突變體中的功能分析 (一)酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
首先將含有完整ORF的EST序列(4977)構(gòu)建到酵母表達(dá)載體中我們將 4977序列利用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)I和ZAo I構(gòu)建到酵母表達(dá)載體PAJ401中。(二)轉(zhuǎn)化酵母
使用LiAc熱激轉(zhuǎn)化法將含有4977的重組克隆轉(zhuǎn)化到酵母鹽敏感突變體G19 (Mat^ ura3 his3 trpl ade2 enal Δ : : ena4 Δ)中。(三)酵母轉(zhuǎn)化子的表型鑒定
所用基本培養(yǎng)基為AP培養(yǎng)基，并加入所需氨基酸。篩選標(biāo)記為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷。轉(zhuǎn)入載體為PAJ401的轉(zhuǎn)化子表型展示培養(yǎng)基，添加2%的半乳糖作為碳源。所用表型展示培養(yǎng)基以不含NaCl的AP培養(yǎng)基為對照生長條件，加入不同濃度的NaCl的AP培養(yǎng)基為耐鹽表型分析生長條件。首先將酵母轉(zhuǎn)化子在AP培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6，以5 μ L為一個滴度，并以5倍稀釋度為系列稀釋滴度，在表型展示培養(yǎng)基上展示酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽表型。在PAJ401組成型強(qiáng)表達(dá)啟動子啟動下，4977成功互補(bǔ)了酵母鹽敏感突變體G19的表型(圖4);結(jié)果表明轉(zhuǎn)化了含/VTET完整ORF的EST序列的酵母鹽敏感突變體可以在220mM NaCl下仍然有表型， 說明了 iVTET基因能夠部分恢復(fù)酵母突變體的功能，證明了 DvTRX能夠有效地提高生物體的耐鹽能力。盡管本發(fā)明描述了具體的例子，但是有一點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的， 即在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可對本發(fā)明作各種變化和改動。因此，所附權(quán)利要求覆蓋了所有這些在本發(fā)明范圍內(nèi)的變動。
權(quán)利要求
1.一種具有耐鹽功能的基因，其特征在于該基因?yàn)镾EQ ID NO :1所示的DNA序列。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因的編碼蛋白，其特征在于該蛋白是SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。
3.—種重組表達(dá)載體，該重組載體含有根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因。
4.一種宿主細(xì)胞,該宿主細(xì)胞含有根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有耐鹽功能的基因在提高生物體耐鹽能力中的應(yīng)用。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有耐鹽功能的基因在改良農(nóng)作物性狀中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有耐鹽功能的基因、其編碼蛋白及其應(yīng)用。該基因?yàn)镾EQIDNO1所示的DNA序列。本發(fā)明首次從鹽藻(Dunaliellaviridis)中分離到硫氧還蛋白(thioredoxin)基因DvTRX，并通過轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞證明該基因還具有耐鹽功能和改良農(nóng)作物性狀的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C07K14/405GK102586281SQ20121000357
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月9日
發(fā)明者劉翔, 孫文杰, 宋任濤, 李平, 李松, 王任, 許政暟 申請人:上海大學(xué)