專利名稱：：染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns及其應(yīng)用，是將外源目的基因隨機(jī)整合到革蘭氏陰性細(xì)菌的染色體上，再將抗性基因刪除，得到不帶有外源抗性的工程菌株的系列新載體，包括pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。二
背景技術(shù)：
：基因工程菌的應(yīng)用非常廣泛，在工業(yè)生產(chǎn)、制藥、污染降解等方面得到了廣泛的研究與應(yīng)用，構(gòu)建基因工程菌的方法主要有質(zhì)粒轉(zhuǎn)移法和基因改造法。由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性會(huì)導(dǎo)致外源基因和尤其是抗生素抗性基因的遷移，將外源基因構(gòu)建于質(zhì)粒載體而獲得的基因工程菌的應(yīng)用越來越受到限制。公眾對(duì)基因工程微生物的環(huán)境釋放的生態(tài)安全性也表示擔(dān)憂，許多國家(如美國的EPA、中國轉(zhuǎn)基因安全辦等)對(duì)基因工程微生物環(huán)境釋放進(jìn)行了嚴(yán)格的限制。美國環(huán)境保護(hù)署花了2年時(shí)間評(píng)估才批準(zhǔn)含有萘代謝質(zhì)粒(pUTK21)的工程菌株P(guān).fluorescensHK44應(yīng)用于生物修復(fù)的田間試驗(yàn)。表達(dá)阿特拉津脫氯酶AtzA重組E.coli被戊二醛滅活后才被批準(zhǔn)應(yīng)用于阿特拉津污染土壤的生物修復(fù)。將外源基因整合到受體菌染色體上的常用的方法主要有同源重組和轉(zhuǎn)座子插入等。同源重組必須要有同源序列才能進(jìn)行整合，對(duì)一些遺傳背景不明的菌株操作困難。轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入在通常情況下是抗生素抗性基因被用作正篩選標(biāo)記，但所獲得的目標(biāo)工程菌株的染色體上同時(shí)會(huì)被引入抗性標(biāo)記基因，如VictorDL等開發(fā)了一種Tn5衍生的轉(zhuǎn)座子。因此，引入的外源抗性基因需要進(jìn)行刪除來能夠進(jìn)行環(huán)境釋放。因此，目前迫切需要發(fā)展能將外源基因整合到受體菌染色體上且不帶入外源抗性基因的整合技術(shù)，構(gòu)建生態(tài)安全型的基因工程菌株應(yīng)用于實(shí)踐。反向篩選標(biāo)記(Counter-selectablemarker)是首先利用自殺性載體將目的片段和反向篩選標(biāo)記基因整合到目標(biāo)菌株的染色體上(先采用抗生素抗性基因?yàn)檎Y選標(biāo)記)，然后將整合子傳代培養(yǎng)，再通過一次單交換使抗生素抗性基因從染色體中刪除，從而獲得無標(biāo)記的工程菌株。反向篩選標(biāo)記基因的表達(dá)一般會(huì)抑制宿主菌的生長或致死，因此在添加誘導(dǎo)物的選擇性平板上，只有那些發(fā)生了重組將抗性基因和反向篩選標(biāo)記基因刪除的菌株才可以生長，從而被篩選出來。在革蘭氏陰性菌中，來自于枯草桿菌的反向篩選標(biāo)記基因-果聚糖蔗糖酶基因sacB可以將蔗糖轉(zhuǎn)換成大分子的果聚糖，并使其在陰性菌的周質(zhì)空間大量積聚，從而阻止宿主菌與外界的物質(zhì)傳遞與運(yùn)輸，最終導(dǎo)致宿主菌停止生長或死亡。因此，染色體上整合有sacB基因的整合子不能夠在蔗糖平板上生長，只有那些發(fā)生了重組事件將sacB基因和抗性基因刪除的菌株才會(huì)在添加了蔗糖的選擇性平板上生長。現(xiàn)國際上已經(jīng)有報(bào)道應(yīng)用sacB基因作為同源重組的反篩選標(biāo)記。本發(fā)明即利用sacB基因作為反向篩選標(biāo)記，構(gòu)建出系列染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTnsKm、pUTTnsCm禾口pUTTnsTet。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于針對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中的實(shí)際問題和需求，建立針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的染色體隨機(jī)整合技術(shù)體系，并利用同向重復(fù)序列(DirectRepeat)之間的重組刪除抗性標(biāo)記基因，使用該載體構(gòu)建出能夠表達(dá)外源基因且不帶有抗性基因的工程菌株，為實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供技術(shù)支持。技術(shù)方案l.染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns，是由以下方法構(gòu)建而成的分別取含質(zhì)粒pUTmini-Tn5和pWSMK的大腸桿菌，劃線于含50mg/kg卡那霉素100mg/kg氨芐青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37。C培養(yǎng)24h，分別挑單菌入含相應(yīng)抗生素的LB液體試管，37°C150rpm培養(yǎng)18h，堿裂解法提取質(zhì)粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性內(nèi)切酶Sacl對(duì)質(zhì)粒pUTmini-Tn5進(jìn)行單酶切，回收片段；采用PCR擴(kuò)增的方法從pWSMK中擴(kuò)增出SacB基因并在其兩端引入酶切位點(diǎn)Sacl，酶切酶連將SacB基因整合進(jìn)pUTmini-Tn5的Sacl酶切位點(diǎn)中，挑選陽性克隆命名為pUTTnSacBs;將pUTTnSacBs用Sphl和Notl雙酶切，回收大片段。采用PCR擴(kuò)增的方法從pUTTnSacBs中擴(kuò)出SacB基因的前四百個(gè)堿基，命名為SacBq400，兩端引入酶切位點(diǎn)SphI和NotI，同時(shí)在NotI酶切位點(diǎn)前引入多克隆位點(diǎn)Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI和BspEI。酶切酶連將SacBq400整合入pUTTnSacBs,轉(zhuǎn)化E.coliDH5aApir，構(gòu)建成功pUTTnsKm;將pUTTnsKm用MM酶切，將卡那霉素抗性基因從pUTTnsKm中切開，回收大片段；采用PCR擴(kuò)增法獲得氯霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，兩端引入MluI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切酶連，分別連入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5aApir，挑選陽性克隆即分別為pUTTnsCm和pUTTnsTet;pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分別為含卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素抗性基因的整合載體系列，該載體通過同向序列的設(shè)計(jì)，可最終將抗性基因刪除；pUTTnsKm載體保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其宿主為大腸桿菌EscherichiacoliDH5aApir，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號(hào)為CGMCC3098;載體pUTTnsKm和pUTTnsTet的多酶切位點(diǎn)有八個(gè)酶切位點(diǎn)Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，載體pUTTnsCm有七個(gè)酶切位點(diǎn)Apal、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在載體抗性基因的兩端有Mlul酶切位點(diǎn)可以針對(duì)不同的G-細(xì)菌置換抗性基因；染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns用于構(gòu)建不帶有外源抗性基因的工程菌株，質(zhì)粒的宿主菌為E.coliDH5aApir，保存于斜面，在LB培養(yǎng)基上劃線，37。C培養(yǎng)24h，挑單菌入3mlLB試管，37°C150rpm搖12h，得到帶有pUTTns的大腸桿菌，提取質(zhì)粒即得。使用上述載體的流程為斜面種-獲取質(zhì)粒-酶切酶連進(jìn)目的基因-三親結(jié)合獲得工程菌。2.農(nóng)藥降解基因mpd的基因工程菌KT2440-mpd，構(gòu)建方法如下1)農(nóng)藥降解基因mpd整合進(jìn)pUTTnsKm將含pUTTnsKm載體的E.coliDH5aApir在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，提取質(zhì)粒，用Notl和Ndel雙酶切后回收大片段。從有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌PsedudomonasputidaDLL-l中用PCR的方法擴(kuò)增獲得mpd基因(引物序列正向5'-gggcccatatgctccgtccaatctccgcc-3，；反向5'-gggcccgcggccgctatcacttggggttgac-3，，PCR方法擴(kuò)增反應(yīng)體系如下10XTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液5yL，dNTP(20mmol/L)5yL，引物(25pmol/yL)各2yL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌體DNA(約50ng/iiL)liiL，TaqDNA聚合酶(5U/PL)0.5iiL，加H20至50iiL。反應(yīng)條件95。C變性5min;94°C30s，55°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸20min)，兩端引入用Notl和Ndel酶切位點(diǎn)。通過酶切酶連將mpd基因整合到pUTTnsKm的Notl和Ndel酶切位點(diǎn)，獲得的載體命名為pUTTnsKm-mpd。2)三親結(jié)合將mpd基因整合進(jìn)供體菌KT2440中將供體菌E.coliDH5aApir(pUTTnsKm-mpd)、輔助菌E.coli(pRK600)、受體菌PsedudomonasputidaKT2440分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，5000rpm離心回收菌體，用無菌水洗滌l次，濃縮后混合兩種菌液于0.25ym微孔濾膜上，置于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)，24h后用無菌水洗下菌體，直接涂布于含100yg/mL氨芐青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑選長出的單菌落即獲得接合子；3)獲得發(fā)生同向重復(fù)序列發(fā)生交換不帶外源抗性的工程菌將獲得的接合子在10%(w/v)蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，涂布于蔗糖平板，挑取單菌落，同時(shí)點(diǎn)接SLB平板(加10%蔗糖、100mg/kg甲基對(duì)硫磷)和KLB平板(50mg/kg卡那霉素)，挑選能在SLB平板上生長(且能產(chǎn)生水解圈)，而不能在KLB平板生長的菌落即為成功構(gòu)建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd。上述染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns的應(yīng)用，包括選取野生菌株P(guān)aracoccussp丄3和Sphingomonassp.BHC-A，利用權(quán)利要求5所述方法，將mpd基因?qū)脒@兩株野生型菌株，獲得野生型菌株工程菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd。有益效果本發(fā)明提供了一種用于構(gòu)建不帶有外源抗性基因工程菌株的載體pUTTns，實(shí)驗(yàn)室功能驗(yàn)證表明，該載體能夠非常方便的構(gòu)建不帶有外源抗性基因且能夠降解多種農(nóng)藥的工程菌株。本發(fā)明載體具有使用范圍廣(大部分革蘭氏陰性細(xì)菌)、能多次整合外源基因、操作簡(jiǎn)單方便(含多克隆位點(diǎn)便于外源基因和抗性基因的替換操作)、周期短等優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建工程菌株遺傳穩(wěn)定、生態(tài)安全性高。本發(fā)明為生態(tài)安全型基因工程菌構(gòu)建提供了一種新的方法和技術(shù)平臺(tái)、具有重要的研究意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。四圖l載體構(gòu)建路線圖圖2載體工作原理圖圖；3Paracoccussp丄:3-mpd和Paracoccussp丄3的生長曲線圖4Sphingomonassp.BHC-A-mpd和Sphingomonassp.BHC-A的生長曲線圖5KT2440-mpd和KT2440的生長曲線圖6mpd基因在工程菌株P(guān)seudomonasputidaKT2440-mpd、Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd中的表達(dá)pUTTnsKm載體于2009年6月15日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其宿主為大腸桿菌EscherichiacoliDH5aApir，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號(hào)為CGMCC3098。載體pUTTnsCm、pUTTnsTet和pUTTnsKm類似，只是抗性基因卡那霉素被分別替換為氯霉素和四環(huán)素抗性基因，是為了針對(duì)不同受體菌抗性選擇的需要。五具體實(shí)施方式-以有機(jī)磷農(nóng)藥水解酶基因mpd為例1染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns的構(gòu)建取分另ll含質(zhì)茅立pUTmini-Tn5(M.Herrero，VdeLorenzo,K.N.Timmis.Transposonvectorscontainingnon-antibioticresistanceselectionmarkersforcloningandstablechromosomalinsertionofforeigngenesingram-negativebacteria.J.Bacteriol.1990，172:6557-6567.)和質(zhì)粒pWSMK(J.Jiang，R.Zhang，Z.Cui，J.He，L.GuandS丄i.Parameterscontrollingthegene-targetingfrequencyattheSphingomonasspeciesrrnsiteandexpressionofthemethylparathionhydrolasegene.JoumalofAppliedMicrobiology,2007，1578-1585)的大腸桿菌，分別劃線與含有卡那霉素(50mg/kg)、氨芐青霉素(100mg/kg)的LB平板和只含有卡那霉素(50mg/kg)的LB平板上，37t:培養(yǎng)24h，分別挑單菌入同樣含有相應(yīng)抗生素的LB液體試管，37°C150rpm培養(yǎng)18h。堿裂解法提取質(zhì)粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性內(nèi)切酶SacI對(duì)質(zhì)粒pUTmini-Tn5進(jìn)行單酶切，回收片段(7055bp)。采用PCR擴(kuò)增的方法從pWSMK中擴(kuò)出sacB基因(引物序列正向5'-gagctccttcccaaccttaccagag-3';反向5'-gagctctagttctttaggcccgtag-3'，PCR方法擴(kuò)增反應(yīng)體系如下lOXTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液5iiL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmol/yL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌體DNA(約50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/PL)0.5uL，力BH20至50iiL。反應(yīng)條件95t:變性5min;94°C30s，58°C30s，72°C1.5min，30個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸20min)。引物兩端引入酶切位點(diǎn)sacl，酶切酶連將sacB基因整合進(jìn)pUTmini-Tn5酶切回收的大片段中，挑選陽性克隆命名為pUTTnSacBs。將pUTTnSacBs用Sphl和Notl雙酶切，回收大片段，采用PCR擴(kuò)增的方法從pUTTnSacBs中擴(kuò)出SacB基因的前四百個(gè)堿基SacBq400(引物序列正向5'-catagcggccgctccggacatatgccatgggccctcggtatgattgagctaaac-3';反向5'-cctgcagggcatgcgacaacagatgttttcttgcctttg-3'。PCR方法擴(kuò)增反應(yīng)體系如下10XTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液5yL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmo1/PL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌體DNA(約50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/yL)0.5iiL，力BH2O至50iiL。反應(yīng)條件95°C變性5min;94°C30s，56°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)；最后72"C延伸10min。引物兩端引入酶切位點(diǎn)Sphl和Notl，同時(shí)在Notl酶切位點(diǎn)前引入多酶切位點(diǎn)，Sphl和Notl進(jìn)行雙酶切后用T4連接酶進(jìn)行酶連將SacBq400整合進(jìn)大片段構(gòu)建成功pUTTnsKm。將pUTTnsKm用MM酶切位點(diǎn)將卡那霉素基因與pUTTnsKm切開，回收大片段，采用PCR擴(kuò)增法從質(zhì)粒pNW33N(來源于BGSC)和pBBRlMCS-3(Kovachetal.，Biotechniques，1994，5:800-802)獲得氯霉素基因和四環(huán)素基因(四環(huán)素抗性基因引物正向5'-acgcgtgacgtcattgattggctccaattc-3'，反向5'-acgcgtactagtgaattctcatgtttgacagc-3';氯霉素抗性基因引物正向5，-acgcgtgacgtcttataaaagccagtcattaggc-3，，反向acgcgtactagtaccttgatgacacagaagaag。PCR方法擴(kuò)增反應(yīng)體系如下10XTaq聚合酶反應(yīng)緩沖液5yL，dNTP(20mmol/L)5iiL，引物(25pmo1/iiL)各2iiL，Mg2+(25mmol/L)4iiL，菌體DNA(約50ng/yL)lyL，TaqDNA聚合酶(5U/yL)0.5iiL，加H2O至50iiL。反應(yīng)條件95。C變性5min;94°C30s，58°C30s，72°Clmin，30個(gè)循環(huán)；最后72。C延伸10min。兩端引入Mlul限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切酶連分別連入剛剛回收的大片段挑選陽性克隆即分別為pUTTnsCm和pUTTnsTet，可以根據(jù)酶切位點(diǎn)針對(duì)不同的革蘭氏陰性細(xì)菌置換抗性基因而構(gòu)建出一系列的載體。pUTTnsKm和pUTTnsTet的多酶切位點(diǎn)有八個(gè)酶切位點(diǎn)Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl。pUTTnsCm有七個(gè)酶切位點(diǎn)Apal、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在載體抗性基因的兩端有Mlul酶切位點(diǎn)可以針對(duì)不同的G-細(xì)菌置換抗性基因。本發(fā)明提供一系列染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTnsKm、pUTTnsCm、pUTTnsTet,用于構(gòu)建不帶有外源抗性基因的工程菌株，質(zhì)粒的宿主菌為E.coliDH5aApir(J.C.P.Yin，M.P.Krebs.W.S.Reznikoff.l988.EffectofdammethylationonTn5transposition丄Mol.Bio1.199:35-45.)，保存于斜面，在LB培養(yǎng)基上劃線，37。C培養(yǎng)24h，挑單菌入3mlLB試管，37°C150rpm搖12h，得到帶有pUTTns的大腸桿菌，提取質(zhì)粒即得。使用上述載體的流程為斜面種-獲取質(zhì)粒-酶切酶連進(jìn)目的基因-三親結(jié)合獲得工程菌。2將農(nóng)藥降解基因mpd整合進(jìn)多酶切位點(diǎn)由于我們所選擇的受體菌PseudomonasputidaKT2440沒有卡那霉素抗性(顧立鋒等，多功能降解菌PseudomonasputidaKT2440-DOP的構(gòu)建與降解特性研究，微生物學(xué)報(bào)，2006:763-766)，我們選擇卡那霉素抗性標(biāo)記基因的載體pUTTnsKm，LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，提取質(zhì)粒，用Notl和Ndel雙酶切后回收大片段，從有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌PseudomonasputidaDLL-1(劉智，孫建春，李順鵬.甲基對(duì)硫磷降解菌DLL-1的分離、鑒定及降解性研究.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1999，147-151)中用PCR的方法擴(kuò)增獲得mpd基因(蔣建東，顧立鋒，孫紀(jì)全，代先祝，文陽，李順鵬.同源重組法構(gòu)建多功能農(nóng)藥降解基因工程菌研究.生物工程學(xué)報(bào)，2005，21(6):884-891.)，兩端引入用Notl和Ndel酶切位點(diǎn)，在通過酶切酶連將基因整合進(jìn)pUTTnsKm，載體命名為pUTTnsKm-mpd。2.2三親結(jié)合將mpd基因整合進(jìn)供體菌KT2440中由于pUTTnsKm-mpd載體不能在KT2440中自主復(fù)制，因此轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞內(nèi)的載體只有整合到染色體上才能隨著染色體的復(fù)制而存在。載體上含有卡那霉素抗性基因，受體菌為氯霉素抗性，因此，在氯霉素、卡那霉素和氨芐青霉素三抗平板上長出來的菌株則為所需發(fā)生插入的工程菌。將含pUTTnsKm-mpd的供體菌E.coliDH5aApir、輔助菌E.colipRK600(MillerS.A.，DykesD.D.，PoleskyH.R.1988.AsimplesaltingoutprocedureforextractingDNAfromhumannucleatedcells.NucleicAcidsRes，16:1215)、受體菌PsedudomonasputidaKT2440分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，5000rpm離心回收菌體，用無菌水洗滌l次，濃縮后混合兩種菌液于0.25ym微孔濾膜上，置于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)，24h后用無菌水洗下菌體，直接涂布于含100yg/mL氨芐青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑選長出的單菌落并能在甲基對(duì)硫磷平板上產(chǎn)生水解圈的即為接合子；2.3獲得發(fā)生同向重復(fù)序列發(fā)生交換不帶外源抗性的工程菌將獲得的接合子在10%(w/v)蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，涂布于蔗糖平板，挑取單菌落，同時(shí)點(diǎn)接SLB平板(加10%蔗糖、100mg/kg甲基對(duì)硫磷)和KLB平板(50mg/kg卡那霉素)，挑選能在SLB平板上生長(且能產(chǎn)生水解圈)，而不能在KLB平板生長的菌落即為成功構(gòu)建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd(丟失sacB基因和抗性等載體序列)。2.4工程菌KT2440-mpd的生長情況按3%的接種量將培養(yǎng)8h且OD值一致的KT2440-mpd和KT2440種子液分別接入含有200mlLB液體培養(yǎng)基500ml三角瓶中，置于3(TC、160r/min搖床培養(yǎng)。每隔2h取樣3ml，測(cè)定OD600nm值，結(jié)果表明工程菌與野生菌株生長沒有差異。2.5工程菌KT2440-mpd在液體中對(duì)農(nóng)藥甲基對(duì)硫磷的降解及生長特性在甲基對(duì)硫磷濃度為100mg/L的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，以3%的接種量接入用O.lmol/L的PBS緩沖液洗滌2次的KT2440-mpd種子液(A600《2.00)，于30°C、180r/min搖床培養(yǎng)。每2h取樣，測(cè)定甲基對(duì)硫磷的含量。菌株KT2440-mpd對(duì)甲基對(duì)硫磷有著很好的降解率。3載體在其他野生菌株中的應(yīng)用選取野生菌株P(guān)aracoccussp丄3(王堃等，樂果降解菌L3的分離、鑒定及降解性能，中國環(huán)境科學(xué))和Sphingomonassp.BHC-A(馬愛芝等，六六六(HCH)降解菌Sphingomonassp.BHC-A的分離與降解特性的研究，微生物學(xué)報(bào))為例，菌株為本實(shí)驗(yàn)室對(duì)外提供，利用以上方法，成功的將mpd基因?qū)脒@兩株野生型菌株，基因能夠很好的f尋至Ll表達(dá)，獲f尋王禾呈菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd。4外源基因?qū)σ吧途晟L的影響在18個(gè)lL的三角瓶中加入300mL的LB培養(yǎng)基，12rC滅菌30分鐘，分別以2X的接種量接入KT2440-mpd、Paracoccussp丄3-mpd、Sphingomonassp.BHC-A-mpd和野生菌株KT2440、Paracoccussp丄3、Sphingomonassp.BHC-A，置于30。C、180rpm搖床振蕩培養(yǎng)，按不同的培養(yǎng)時(shí)間，每隔2h用無菌移液管取樣3mL，立即放入4t:冰箱儲(chǔ)存，最后一同在600nm波長處測(cè)定OD值。用未接種的細(xì)菌培養(yǎng)基作空白對(duì)照，從最早取出的培養(yǎng)液開始依次測(cè)定，對(duì)細(xì)胞密度大的培養(yǎng)液用細(xì)菌培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后，使其光密度在O.l0.8之間(在測(cè)定OD值前，將待測(cè)定的培養(yǎng)液振蕩，使細(xì)胞均勻分布)，每個(gè)處理三次重復(fù)。測(cè)定結(jié)果表明，外源基因?qū)こ叹甑纳L沒有影響。權(quán)利要求染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns，其特征在于，由以下方法構(gòu)建而成的分別取含質(zhì)粒pUTmini-Tn5和pWSMK的大腸桿菌，劃線于含50mg/kg卡那霉素、100mg/kg氨芐青霉素的LB平板和含50mg/kg卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)24h，分別挑單菌入含相應(yīng)抗生素的LB液體試管，37℃150rpm培養(yǎng)18h，堿裂解法提取質(zhì)粒pUTmini-Tn5和pWSMK，用限制性內(nèi)切酶SacI對(duì)質(zhì)粒pUTmini-Tn5進(jìn)行單酶切，回收片段；采用PCR擴(kuò)增的方法從pWSMK中擴(kuò)增出SacB基因并在其兩端引入酶切位點(diǎn)SacI，酶切酶連將SacB基因整合進(jìn)pUTmini-Tn5的SacI酶切位點(diǎn)中，挑選陽性克隆命名為pUTTnSacBs；將pUTTnSacBs用SphI和NotI雙酶切，回收大片段，采用PCR擴(kuò)增的方法從pUTTnSacBs中擴(kuò)出SacB基因的前四百個(gè)堿基，命名為SacBq400，兩端引入酶切位點(diǎn)SphI和NotI，同時(shí)在NotI酶切位點(diǎn)前引入多克隆位點(diǎn)ApaI、NcoI、NdeI、AcccIII、EcoO109、PspOMI和BspEI，酶切酶連將SacBq400整合入pUTTnSacBs，轉(zhuǎn)化E.coliDH5αλpir，即為構(gòu)建成功pUTTnsKm；將pUTTnsKm用MluI酶切，將卡那霉素抗性基因從pUTTnsKm中切開，回收大片段，采用PCR擴(kuò)增法獲得氯霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因，兩端引入MluI限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，通過酶切酶連，分別連入pUTTnsKm用MluI酶切回收的大片段中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5αλpir，挑選陽性克隆即分別為pUTTnsCm和pUTTnsTet；pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分別為含卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素抗性基因的整合載體系列，該載體通過同向序列的設(shè)計(jì)，可最終將抗性基因刪除；pUTTnsKm載體保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其宿主為大腸桿菌EscherichiacoliDH5αλpir，分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，保藏號(hào)為CGMCC3098。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的載體pUTTns，其特征在是pUTTnsKm和pUTTnsTet的多克隆位點(diǎn)含八個(gè)酶切位點(diǎn)Apal、Ncol、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，載體pUTTnsCm的多克隆位點(diǎn)含七個(gè)酶切位點(diǎn)ApaI、Ndel、AcccIII、EcoO109、PspOMI、BspEI、Notl，在載體抗性基因的兩端有Mlul酶切位點(diǎn)可以針對(duì)不同的G—細(xì)菌進(jìn)行抗性基因的置換；3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的載體pUTTns，其特征在是載體pUTTns的宿主菌為原核生物大腸桿菌E.coliDH5aApir，分別為E.coliDH5a入pir-pUTTnsCm、E.coliDH5a入pir-pUTTnsTet禾口E.coliDH5a入pir-pUTTnsKm;4.權(quán)利要求1-3之一所述染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns的應(yīng)用；5.農(nóng)藥降解基因工程菌株KT2440-mpd，其特征在于，構(gòu)建方法如下1)外源降解基因mpd整合進(jìn)pUTTnsKm將權(quán)利要求l所述pUTTnsKm載體在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，提取質(zhì)粒，用Notl和Ndel雙酶切后回收大片段，從有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌PsedudomonasputidaDLL-1中用PCR的方法擴(kuò)增獲得mpd基因，兩端引入用Notl和Ndel酶切位點(diǎn)，在通過酶切酶連將mpd基因整合進(jìn)pUTTnsKm,獲得的載體命名為pUTTnsKm-mpd;2)三親結(jié)合將mpd基因整合進(jìn)供體菌KT2440中將含pUTTnsKm-mpd的供體菌E.coliDH5aApir、輔助菌E.colipRK600、受體菌PsedudomonasputidaKT2440分別在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，5000rpm離心回收菌體，用無菌水洗滌l次，濃縮后混合兩種菌液于0.22ym微孔濾膜上，置于不含抗生素的LB培養(yǎng)基上3(TC培養(yǎng)，24h后用無菌水洗下菌體，直接涂布于含100yg/mL氨芐青霉素、50iig/mL卡那霉素和100iig/mL氯霉素的LB平板上，48h后挑選長出的單菌落即獲得接合子；3)篩選發(fā)生同向重復(fù)序列發(fā)生交換的不帶外源抗性的工程菌株將獲得的接合子在含10X蔗糖的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，涂布于蔗糖平板，挑取單菌落，同時(shí)接種含10%蔗糖、100mg/kg甲基對(duì)硫磷平板SLB和加50mg/kg卡那霉素的平板KLB，挑選能在SLB平板上生長且產(chǎn)生黃色水解圈而不能在KLB平板生長的菌落，即為成功構(gòu)建的不含外源抗性基因的工程菌KT2440-mpd;6.權(quán)利要求5所述基因工程菌KT2440-mpd在野生菌株中的應(yīng)用，包括選取野生型菌株P(guān)aracoccussp丄3和Sphingomonassp.BHC-A，利用權(quán)利要求5所述方法，將mpd基因整合到這兩株野生型菌株的染色體上，獲得工程菌Paracoccussp丄3-mpd禾口Sphingomonassp.BHC-A-mpd;全文摘要本發(fā)明涉及染色體無標(biāo)記隨機(jī)整合載體pUTTns及其應(yīng)用，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。pUTTnsKm、pUTTnsCm和pUTTnsTet分別為含卡那霉素、氯霉素和四環(huán)素抗性基因的載體。該系列載體可通過轉(zhuǎn)座子Mini-Tn5將外源基因隨機(jī)整合到G-細(xì)菌染色體上，先通過抗性基因篩選整合子，再通過同向重復(fù)序列之間的重組將抗性基因刪除，用反篩選標(biāo)記基因sacB將抗性基因刪除的重組子篩選出來，構(gòu)建出無外源抗性基因標(biāo)記的工程菌株。本發(fā)明載體具有使用范圍廣、能多次整合外源基因、操作簡(jiǎn)單方便等優(yōu)點(diǎn)，所構(gòu)建工程菌株遺傳穩(wěn)定、不含外源抗性基因、生態(tài)安全性高，為生態(tài)安全型基因工程菌構(gòu)建提供了新的方法和技術(shù)平臺(tái)。文檔編號(hào)A62D3/00GK101691581SQ20091003369公開日2010年4月7日申請(qǐng)日期2009年6月25日優(yōu)先權(quán)日2009年6月25日發(fā)明者李榮,李順鵬,蔣建東申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)