本發(fā)明涉及一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

遺傳性視網(wǎng)膜劈裂癥是一種x染色體遺傳病，故又稱為x連鎖視網(wǎng)膜劈裂癥（x-linkedretinoschisis,xlrs）。該病在白人、黑人和黃種人群中均有發(fā)生，其發(fā)病率為1:5000-1:25000。xlrs主要為男性發(fā)病，女性發(fā)病較為少見，遺傳性者多見于兒童及青年人，是青少年致盲的主要遺傳病之一。xlrs臨床癥狀多為黃斑部視網(wǎng)膜劈裂，斜視，眼球震顫，視力差甚至全盲，erg呈現(xiàn)異常，b波幅度明顯減小，oct掃描顯示明顯的“窩輪狀”囊腔劈裂，嚴(yán)重的表現(xiàn)為視網(wǎng)膜各層厚度和總厚度變薄。時(shí)至今日，遺傳性視網(wǎng)膜劈裂癥還無行之有效的治療辦法。

rs1基因的突變被認(rèn)為是先天性視網(wǎng)膜劈裂癥致病的遺傳機(jī)制，rs1基因定位于xp22.2，由六個(gè)外顯子構(gòu)成，編碼224個(gè)氨基酸。目前，已經(jīng)有230多個(gè)rs1基因突變位點(diǎn)的報(bào)道，這些基因的突變被認(rèn)為是先天性視網(wǎng)膜劈裂癥致病的遺傳機(jī)制，而這些rs1基因突變的位點(diǎn)引起視網(wǎng)膜rs1蛋白的缺失或rs1蛋白功能的喪失，被認(rèn)為是xlrs發(fā)病的關(guān)鍵因素，這些單基因突變的位點(diǎn)也成為了基因治療過程中的重要錨定靶點(diǎn)。

正是基于對(duì)x連鎖視網(wǎng)膜劈裂癥遺傳機(jī)制的明確，人們利用rs1基因進(jìn)行了相關(guān)疾病模型的構(gòu)建。目前，全世界有3種rs1基因敲除小鼠模型（rs1-ko）在最近十年中相繼用于xlrs的研究。第一種是在rs1的第3個(gè)外顯子上插入lacz/neor形成空載小鼠模型。第二種是在rs1的第1個(gè)外顯子上插入一個(gè)新霉素基因?qū)е铝藃s1蛋白不表達(dá)的小鼠模型。第三種是用亞硝基脲（n-ethyl-n-nitrosurea，enu)處理得到隨機(jī)突變的小鼠模型，主要得到的是在第2個(gè)外顯子上的點(diǎn)突變和26個(gè)堿基缺失的小鼠模型。迄今為止，這些rs1-ko小鼠均是內(nèi)源性小鼠疾病模型，其突變位點(diǎn)與病人基因的突變并不一樣，所以這對(duì)后期臨床的評(píng)價(jià)可能會(huì)有所偏差。研究也證實(shí)這些rs1敲除小鼠部分表現(xiàn)為xlrs患者的特征，包括b波幅度顯著降低、視網(wǎng)膜出現(xiàn)劈裂、光感受器退化以及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層變薄，但視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞層和內(nèi)核層變薄，內(nèi)網(wǎng)層出現(xiàn)劈裂等表征與人的視網(wǎng)膜劈裂臨床癥狀存在著差異。有關(guān)人源性小鼠模型國際國內(nèi)都未見報(bào)道，人源性突變的rs1基因轉(zhuǎn)入小鼠形成的xlrs疾病模型是否具有與臨床病患相類似或相同的表征也未見報(bào)道。開展人源性rs1h-ki疾病模型的研究，這能夠更好更準(zhǔn)確的模擬人類疾病發(fā)病過程，為研究xlrs提供更為精準(zhǔn)和豐富的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)以上問題，提供一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法。

發(fā)明目的通過以下方案實(shí)現(xiàn)：一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，以人源性rs1基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選人類致病基因通過基因編輯手段敲入到小鼠中，得到具有和病人臨床表征一樣的rs1h-ki小鼠疾病模型。

進(jìn)一步的，運(yùn)用talens的技術(shù)，根據(jù)xlrs病患篩選得到rs1基因的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與xlrs病患相同的oligo序列，構(gòu)建好的載體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，篩選得到具有rs1基因突變的穩(wěn)定細(xì)胞系,體外表達(dá)，分離得到mrna，并進(jìn)行受精卵顯微注射及胚胎移植到f0代的孕鼠子宮中，繁殖得到穩(wěn)定表型的f1代rs1h-ki疾病模型小鼠。

進(jìn)一步的，oligo序列為：tgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccatatcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatca。

進(jìn)一步的，突變型rs1基因翻譯的蛋白質(zhì)序列：mphkiegffllllfgyeatlglsstedegedpwyqkackcdcqvganalwsagatsldcipecp。

進(jìn)一步的，用talen構(gòu)建基因敲入小鼠，設(shè)計(jì)針對(duì)rs1基因的第四個(gè)外顯子上c.195t>g的突變位點(diǎn)，利用talen的兩個(gè)手架讓talen在細(xì)胞中與基因組的靶位點(diǎn)結(jié)合，形成foki二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致左右talen的spacer區(qū)域發(fā)生雙鏈dna斷裂，從而誘發(fā)dna損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞通過非同源性末端接合機(jī)制修復(fù)dna，達(dá)到基因敲入到小鼠的基因中，talen的兩個(gè)手架：talen_left引物為：tgactcgaaacccagggg；talen_right引物為：tgcccatatcacaag；spacer區(qū)域?yàn)椋簍gcccatatcacaag。

進(jìn)一步的，針對(duì)rs1基因的第四個(gè)外顯子上c.195t>g的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)基因敲入的oligo序列為：tgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccatatcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatca。

進(jìn)一步的，在rs1基因的215bp處設(shè)置一個(gè)bpu10i酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步的，設(shè)計(jì)構(gòu)建好的人源性rs1基因oligo序列，將其進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，采用顯微注射的方式將體外轉(zhuǎn)錄的mrna序列注射入c57bl/6j成熟卵細(xì)胞中，注射成功的受精卵可體外培養(yǎng)過夜或立即轉(zhuǎn)入代孕母鼠子宮中受孕培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，代孕母鼠產(chǎn)仔后，取f1代小鼠的尾巴和腳趾，提取全基因組，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，bpu10i酶切酶切驗(yàn)證，測序鑒定?；蜩b定結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了rs1h-ki小鼠疾病模型。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型，rs1h-ki小鼠基因測序序列:cattatctctgttgagttctgggataggaggggttcattccttcttttgtattttgggatgaggtctcaatactttctccggacagcccagagaagctgggactccacactgtgaacatatgctaccactctgcctggagatttgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccttagcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatcagatcacttgctccaacccagagcagtatgtgggcggtattcctcca。

本發(fā)明的有益效果在于：視覺功能和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)檢測都可以說明rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜中主要是由于感光細(xì)胞與雙極細(xì)胞之間的突觸鏈接受損致使rs1h-ki小鼠視覺功能異常，這正是rs1h-ki小鼠發(fā)生在視網(wǎng)膜外叢狀層的劈裂所造成的，這與臨床病人表征相同；能夠更好更準(zhǔn)確的模擬人類疾病發(fā)病過程，為研究xlrs提供更為精準(zhǔn)和豐富的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)象。

附圖說明

圖1為本發(fā)明構(gòu)建圖。

圖2為人源性rs1h-ki小鼠鑒定結(jié)果圖。

圖3為人源性rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果圖一。

圖4為人源性rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果圖二。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

結(jié)合附圖1-4，實(shí)施例1，本發(fā)明的一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，以人源性rs1基因?yàn)榛A(chǔ)，篩選人類致病基因通過基因編輯手段敲入到小鼠中，得到具有和病人臨床表征一樣的rs1h-ki小鼠疾病模型。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，運(yùn)用talens的技術(shù)，根據(jù)xlrs病患篩選得到rs1基因的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)與xlrs病患相同的oligo序列，構(gòu)建好的載體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，篩選得到具有rs1基因突變的穩(wěn)定細(xì)胞系。體外表達(dá)，分離得到mrna，并進(jìn)行受精卵顯微注射及胚胎移植到f0代的子宮中，繁殖得到穩(wěn)定表型的f1代rs1h-ki疾病模型小鼠。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，oligo序列為：tgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccatatcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatca。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，突變型rs1基因翻譯的蛋白質(zhì)序列：mphkiegffllllfgyeatlglsstedegedpwyqkackcdcqvganalwsagatsldcipecp。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，所述手架指代識(shí)別序列。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，用talen(transcriptionactivator-like（tal)effectornucleases，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)）構(gòu)建基因敲入小鼠（rs1h-ki），設(shè)計(jì)針對(duì)rs1基因的第四個(gè)外顯子上c.195t>g的突變位點(diǎn)，利用talen的兩個(gè)手架讓talen在細(xì)胞中與基因組的靶位點(diǎn)結(jié)合，形成foki二聚體發(fā)揮內(nèi)切酶活性，導(dǎo)致左右talen的spacer區(qū)域發(fā)生雙鏈dna斷裂（dsb，double-strandbreaks），從而誘發(fā)dna損傷修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞通過非同源性末端接合機(jī)制（nhej,non-homologousendjoining）修復(fù)dna，達(dá)到基因敲入到小鼠的基因中。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，針對(duì)rs1基因的第四個(gè)外顯子上c.195t>g的突變位點(diǎn)，設(shè)計(jì)基因敲入的oligo序列為：tgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccatatcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatca（翻譯的蛋白質(zhì)序列：mphkiegffllllfgyeatlglsstedegedpwyqkackcdcqvganalwsagatsldcipecp）。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，在rs1基因的215bp處設(shè)置一個(gè)bpu10i酶切位點(diǎn)。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，設(shè)計(jì)構(gòu)建好的人源性rs1基因oligo序列，將其進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，采用顯微注射的方式將體外轉(zhuǎn)錄的mrna序列注射入c57bl/6j成熟卵細(xì)胞中，注射成功的受精卵可體外培養(yǎng)過夜或立即轉(zhuǎn)入代孕母鼠子宮中受孕培養(yǎng)。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，代孕母鼠產(chǎn)仔后，取f1代小鼠的尾巴和腳趾，提取全基因組，進(jìn)行pcr擴(kuò)增，bpu10i酶切酶切驗(yàn)證，測序鑒定?；蜩b定結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了rs1h-ki小鼠疾病模型。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型，rs1h-ki小鼠基因測序序列:cattatctctgttgagttctgggataggaggggttcattccttcttttgtattttgggatgaggtctcaatactttctccggacagcccagagaagctgggactccacactgtgaacatatgctaccactctgcctggagatttgggtgtttgagtgtgtgctgtttttcctccccagaatgcccttagcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatcagatcacttgctccaacccagagcagtatgtgggcggtattcctcca。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，a、rs1h-ki疾病模型小鼠。b、rs1h-ki疾病模型小鼠酶切鑒定結(jié)果。1表示rs1h-ki疾病模型小鼠無酶切時(shí)rs1h基因?yàn)?09bp，2表示用bpu10i酶切后明顯的兩條帶：215bp和94bp；control組中在有酶切條件（第4泳道）和無酶切（第3泳道）條件下均未見酶切條帶。c、control小鼠和rs1h-ki疾病模型小鼠基因測序結(jié)果。在rs1基因的第四個(gè)外顯子上c.195t>g的突變位點(diǎn)，說明成功構(gòu)建rs1h-ki疾病模型小鼠。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，首先用光學(xué)相干斷層成像技術(shù)掃描了野生型小鼠（widetype,wt）和rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜e，我們發(fā)現(xiàn)rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜出現(xiàn)明顯的劈裂腔（藍(lán)色圈標(biāo)記處），外核層和感光細(xì)胞層變薄。進(jìn)一步做免疫組織化學(xué)檢測，f是he染色結(jié)果，與wt小鼠相比，rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化異常，其外從狀層（藍(lán)色箭頭）出現(xiàn)明顯的空腔，細(xì)胞之間聯(lián)系變少。rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜的外核層（黃色箭頭處）和感光細(xì)胞外段層（青色箭頭）變薄，統(tǒng)計(jì)分析顯示（g、h），差異極其顯著（n=24,p<0.0001）。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，oct掃描結(jié)果，wt小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)清晰，rs1h-ki小鼠在視網(wǎng)膜的外網(wǎng)層明顯的劈裂腔。免疫組織化學(xué)方法比較野生型小鼠和rs1h-ki小鼠的視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)差異，與wt小鼠相比，rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜的外網(wǎng)層出現(xiàn)非常明顯的劈裂腔，細(xì)胞之間的聯(lián)系變少。rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜外核層、感光細(xì)胞外段層厚度統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，與wt小鼠相比，rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜的外網(wǎng)層和感光細(xì)胞層厚度均變薄，差異顯著。

一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建方法，rs1h-ki小鼠在組織結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)的明顯差異，在其生理功能上也表現(xiàn)出與病人相似的臨床表征。我們對(duì)rs1h-ki小鼠進(jìn)行了視網(wǎng)膜電圖檢測視網(wǎng)膜電圖是光刺激視網(wǎng)膜時(shí)從角膜或相應(yīng)部位記錄到的視網(wǎng)膜總電反應(yīng)，主要反映視網(wǎng)膜第一、二級(jí)神經(jīng)元的功能。正常的野生型小鼠閃光ferg(fash-erg)依次有一個(gè)負(fù)相較小的a波和一個(gè)較大的正相b波（j、m、p）。而rs1h-ki小鼠的ferg明顯異常：在暗適應(yīng)視網(wǎng)膜電圖檢測視桿細(xì)胞反應(yīng)時(shí)（k、o），與wt相比，b波明顯減?。╪=12,p<0.0001），a波變化不明顯，無差異（n=12,p>0.5）；在暗適應(yīng)混合反應(yīng)（n）時(shí)，與wt相比，a波（l）和b波（o）明顯減小，差異顯著（n=12,p<0.0001）；在檢查視錐細(xì)胞閃爍反應(yīng)時(shí)（q），與wt相比，a波（n=12,p<0.001）幾乎消失，b波明顯減?。╪=12,p<0.01）。統(tǒng)計(jì)分析a/b比率發(fā)現(xiàn)（r），暗適應(yīng)的視桿細(xì)胞在野生型小鼠和rs1h-ki小鼠之間變化較大，差異顯著；而視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的復(fù)合反應(yīng)的a/b卻沒有變化；但視錐細(xì)胞的差異卻是明顯的（n=12,p<0.05）?？傊?i>rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜電圖檢測表明，rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜視覺功能受損，即是視網(wǎng)膜第一、二級(jí)神經(jīng)元的功能異常。最重要的是rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜的外叢狀層出現(xiàn)明顯的劈裂腔，這正是感光細(xì)胞細(xì)胞與視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞之間的突觸鏈接變化異常，這可能是rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜b波異常的重要原因。其次，rs1h-ki小鼠在結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為感光細(xì)胞層變薄，但a波在暗適應(yīng)下無變化，說明rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜光感細(xì)胞中視桿細(xì)胞的視覺功能影響不大。雖然在視錐細(xì)胞表現(xiàn)出b波減小，但小鼠中視錐細(xì)胞數(shù)量較少，故對(duì)小鼠視錐細(xì)胞的視覺功能影響不明顯。因此，視覺功能和視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)檢測都可以說明rs1h-ki小鼠視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜中主要是由于感光細(xì)胞與雙極細(xì)胞之間的突觸鏈接受損致使rs1h-ki小鼠視覺功能異常，這正是rs1h-ki小鼠發(fā)生在視網(wǎng)膜外叢狀層的劈裂所造成的，這與臨床病人表征相同，說明我們構(gòu)建得到了人源性的rs1h-ki小鼠疾病模型。

雖然本發(fā)明已通過參考優(yōu)選的實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解，可以不限于上述實(shí)施例的描述，在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)，可作出形式和細(xì)節(jié)上的各種變化。

序列表

<110>溫州醫(yī)科大學(xué)

<120>一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法

<160>2

<210>1

<211>5855bp

<212>rna

<213>musmusculus

<400>1

aacaatacctccccagactgcttgttgaggcaggggactatgtggcttaattggatgggg60

gctgagtgaaagacctaagaactaaatgaaataagatgcttaagttaatcgcctgctcct120

atgccagctctccacttcacttagatcttgctgtgaccaaggacaaggagaaaatgccac180

acaagattgaaggcttcttcttgttacttctctttggctatgaagccacattgggattgt240

catcgacagaggatgagggtgaggacccctggtaccagaaagcatgcaagtgtgattgcc300

aggtaggagccaatgctctgtggtctgctggagctacctccttagactgtattccagaat360

gcccatatcacaagcccctgggtttcgagtcaggggaggtcacgccagatcagatcactt420

gctccaacccagagcagtatgtgggctggtattcctcatggacagcaaacaaggcccgac480

tcaacagtcaaggttttgggtgtgcttggctttccaagtatcaggacagcagccagtggt540

tacagatagatttgaaggagatcaaggtgatttcggggatcctgacccaaggacgctgtg600

acatagacgagtgggtgaccaagtacagtgtgcagtataggactgatgagcgcctgaact660

ggatctactataaggatcagaccggaaacaatcgggtcttctatggaaactcagaccgga720

gttctacagttcagaacttactcaggccccccatcatttcccgcttcatccgactgatcc780

ctctaggctggcatgtccgaattgccatccggatggagctgcttgagtgtgccagcaagt840

gtgcctgatgtctatttcagctcagttctgtcacttgcagggagagctttggggggaggg900

caccctgaaataccactgggatgaatggggctatatcttataagcactttacaatgtaga960

tctgggtagagaatatttcactttttaaaagatagtttcaaatttcaaagggagagagag1020

agagagagagagagagagagagagagagagagaagcttttaagcttttcttcaactcagg1080

gccaaagaaaataagaacaaagaaagtatctctcaaaccaattttcttacacaaacccaa1140

atagcaggggtaatttgctgctctggctccccatctttttctctttgtctcagtgacacc1200

gtcaaaggtgcaggcccaggggaacacaaagcagctctgataatttgaaaattctttttg1260

gctcttagcacattcagaagaggagcgtactctttggcaaagcctcacatgaacacttgc1320

atgaaatcctcactatagaggcctggtgacaagtacataggtgtgaagaaagcagaagga1380

agcctggcgtatggcccacgagtctggagccagtaaccaaccaaccaactaaccaactaa1440

ccaaccagtcaaggcttccccctccctggaattgcttttgcctggaaggggtggagctcc1500

ttgtgcagaaactccattctacagcccttttggcaatgtgtccttctgtgattgcctgga1560

gatgaatgcaaggggcaggctatatgtgtgtgtggatagtgaggtttcccttaaactgag1620

gaagcccaaataactagaatacatcacaccttctttatccatggctacagtttcccagaa1680

attgaacaggcttagaaaacagctgagataaaccatatctctatctactgggaagagatc1740

atgctttgggggaaggggttaggactcctatcatagaggactgtacacagatgatctgtc1800

agtaaagggcttgctgtacagcataggaacttgagattatatttctagaatgcatgtaaa1860

aagctaggtatggacaggtatggtggaacatgccattagtcttagtatttggaagacaga1920

ggcaagcagatctgagttcagggccagcctggtctacatagcagttccaagctagccaag1980

gctacacagtaaggccctgtttcaagaaaaaaagaccaggcatggaggggcacacctgca2040

aatccaggactaggaggcaggcagagacaggatgatgcctagagcttgtctgccaatcag2100

tacactccaggttcatggtcagaccctgtctcaaaactaaagtgaagagctattgaggaa2160

gataccagatgtcaacctctgtccaacatgcacacatacacatacactggtaggtttcaa2220

acctggggcaaatggcagaggtgcctagttaaggttctcccagcatctctcagcccctac2280

caggtcctcctagttggcataccccgccccctaccccgaaactcttcagcccagggggtt2340

gggcttcttccctatataatccaactattttggtcaccctttctctttgtacctttgggc2400

ctcctggttgctgcatctggttcctctgttctcccttatctcttttcctccctcctctcc2460

tcacaaggcccagcttagagtgttcatgtctattctggactctctcccggatgcccctgc2520

ctctggctatgctctcccacatatctaccataaactctctcctctaccatacctaggaca2580

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序列表

<110>溫州醫(yī)科大學(xué)

<120>一種人源性視網(wǎng)膜劈裂癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法

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