本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，具體地指一種用于治療2型全色盲病人的重組腺相關(guān)病毒基因治療載體及藥物。

背景技術(shù)：

人類視網(wǎng)膜含有大約600萬(wàn)個(gè)視錐細(xì)胞和1億個(gè)視桿細(xì)胞。錐細(xì)胞主要是在明室下司職色覺(jué)及中央和精細(xì)視力，主要分布在黃斑部，特別是中心凹(占100％)；桿細(xì)胞正相反，主要是在暗環(huán)境下司職周邊視力，主要分布在視網(wǎng)膜周邊部，越靠近黃斑部越少。全色盲是一種罕見(jiàn)的隱性遺傳病，以錐細(xì)胞功能喪失為特征，病人僅剩下桿體視覺(jué)。全色盲臨床表現(xiàn)為：鐘擺型眼球震顫，畏光，視力嚴(yán)重障礙，無(wú)色覺(jué)及無(wú)中心視力，表現(xiàn)為晝盲。視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,erg)錐細(xì)胞反應(yīng)消失，有些嚴(yán)重病例erg桿細(xì)胞反應(yīng)也有減弱。其中眼球震顫和畏光在生后數(shù)周即可出現(xiàn)；患者視力很差(通?！?.1)，且終身變化不大。原來(lái)一直以為全色盲病人的錐體細(xì)胞雖然功能喪失，但結(jié)構(gòu)能夠長(zhǎng)期保持穩(wěn)定。近年來(lái)，隨著光學(xué)相干斷層(oct)成像技術(shù)的改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)全色盲病人的黃斑中心凹處變薄，特別是錐細(xì)胞內(nèi)外節(jié)及結(jié)合部有明顯縮短、缺失或高反射區(qū)。全色盲在西方人群中的患病率約1/3萬(wàn)。對(duì)于全色盲患者，除了佩戴用來(lái)遮擋外部光線的暗色眼鏡來(lái)減輕畏光癥狀并盡量利用網(wǎng)膜周邊的桿細(xì)胞功能外，目前尚無(wú)有效的治療方法。

目前已發(fā)現(xiàn)有環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3(cnga3)基因的突變與全色盲2型相關(guān)。此基因的蛋白表達(dá)僅在錐細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行。cng通道位于視細(xì)胞外節(jié)的質(zhì)膜上，通過(guò)對(duì)鈣、鈉等陽(yáng)離子流入視細(xì)胞的控制使光信號(hào)最終轉(zhuǎn)變?yōu)樯镫娪嵦?hào)，在光轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中起著重要作用。cng通道屬于電壓門(mén)控離子通道超蛋白家族的成員，根據(jù)亞單位的不同可以分為cnga和cngb。cnga3基因編碼錐細(xì)胞cng陽(yáng)離子通道的α亞單位，cngb3基因編碼β亞單位。α亞單位與離子傳導(dǎo)有關(guān)，而β亞單位主要參與功能調(diào)節(jié)。cnga3基因突變會(huì)導(dǎo)致進(jìn)行性錐細(xì)胞變性和一些黃斑病變。轉(zhuǎn)導(dǎo)素介導(dǎo)視覺(jué)傳導(dǎo)的第一步，環(huán)單磷酸鳥(niǎo)苷(cyclicguanosinemonophosphate,cgmp)門(mén)控通道cnga3和cngb3是調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)的最后步驟。在西方國(guó)家的全色盲病人中，大約25％是由cnga3突變?cè)斐傻?型病人。雖然還沒(méi)有確切的統(tǒng)計(jì)數(shù)字，但在近年的研究中觀察到，亞洲國(guó)家包括中國(guó)的全色盲病人中cnga3基因突變?cè)斐傻?型比例明顯要比歐美人群高，在全色盲中占60-90％。

傳統(tǒng)醫(yī)療手段對(duì)遺傳性視網(wǎng)膜疾病沒(méi)有作用，所以到目前為止這類疾病還處于無(wú)藥可治的狀態(tài)。近年來(lái)，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，我們知道了這類隱性視網(wǎng)膜遺傳病是由基因突變?cè)斐傻南鄳?yīng)功能性蛋白缺失導(dǎo)致的。本發(fā)明的發(fā)明人利用多年研究經(jīng)驗(yàn)，開(kāi)發(fā)出應(yīng)用特定腺相關(guān)病毒載體將正常基因轉(zhuǎn)染到有基因突變的相關(guān)視錐細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)恢復(fù)病變細(xì)胞缺失的相關(guān)功能蛋白來(lái)達(dá)到恢復(fù)視功能，從而讓患有此種基因突變的患者重見(jiàn)光明的個(gè)性化基因治療方法。這種方法從根本上解除了造成此疾病的病因，如果開(kāi)展早期治療，應(yīng)該具有很好的前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種腺相關(guān)病毒載體及其用于治療2型全色盲的相關(guān)藥物。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種腺相關(guān)病毒載體，所述載體含有人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因、血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1和增強(qiáng)子，所述的人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因選自與seqidno:1有至少95％同源性的核苷酸序列；所述的血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1選自與seqidno:2有至少90％同源性的核苷酸序列。

優(yōu)選地，所述的人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因選自與seqidno:1有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；所述的血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1選自與seqidno:2有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。

更優(yōu)選地，所述的人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因的核苷酸序列含有seqidno:1；所述的血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1的核苷酸序列含有seqidno:2。最優(yōu)選地，所述的人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因的核苷酸序列選自seqidno:1；所述的血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1的核苷酸序列選自seqidno:2。

在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的腺相關(guān)病毒載體具有非特異性啟動(dòng)子。

優(yōu)選地，所述的非特異性啟動(dòng)子為chickenbeta-actin(cba)的啟動(dòng)子，選自與seqidno:3有至少95％同源性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述的(cba)的啟動(dòng)子選自與seqidno:3有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最優(yōu)選地，所述的cba啟動(dòng)子的核苷酸序列選自seqidno:3。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺相關(guān)病毒載體具有錐細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述的錐細(xì)胞特異性啟動(dòng)子為pr2.1啟動(dòng)子，選自與seqidno:4有至少95％同源性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述的pr2.1啟動(dòng)子選自與seqidno:4有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列；最優(yōu)選地，所述的pr2.1啟動(dòng)子的核苷酸序列選自seqidno:4。

在另一優(yōu)選例中，所述腺相關(guān)病毒載體的序列含有

(a)seqidno:1；和

(b)seqidno:2；和

(c)seqidno:3或seqidno:4。

在另一優(yōu)選例中，增強(qiáng)子為cmvie啟動(dòng)子，選自與seqidno:5有至少95％同源性的核苷酸序列。更優(yōu)選地，所述的cmvie啟動(dòng)子選自與seqidno:5有至少96％、97％、98％、99％、100％同源性的核苷酸序列。最優(yōu)選地，所述的cmvie啟動(dòng)子的核苷酸序列選自seqidno:5。

在另一優(yōu)選例中，所述腺相關(guān)病毒載體可選自aav2，aav3，aav5，aav6，aav7，aav8，aav9，aav10，aav2-aav3，aavrh.10，aavhu.14，aav3a/3b，aavrh32.33，aav-hsc15，aav-hsc17，aavhu.37，aavrh.8，cht-p6，aav2.5，aav6.2，aav2i8，aav-hsc15/17，aavm41，aav9.45，aav6(y445f/y731f)，aav2.5t，aav-hae1/2，aavclone32/83，aavshh10，aav2(y->f)，aav8(y733f)，aav2.15，aav2.4，aavm41，aavr3.45aav2或aav5。更優(yōu)選地，腺相關(guān)病毒載體選自aav2和aav5。最優(yōu)選地，腺相關(guān)病毒載體選自aav2。

在另一優(yōu)選例中，所述腺相關(guān)病毒載體為自身互補(bǔ)型腺相關(guān)病毒。

在另一優(yōu)選例中，所述的腺相關(guān)病毒載體的核苷酸序列為seqidno:6。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于2型全色盲基因治療的藥物組合物，含有所述的腺相關(guān)病毒載體和藥學(xué)上可接受的載體。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的腺相關(guān)病毒載體在制備治療2型全色盲的藥物中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種基因治療2型全色盲的方法，將所述的腺相關(guān)病毒載體眼內(nèi)注射，增加正常hcnga3蛋白表達(dá)。優(yōu)選地，所述的眼內(nèi)注射是指視網(wǎng)膜下腔注射或玻璃體腔注射。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。

附圖說(shuō)明

圖1.包裝進(jìn)腺病毒載體的ptr-cba-at2rintron1-hcnga3質(zhì)粒模式圖，該質(zhì)粒包括cmvie增強(qiáng)子、cba(chickenbeta-actin)啟動(dòng)子、大鼠血管緊張素ii型受體內(nèi)含子1(ratat2rintron1)以及人環(huán)核苷酸門(mén)控通道α3基因(hcnga3)的cdna，hcnga3cdna之后是sv40聚腺苷酸化信號(hào)，表達(dá)盒兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列(tr)。

圖2.aav2-cba-at2rintron1-hcnga3載體和不帶有at2rintron1的aav2-cba-hcnga3載體視網(wǎng)膜下腔注射6個(gè)月后m-opsin視蛋白mrna對(duì)比。

圖3.aav2-cba-at2rintron1-hcnga3載體和不帶有at2rintron1的aav2-cba-hcnga3載體視網(wǎng)膜下腔注射6個(gè)月后s-opsin視蛋白mrna對(duì)比。

圖4.cpfl5小鼠在生后14天視網(wǎng)膜下腔注射aav2-cba-at2rintron1-hcnga3后12個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜電圖(erg)。

圖5.cpfl5小鼠在生后14天視網(wǎng)膜下腔注射aav2-cba-at2rintron1-hcnga3后12個(gè)月時(shí)視網(wǎng)膜鋪片m-opsin和s-opsin免疫熒光染色

具體實(shí)施方式

藥物組合物及藥盒

為了便于臨床應(yīng)用，本發(fā)明的藥物組合物可以包含在注射用給藥器(如注射用針)中，所述的注射用給藥器中，可以包含一次給藥量的所述的藥物組合物。所述的注射用給藥器可以被包含在藥盒中，以方便儲(chǔ)存、使用。運(yùn)輸時(shí)需要將裝有藥物懸濁液的微小容器放置于干冰中。平時(shí)應(yīng)保存于-80c冰箱中。

本發(fā)明所述的藥盒或試劑盒中，還可包括使用說(shuō)明書(shū)，以利于本領(lǐng)域技術(shù)人員按照正確的方式使用。

如本文所用，“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動(dòng)物而無(wú)過(guò)度不良副反應(yīng)(如毒性)的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。

合適的藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，n.j.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的載體的充分說(shuō)明。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、bbs(balancedsaltsolution)磷酸鹽緩沖液、ringer溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液、甘油或山梨醇等。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)滑劑、助流劑、潤(rùn)濕劑或乳化劑、ph緩沖物質(zhì)和穩(wěn)定劑，等。

基因治療載體

本發(fā)明中的基因治療載體是病毒表達(dá)載體。優(yōu)選的，根據(jù)本發(fā)明，病毒表達(dá)載體是腺相關(guān)病毒(avv)載體，諸如選自由血清型aav1、2、3、4、5、6、7、8、9和10，或其衍生的嵌合aav組成的組中的aav載體如aav2-aav3，aavrh.10，aavhu.14，aav3a/3b，aavrh32.33，aav-hsc15，aav-hsc17，aavhu.37，aavrh.8，cht-p6，aav2.5，aav6.2，aav2i8，aav-hsc15/17，aavm41，aav9.45，aav6(y445f/y731f)，aav2.5t，aav-hae1/2，aavclone32/83，aavshh10，aav2(y->f)，aav8(y733f)，aav2.15，aav2.4，aavm41，aavr3.45aav2或aav5，這能更好地適于在感興趣的組織中進(jìn)行高效率的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在轉(zhuǎn)染時(shí)，aav只在宿主中引起輕微的免疫反應(yīng)(如果有的話)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，基因治療載體是aav血清型2或5載體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因治療載體是aav2載體?，F(xiàn)有技術(shù)中認(rèn)為，aav包裝治療性基因的能力限制為約4.9kbp，而較長(zhǎng)序列會(huì)導(dǎo)致aav顆粒的截?cái)?wuetal.,2010,molther18:80-86)。然而，本文中表明，8.5kbp的超大dna序列(包括兩個(gè)反向末端重復(fù)序列(itr)，在cba或錐細(xì)胞特異性的pr2.1啟動(dòng)子控制下的at2rintron1和hcnga3cdna，以及sv40多聚腺苷酸信號(hào)的包裝，不影響aav5或aav2的產(chǎn)生以及hcnga3的高效表達(dá)。

本發(fā)明所述的aav載體包括單鏈aav和自身互補(bǔ)aav(self-complementaryaav，scaav)。采用scaav可以使hcnga3的表達(dá)更強(qiáng)，由于載體容量的限制，采用scaav時(shí)，可以使用scba。scba包含了cba啟動(dòng)子(seqidno:3)的序列和其下游一段縮短的嵌合內(nèi)含子(shortenedchimericintron1)序列(seqidno:13)。

可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生重組病毒載體。例如，重組腺相關(guān)病毒載體能在人293細(xì)胞(其提供反式e1a和e1b特性)中傳播，以達(dá)到在10⁷～10¹³個(gè)病毒顆粒/ml范圍內(nèi)的滴度。在體內(nèi)應(yīng)用之前，病毒載體可通過(guò)凝膠過(guò)濾方法(諸如瓊脂糖柱)進(jìn)行脫鹽，并通過(guò)隨后的過(guò)濾進(jìn)行純化。純化降低給藥載體的主體中潛在的有害作用。所給藥的病毒基本上不含野生型病毒和可復(fù)制型病毒。能通過(guò)合適的方法，諸如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)，隨后進(jìn)行銀染，來(lái)證明病毒的純度。

用于人的aav的合適劑量在約1×10¹⁰～1×10¹⁴個(gè)病毒顆粒的范圍內(nèi)。

基因治療載體是眼內(nèi)注射給藥的，可以采用視網(wǎng)膜下腔或玻璃體腔注射給藥。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明中的實(shí)施例如無(wú)特別說(shuō)明，所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑、耗材、儀器如下：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常c57bl/6j小鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。cpfl5小鼠購(gòu)自美國(guó)jackson實(shí)驗(yàn)室。光照周期12h光照-12h黑暗，自由采食，自由飲水。所有的動(dòng)物研究嚴(yán)格按照國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)頒發(fā)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行。

主要試劑、耗材生理鹽水(浙江天瑞藥業(yè)有限公司)；熒光素鈉(美國(guó)alcon公司)；30^1/2gauge一次性注射針頭(美國(guó)bectondickinsonandcompany公司)；1％阿托品滴眼液(美國(guó)alcon公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(沈陽(yáng)興齊眼藥股份有限公司)；鹽酸四環(huán)素氫化可的松眼膏(南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司)。抗紅/綠錐視蛋白(anti-m-opsin)、藍(lán)錐視蛋白(anti-s-opsin)(一抗)多克隆抗體(igg)(ab5405，ab5407),山羊抗兔igg-cy3(二抗)多克隆抗體(ap187c，德國(guó)millipore公司)。牛血清蛋白(bovineserumalbumin，bsa)(北京生興生物有限公司)，聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)(上海碧云天生物技術(shù)研究所)，4％多聚甲醛(北京海德生物有限公司)。

主要儀器眼科實(shí)驗(yàn)手術(shù)顯微鏡(日本nikon公司)；眼科顯微器械(蘇州明仁醫(yī)療器械有限公司)；微量進(jìn)樣器(美國(guó)hamilton公司)；micronⅳ視網(wǎng)膜影像系統(tǒng)(美國(guó)phoenixresearchlabs公司)；視覺(jué)電生理檢測(cè)系統(tǒng)(德國(guó)rolandconsult公司)；蔡司明視野顯微鏡(德國(guó)carlzesis公司)。

實(shí)施例1.ptr-cba-at2rintron1-hcnga3質(zhì)粒的構(gòu)建

人類cnga3(hcnga)的cdna(seqidno:1)被克隆到cba(chickenbetaactin)啟動(dòng)子(seqidno:3)的下游，兩者間具有cmvie增強(qiáng)子(seqidno:5)和特有的大鼠at2r(angiotensiniitype2receptor)intron1(seqidno:2)，可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)入基因hcnga的長(zhǎng)期表達(dá)。hcngacdna之后是sv40聚腺苷酸化信號(hào)(seqidno:8)。表達(dá)盒兩側(cè)是反向末端重復(fù)序列：itr5’(seqidno:7)，itr3’(seqidno:9)，病毒載體還包括cole1ori(seqidno:10)，amp(r)(seqidno:11)和f1(+)origin(seqidno:12)。

ptr-cba-at2rintron1-hcnga3質(zhì)粒的特征圖譜如圖1所示，各元件的起止位點(diǎn)如下：

itr5’起始:19終止:161

cmvie增強(qiáng)子起始:162終止:542

chikenbeta-actin啟動(dòng)子起始:543終止:825

ratat2rintron1起始:1900終止:2055

hcnga3cdna起始:2091終止:4195

sv40poly(a)起始:5333終止:5531

itr3’起始:5556終止:5698

cole1ori起始:6147終止:6372

amp(r)起始:6622終止:7622

f1(+)origin起始:8026終止:8485

質(zhì)粒的全長(zhǎng)序列如seqidno:6所示。

實(shí)施例2.ptr-pr2.1-at2rintron1-hcnga3質(zhì)粒的構(gòu)建

方法與實(shí)施例1一樣，區(qū)別僅在于用錐細(xì)胞特異的啟動(dòng)子pr2.1(seqidno:4)代替cba啟動(dòng)子。

實(shí)施例3.aav2-cba-at2rintron1-hcnga3病毒載體的構(gòu)建

載體是通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染方法獲得的。將含有aav2外殼蛋白基因、能幫助aav復(fù)制的基因的輔助質(zhì)粒和ptr-cba-at2rintron1-hcnga3質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞，初步形成aav2-cba-at2rintron1-hcnga3重組腺相關(guān)病毒載體。經(jīng)碘克丁醇初步純化后，經(jīng)過(guò)用5mlhitrapq瓊脂糖凝膠作為填料的快速蛋白液相色譜儀通過(guò)離子交換層析進(jìn)一步純化(使用儀器為pharmaciaaktafplcsystem(amershambiosciences,piscataway,nj)。之后用ph8.0的215mmnacl，淋洗瓊脂糖凝膠柱，對(duì)峰值的重組病毒載體進(jìn)行收集。收集的液體通過(guò)濃縮器(100kconcentrater,millipore)后，用含0.014％的吐溫20淋洗濃縮器對(duì)重組病毒載體進(jìn)行濃縮。滴度的測(cè)定通過(guò)用dnasei消化掉病毒顆粒以外dna的步驟，聚合酶連鎖反應(yīng)，用點(diǎn)雜交方法分出重組腺相關(guān)病毒載體相比標(biāo)準(zhǔn)載體(例如含有相同啟動(dòng)子的載體質(zhì))不同雜交信號(hào)強(qiáng)度，以此確定滴度。最后用硝酸銀染色的受到sds電泳法確保病毒載體顆粒沒(méi)被污染不含內(nèi)毒素。最后分裝零下80度儲(chǔ)存。

實(shí)施例4.cpfl5小鼠視網(wǎng)膜下腔注射病毒載體

實(shí)驗(yàn)方法

注射前一天下午小鼠經(jīng)1％阿托品滴眼液點(diǎn)眼1次，注射當(dāng)日8：00～12：00使用1％阿托品滴眼液點(diǎn)眼，每小時(shí)1次，共4次，于12：00～14：00用復(fù)方托吡卡胺滴眼液點(diǎn)眼以快速擴(kuò)瞳，每30分鐘1次，共4次(對(duì)照眼術(shù)前準(zhǔn)備相同)。擴(kuò)瞳至能看見(jiàn)晶狀體赤道部后，小鼠腹腔內(nèi)注射氯胺酮(72mg/kg)/甲苯噻嗪(4mg/kg)行全身麻醉，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5％鹽酸丙美卡因滴眼液點(diǎn)眼以局部麻醉。剪去小鼠胡須，將小鼠傾斜放于一硬質(zhì)紙板上，頭部抬高，操作者用一手固定小鼠體位。在小鼠結(jié)膜囊點(diǎn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5％羥丙基甲基纖維素以觀察眼底。微量進(jìn)樣器術(shù)前經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75％乙醇消毒。解剖顯微鏡下在瞳孔緣內(nèi)1mm處用301/2g的一次性針頭穿刺角膜，針頭斜面向上垂直進(jìn)入角膜全層的80％深度時(shí)，使針尖平行于晶狀體前表面進(jìn)入前房，避免傷及虹膜和晶狀體。然后用帶33g平針頭微量進(jìn)樣器沿穿刺口平行于晶狀體進(jìn)入前房，針頭繞過(guò)晶狀體后至玻璃體，接觸視網(wǎng)膜表面，繼續(xù)進(jìn)針至視網(wǎng)膜下腔。此時(shí)將微量進(jìn)樣器固定，試探性緩慢推動(dòng)進(jìn)樣器活塞，將帶有少量熒光素鈉的生理鹽水注射液注入視網(wǎng)膜下腔。如有綠色液體漏出，提示深度不夠，需繼續(xù)進(jìn)針少許；如長(zhǎng)時(shí)間未見(jiàn)視網(wǎng)膜隆起并伴有鞏膜綠染，提示可能進(jìn)針太深。約45s注入1μl溶液，然后針頭緩慢撤回，避免損傷虹膜及晶狀體。注射后小鼠用2.5％羥丙基甲基纖維素點(diǎn)入結(jié)膜囊以觀察眼底情況及熒光染料在視網(wǎng)膜的分布范圍。手術(shù)顯微鏡下如清楚看到眼底局部視網(wǎng)膜呈圓形隆起且網(wǎng)膜隆起下方可見(jiàn)綠色，證明注射成功。術(shù)中如不能看到視網(wǎng)膜隆起及其下方的綠色或看到視網(wǎng)膜有大出血等并發(fā)癥，則另選小鼠重新注射。術(shù)畢涂1％阿托品眼膏和四環(huán)素可的松眼膏，以后每隔1天重復(fù)一次，共三次，以減少炎癥反應(yīng)、防止感染。

自然產(chǎn)生的具有cnga3蛋白缺失的cpfl5模式小鼠具有正常的桿細(xì)胞功能，但沒(méi)有錐細(xì)胞功能。在cpfl5小鼠出生后14天，在每只小鼠一側(cè)眼注射1μl滴度為1×10¹³/ml的aav2-cba-at2rintron1-hcnga3(治療眼)，另一側(cè)眼則不注射作為對(duì)照(非治療眼)。

實(shí)施例5.at2rintron1對(duì)aav功能增強(qiáng)的檢測(cè)

結(jié)果如圖2和3所示。應(yīng)用不帶有ratat2rintron1的aav2-cba-hcnga3和帶有ratat2rintron1的aav2-cba-at2rintron1-hcnga35載體注射同一只生后14天的cpfl5小鼠的右眼和左眼，6個(gè)月后，不帶有ratat2rintron1的aav2-cba-hcnga3載體注射眼的m-opsin和s-opsin的水平分別只有帶ratat2rintron1的aav2-cba-at2rintron1-hcnga3載體注射眼水平的40％和30％。

實(shí)施例6.erg檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)方法

cpfl5小鼠視網(wǎng)膜下腔注射后12個(gè)月進(jìn)行視網(wǎng)膜電圖(electroretinogram,erg)檢測(cè)。暗適應(yīng)過(guò)夜，為消除不同時(shí)間檢測(cè)對(duì)erg幅值產(chǎn)生的影響，檢測(cè)均設(shè)在下午，在暗室內(nèi)暗紅光照下操作(>650nm)。小鼠放置在37℃恒溫臺(tái)上，眼表滴一滴復(fù)方托吡卡胺滴眼液后行全身麻醉，剪去胡須。將參考電極和接地電極插入頭部和尾根部皮下，一對(duì)金制的環(huán)形電極放置在角膜表面，滴少量0.5％羥甲基纖維素滴眼液于角膜表面濕潤(rùn)保護(hù)角膜及降低干擾，增強(qiáng)導(dǎo)電性。全視野暗適應(yīng)erg在-1.85和0logcd·s/m2光強(qiáng)度下記錄，明適應(yīng)erg在0.65logcd·s/m2光強(qiáng)度下記錄，在明適應(yīng)erg記錄之前小鼠在背景光強(qiáng)度為30cd·s/m2下照射10min。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，左上方為暗適應(yīng)(dark-adapted)下注射了病毒載體的治療眼和未注射的對(duì)側(cè)未治療眼的erg幅值，顯示桿細(xì)胞功能；左下方為明適應(yīng)下(light-adapted)治療眼和未治療眼erg幅值,顯示錐細(xì)胞功能。右方為暗適應(yīng)下10hz閃爍erg。

結(jié)果顯示，自然產(chǎn)生的具有cnga3蛋白缺失的cpfl5模式小鼠具有正常的桿細(xì)胞功能，但沒(méi)有錐細(xì)胞功能。

和未注射眼相比，注射眼的暗適應(yīng)下視網(wǎng)膜電流圖(erg)在不同刺激強(qiáng)度下略有下降(和視網(wǎng)膜下腔注射引起的網(wǎng)膜脫離造成的損害有關(guān))；未注射眼視網(wǎng)膜桿細(xì)胞功能基本正常。

cpfl5小鼠的注射了aav2-cba-at2rintron1-hcnga3治療的一側(cè)眼其錐細(xì)胞功能獲得恢復(fù)，注射后12個(gè)月仍然維持，b-wave幅度約為普通未注射c57bl/6j小鼠的50％。相比之下，對(duì)側(cè)未治療眼則檢測(cè)不到錐細(xì)胞erg.

暗適應(yīng)閃爍erg則清晰顯示aav2-cba-at2rintron1-hcnga3載體基因轉(zhuǎn)入恢復(fù)了cpfl5小鼠的錐細(xì)胞功能。應(yīng)用暗適應(yīng)下10hz閃爍erg，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在低強(qiáng)度光刺激下誘導(dǎo)出的桿細(xì)胞功能在治療眼和未治療眼基本相同；但隨著刺激強(qiáng)度的提高，桿細(xì)胞功能逐漸被抑制，在最強(qiáng)光線刺激下桿細(xì)胞的功能完全被抑制，展現(xiàn)出的都是錐細(xì)胞功能，這時(shí)只有治療眼有代表錐細(xì)胞和功能的波形，而未治療眼的錐細(xì)胞功能為零，波形為直線。

實(shí)施例7.視網(wǎng)膜鋪片

實(shí)驗(yàn)方法

視網(wǎng)膜鋪片的準(zhǔn)備與固定：在手術(shù)顯微鏡下用角膜剪沿角鞏緣將角膜虹膜剪掉僅保留12點(diǎn)烙印處，然后將眼球剩余部分放入4％多聚甲醛中固定5min后去除晶狀體，所得眼杯繼續(xù)固定20min后沿烙印處垂直于角鞏緣剪一切口，用有齒鑷夾住視神經(jīng)周邊處?kù)柲げ⒂眉舻都舻舸颂庫(kù)柲ぜ耙暽窠?jīng)節(jié)，暴露出視神經(jīng)處視網(wǎng)膜。將角膜剪從此處伸入視網(wǎng)膜色素上皮和神經(jīng)網(wǎng)膜層之間的潛在間隙，緩慢鈍性剝離后極部視網(wǎng)膜，并逐漸將剝離開(kāi)的鞏膜脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜色素上皮層向兩側(cè)剪開(kāi)并外翻剝離出完整視網(wǎng)膜。4％多聚甲醛中繼續(xù)固定24h。

免疫熒光染色與視網(wǎng)膜鋪片：將固定好的神經(jīng)視網(wǎng)膜放入pbs中漂洗3次，每次10min，并將玻璃體纖維等殘余物取凈。接著用彎鑷子將視網(wǎng)膜移入0.3％tritonx-100溶液中室溫下浸泡3h，pbs中輕輕吹打漂洗3次后再置于5％的bsa中室溫下孵育3h，取出視網(wǎng)膜，不洗，將雙眼視網(wǎng)膜放入含抗s-opsin或抗m-opsin的多克隆抗體(1:400，用含1％bsa和0.1％tritonx-100的稀釋液稀釋)的96孔板中，4℃孵育過(guò)夜。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照(每組1只眼)，不加一抗，用稀釋液代替。吸去一抗，水平搖床上0.1％tritonx-100溶液洗3次，每次20min。滴加山羊抗兔igg-cy3(1:800，pbs稀釋)室溫避光孵育1小時(shí)，暗室下水平搖床上0.1％tritonx-100溶液洗3次，每次10min。手術(shù)顯微鏡下將視網(wǎng)膜以視盤(pán)為中心，12點(diǎn)鐘開(kāi)口處為基準(zhǔn)，放射狀剪成4瓣，將其分為顳上、顳下、鼻上和鼻下4個(gè)象限。用彎鑷子將視網(wǎng)膜輕輕移到載玻片上的pbs珠滴上，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞面朝上，將載玻片上的pbs液體吸除大部，并將視網(wǎng)膜平鋪開(kāi)來(lái)(有時(shí)因視網(wǎng)膜彎曲度較大無(wú)法完全平鋪，可以在此時(shí)再多剪幾瓣)，12點(diǎn)鐘開(kāi)口朝上，滴少許抗熒光淬滅劑封片。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過(guò)免疫熒光染色的視網(wǎng)膜鋪片如圖5所示，小鼠中視網(wǎng)膜中有看紅綠色的m-視蛋白(opsin)和看紅色的s-視蛋白。應(yīng)用免疫染色可以看到，在12月齡的未治療cpfl5小鼠視網(wǎng)膜中，m-視蛋白和s-視蛋白都已變性消失。而治療眼中大部分的m-視蛋白和s-視蛋白都正常存在。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。

序列表

<110>沈陽(yáng)復(fù)明生物技術(shù)有限公司

<120>一種用于治療2型全色盲病人的重組腺相關(guān)病毒基因治療載體及藥物

<130>2017

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<213>人工序列

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<223>縮短的嵌合內(nèi)含子

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