微藻發(fā)酵液胞外多糖、其制備方法及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及提取自微藻發(fā)酵液的胞外多糖、其制備方法及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 裂殖壺藻（Schizochytrium Iimacinum)是一類海洋真菌，屬于真菌門網(wǎng)黏菌綱破 囊壺菌科，是一種單細胞球形真菌。破囊壺菌屬于嗜腐敗微生物，廣泛存在于有機物豐富 和鹽度高的環(huán)境中，這類真菌繁殖速度快，抗逆性強，易于大規(guī)模培養(yǎng)，由于該類細胞中所 含DHA的比例可以達到細胞干重的20%左右，因此是目前進行工業(yè)化培養(yǎng)作為DHA來源的 理想物種。這類微藻在發(fā)酵產(chǎn)生DHA的同時，會分泌出大量的多糖類物質(zhì)，這類多糖或多糖 復合物存在于細胞壁外，易與菌體分離，被稱為胞外多糖（EPS)。這些胞外多糖可以使發(fā)酵 液的粘度增大、最大溶氧量急劇下降，從而對發(fā)酵的進程造成一定的影響，因此，這類胞外 多糖常常被作為副產(chǎn)物而舍棄。根據(jù)目前的研究水平，多糖類物質(zhì)具有多樣性、復雜性的特 點，并且由于其獨特的理化性質(zhì)和顯著的生理活性越來越受到人們的關(guān)注，因此，如果能夠 對這部分多糖類物質(zhì)加以研究開發(fā)，則能夠充分挖掘和利用這些副產(chǎn)物的附加值，從而創(chuàng) 造一定的經(jīng)濟效益。
[0003] 裂殖壺藻作為破囊壺菌科中的一種，其安全性已經(jīng)得到了 FDA的認可，關(guān)于對裂 殖壺藻的研究，目前基本都集中在脂類方面的研究（如發(fā)酵時所產(chǎn)生的DHA的研究）等， 而對于發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的細胞外多糖和其他物質(zhì)則研究甚少。汪少蕓曾研究了裂殖壺 藻叩.1101101的發(fā)酵液中胞外多糖的抗氧化和抑菌活性（福州大學學報2011，39(5) : 786-791)。曹歡研究了裂殖壺藻細胞內(nèi)多糖的提取分離和結(jié)構(gòu)特征（中國海洋藥物雜志 2011，30 (6) :1_5)。CN103204951A公開了一種裂殖壺藻胞外多糖的分離純化方法。而國外 對于裂殖壺藻發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的胞外多糖也研究甚少，僅見US8232090B2中報道了一種 裂殖壺藻突變菌株MTCC 5249及其所產(chǎn)生的DHA脂質(zhì)和胞外多糖。因此，就目前的文獻報 道看，對于裂殖壺藻S-31在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的細胞外多糖的研究還是空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明首次公開了一種胞外多糖及其制備方法，并公開了該多糖的結(jié)構(gòu)特征，及 其生物學活性，該多糖具有顯著的抗氧化活性，可以應(yīng)用于食品抗氧化以及果蔬保鮮。本發(fā) 明的方法制備過程操作簡便。本發(fā)明的胞外多糖在發(fā)酵菌株、發(fā)酵培養(yǎng)條件、多糖結(jié)構(gòu)特征 方面，與上述文獻所報道的裂殖壺藻胞外多糖均有顯著的不同。
[0005] 因此，本發(fā)明提供一種胞外多糖組合物，其中，以該胞外多糖的摩爾百分比計，該 胞外多糖含有半乳糖73. 00-85. 00 %，葡萄糖5. 50-8. 50 %，甘露糖2. 50-8. 00 %，鼠李糖 2. 00-6. 00 %，巖藻糖 L 50-3. 80 % 和木糖 L 20-2. 50%。
[0006] 在一個具體實施例中，該胞外多糖的平均分子量為4_23kD。
[0007] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有半乳糖 75. 00-82. 00 % 〇
[0008] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有葡萄糖5. 70-8. 20%。
[0009] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有甘露糖3. 00-8. 00%。
[0010] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有鼠李糖2. 50-5. 80 %。
[0011] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有巖藻糖1. 80-3. 50%。
[0012] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有木糖1. 40-2. 20%。
[0013] 在一個具體實施例中，以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有半乳糖 75. 00-82. 00 %，葡萄糖 5. 70-8. 20 %，甘露糖 3. 00-8. 00 %，鼠李糖 2. 50-5. 80 %，巖藻糖 L 80-3. 50 %，和木糖 L 40-2. 20 %。
[0014] 在一個具體實施例中，所述胞外多糖中各單糖組成摩爾百分比為：半乳糖 75. 59%，葡萄糖7. 20%，甘露糖7. 98%，鼠李糖4. 92%，巖藻糖2. 75%，和木糖1. 57%。
[0015] 在一個具體實施例中，所述胞外多糖中各單糖組成摩爾百分比為：半乳糖 73. 60 %，葡萄糖8. 16 %，甘露糖7. 53 %，鼠李糖5. 76 %，巖藻糖3. 49 %，和木糖1. 45 %。
[0016] 在一個具體實施例中，所述胞外多糖中各單糖組成摩爾百分比為：半乳糖 84. 23%，葡萄糖5. 72%，甘露糖2. 97%，鼠李糖3. 00%，巖藻糖1. 89%，和木糖2. 19%。
[0017] 在一個具體實施例中，以組合物的總重計，所述組合物含有75. 0 - 90. 0%的所述 胞外多糖。
[0018] 在一個具體實施例中，所述組合物還含有糖醛酸和蛋白質(zhì)。
[0019] 在一個具體實施例中，所述糖醛酸和蛋白質(zhì)均來自裂殖壺藻。
[0020] 在一個具體實施例中，以組合物的總重計，所述組合物含有2. 0 - 10. 0%的糖醛 酸。
[0021] 在一個具體實施例中，以組合物的總重計，所述組合物含有8. 0 - 15. 0%的蛋白 質(zhì)。
[0022] 在一個具體實施例中，以組合物的總重計，所述組合物含有：
[0023] (1)75.0 - 90.0%的所述胞外多糖；
[0024] (2) 2. 0 - 10. 0% 的糖醛酸；和
[0025] (3)8. 0 - 15. 0%的蛋白質(zhì)。
[0026] 在一個具體實施例中，以組合物的總重計，所述組合物含有：
[0027] (1)77.0 - 88.0%的所述胞外多糖；
[0028] (2) 3. 0 - 8. 0% 的糖醛酸；和
[0029] (3)9. 0 - 14. 0%的蛋白質(zhì)。
[0030] 在一個具體實施例中，所述胞外多糖來自裂殖壺藻sp. S-31菌株。
[0031] 在一個具體實施例中，所述裂殖壺藻sp. S-31菌株在以下條件下發(fā)酵：
[0032] (a)挑選活化后的單菌落，接種到種子液培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床培 養(yǎng)48小時，至種子液濃度約干重15-20g/L ;
[0033] (b)按10 %的接種量，種子液接到7. 5L的種子罐培養(yǎng)基中，在28°C，600rpm轉(zhuǎn)速 下通氣培養(yǎng)36小時，發(fā)酵液中細胞干重達24g/L ;
[0034] (c)按10%的接種量，種子液接種到50L的發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，裝液量18L，在28°C， 300rpm-600rpm轉(zhuǎn)速下，通氣培養(yǎng)120小時，發(fā)酵過程中向發(fā)酵罐流加碳源溶液和氮源溶 液。
[0035] 在一個具體實施例中，所述胞外多糖組合物采用以下步驟制備得到：
[0036] (1)醇提?。簩⒘阎硥卦灏l(fā)酵液加到醇的水溶液中進行提取，離心獲得上清液，減 壓濃縮得到濃縮液；
[0037] (2)萃?。翰捎糜袡C溶劑萃取步驟（1)所得濃縮液，收集水相部分；
[0038] (3)除蛋白：將步驟（2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水層部分；
[0039] (4)透析：將步驟（3)所得的水層部分進行透析，透析后濃縮；
[0040] (5)沉淀多糖：將醇的水溶液加到步驟（4)所得的濃縮樣品中，進行多糖沉淀；和
[0041] (6)洗滌、干燥：將步驟（5)中析出的多糖沉淀進行過濾、洗滌、干燥；
[0042] 從而獲得所述胞外多糖組合物。
[0043] 在一個具體實施例中，上述制備胞外多糖的步驟還包括：
[0044] (7)純化步驟（6)所獲得的胞外多糖組合物。
[0045] 在一個具體實施例中，所述純化步驟（7)包括：
[0046] (7 - 1)將步驟（6)所得的含胞外多糖的組合物溶解后進行離子交換色譜（例如 通過DEAE-52纖維素柱）純化，以水洗脫，收集含有多糖的水洗脫液，獲得洗脫液I ;
[0047] (7 - 2)用0. 1M-0. 3M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽 緩沖液的洗脫劑洗脫步驟（7)的柱，獲得洗脫液II ;
[0048] (7 - 3)用0. 5M-0. 8M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽 緩沖液的洗脫劑洗脫步驟（8)的柱，獲得洗脫液III ;
[0049] (8)分別透析洗脫液I、洗脫液II以及洗脫液III ;和
[0050] (9)對步驟（8)所獲得的各透析部分進行分子排阻色譜（例如上樣到S^hadex G-100凝膠柱）純化，用去離子水洗脫，分別收集含有多糖的部分。
[0051] 在一個具體實施例中，所述洗脫劑為氯化鈉溶液。
[0052] 在一個具體實施例中，步驟（7 - 2)和（