實驗。另取殼聚糖樣品適量，加水溶解并配制成濃度為12mg/ml的溶液，同時進行FRAP實 驗。分別取上述配制的樣品溶液50 μ L加至96孔板中，再加入FRAP試液150 μ L，在37°C 下反應(yīng)lOmin，在593nm下測定吸光度。以FeSO4為對照品，按照同樣操作繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求 算各多糖還原能力相當(dāng)于Fe 2+的濃度。結(jié)果顯示，本發(fā)明中制得的胞外多糖的還原能力顯 著高于殼聚糖，其中EPS-2的還原能力最強。結(jié)果見表3所示：
[0177] 表3.多糖樣品FRAP實驗結(jié)果
[0179] 應(yīng)用實施例3:
[0180] 分別取實施例1中制得的胞外多糖EPS和實施例7中制得的胞外多糖組分EPS-1、 EPS-2、EPS-3適量，加水溶解并分別配制成濃度為0. 5mg/ml的溶液，進行ORAC抗氧化能 力實驗測定。另取殼聚糖樣品適量，加水溶解并配制成濃度為〇. 5mg/ml的溶液，同時進行 ORAC實驗。分別取上述配制的樣品溶液和PBS緩沖液20 μ L加至96孔板中，由酶標(biāo)儀自 動加入38°C下預(yù)熱的1 μ M的熒光素溶液200 μ L，再加入AAPH溶液20 μ L，于37. 5°C下測 定體系的熒光強度變化。其中激發(fā)光波長為485nm，發(fā)射光波長為520nm，進行60個循環(huán)測 定，每個循環(huán)45秒。以Trolox為對照，計算樣品、對照品及空白的曲線下面積AUC，并計算 其ORAC值。結(jié)果顯示，本發(fā)明中制得的胞外多糖的抗氧化能力顯著高于殼聚糖，結(jié)果見表 4所示：
[0181] 表4.多糖樣品ORAC實驗結(jié)果
[0183] 應(yīng)用實施例4:
[0184] 對實施例1中制得的胞外多糖EPS進行果蔬保鮮作用實驗。以青蘋果和大棗為實 驗材料，以殼聚糖為陽性對照，取實施例1中的胞外多糖樣品（EPS)適量，加水溶解后配制 成0. 5%、1. 0%的溶液，陽性對照殼聚糖加水配制成1. 0%的溶液，分別涂膜于青蘋果和大 棗表面，分別在第2、5、8天觀察樣品的失水率。結(jié)果顯示：不同濃度的胞外多糖溶液對于青 蘋果和大棗都具有一定的保鮮作用，樣品失水率均低于空白對照組，其中，1.0%的胞外多 糖溶液對果蔬的保鮮作用與I. 〇%殼聚糖溶液相當(dāng)，實驗結(jié)果見下表5。
[0185] 表5.樣品失水率變化結(jié)果（％ )
[0187] 此實驗表明本發(fā)明中制備的胞外多糖對于果蔬的保鮮具有積極的作用，可以用于 果蔬的保鮮。
【主權(quán)項】
1. 一種胞外多糖組合物，其中，以該胞外多糖的摩爾百分比計，該胞外多糖含有半乳糖 73. 00-85. 00 %，葡萄糖 5. 50-8. 50 %，甘露糖 2. 50-8. 00 %，鼠李糖 2. 00-6. 00 %，巖藻糖 1. 50-3. 80 % 和木糖 1. 20-2. 50%。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述組合物具有以下一個或多個特征： (1) 該胞外多糖的平均分子量為4-23kD ; (2) 以摩爾百分比計，所述胞外多糖含有半乳糖75. 00-82. 00%，葡萄糖5. 70-8. 20%， 甘露糖 3. 00-8. 00 %，鼠李糖 2. 50-5. 80 %，巖藻糖 1. 80-3. 50 %，和 / 或木糖 1. 40-2. 20 %; (3) 所述胞外多糖中各單糖的摩爾百分比為：半乳糖75. 59%，葡萄糖7. 20%，甘露糖 7. 98%，鼠李糖4. 92%，巖藻糖2. 75%，和木糖1. 57% ; (4) 所述胞外多糖中各單糖的摩爾百分比為：半乳糖73. 60%，葡萄糖8. 16%，甘露糖 7. 53%，鼠李糖5. 76%，巖藻糖3. 49%，和木糖1. 45% ; (5) 所述胞外多糖中各單糖的摩爾百分比為：半乳糖84. 23%，葡萄糖5. 72%，甘露糖 2. 97%，鼠李糖3.00%，巖藻糖1.89%，和木糖2. 19% ; (6) 以組合物的總重計，所述組合物含有75. 0 - 90. 0%的所述胞外多糖； (7) 所述組合物還含有糖醛酸和蛋白質(zhì)； (8) 以組合物的總重計，所述組合物含有2. 0 - 10. 0%的糖醛酸； (9) 所述組合物含有8. 0 - 15. 0%的蛋白質(zhì)； (10) 以組合物的總重計，所述組合物含有： (i) 75. 0 - 90. 0 %的所述胞外多糖； (11) 2.0 - 10.0 %的糖醛酸；和 (iii)8.0 - 15.0%的蛋白質(zhì)；和 (11)以組合物的總重計，所述組合物含有： (a) 77. 0 - 88. 0 %的所述胞外多糖； (b) 3. 0 - 8.0 %的糖醛酸；和 (c) 9.0 - 14.0% 的蛋白質(zhì)。3. 如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其特征在于，所述胞外多糖組合物采用以下步驟制 備得到： (1) 醇提?。簩⒘阎硥卦灏l(fā)酵液加到醇的水溶液中進行提取，固液分離，將獲得的溶液 濃縮，優(yōu)選減壓濃縮，得到濃縮液； (2) 萃?。翰捎糜袡C溶劑萃取步驟（1)所得濃縮液，收集水相部分； (3) 除蛋白：將步驟（2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水層部分； (4) 透析：將步驟（3)所得的水層部分進行透析，透析后濃縮； (5) 沉淀多糖：將醇的水溶液加到步驟（4)所得的濃縮樣品中，進行多糖沉淀；和 (6) 洗滌、干燥：將步驟（5)中析出的多糖沉淀進行過濾、洗滌、干燥； 從而獲得所述胞外多糖組合物。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物，其特征在于，所述制備胞外多糖的步驟還包括： (7) 將步驟（6)所得的含胞外多糖的組合物溶解后進行離子交換色譜純化，以水洗脫， 收集含有多糖的水洗脫液，獲得洗脫液I ; (8) 用0. 1M-0. 3M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽緩沖液的 洗脫劑洗脫步驟（7)的柱，獲得洗脫液II ; (9) 用0. 5M-0. 8M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽緩沖液的 洗脫劑洗脫步驟（8)的柱，獲得洗脫液III ; (10) 分別透析洗脫液I、洗脫液II以及洗脫液III ;和 (11) 對步驟（9)所獲得的各透析部分進行分子排阻色譜純化，用去離子水洗脫，分別 收集含有多糖的部分。5. 如權(quán)利要求4所述的組合物，其特征在于，步驟（8)和（9)分別使用氯化鈉溶液進行 洗脫。6. -種制備含胞外多糖的組合物的方法，所述方法包括以下步驟： (1) 醇提?。簩⒘阎硥卦寰辏▋?yōu)選為裂殖壺藻ATCC20888)的發(fā)酵液加到醇的水溶液 中進行提取，離心獲得上清液，減壓濃縮得到濃縮液； (2) 萃取：采用有機溶劑萃取步驟（1)所得濃縮液，收集水相部分； (3) 除蛋白：將步驟（2)所得水相部分中的蛋白沉淀除去，收集水層部分； (4) 透析：將步驟（3)所得的水層部分進行透析，透析后濃縮； (5) 沉淀多糖：將醇的水溶液加到步驟（4)所得的濃縮樣品中，進行多糖沉淀；和 (6) 洗滌、干燥：將步驟（5)中析出的多糖沉淀進行過濾、洗滌、干燥； 從而獲得所述胞外多糖。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法還包括： (7) 將步驟（6)所得的含胞外多糖的組合物溶解后進行離子交換色譜純化，以水洗脫， 收集含有多糖的水洗脫液，獲得洗脫液I ; (8) 用0. 1M-0. 3M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽緩沖液的 洗脫劑洗脫步驟（7)的柱，獲得洗脫液II ; (9) 用0. 5M-0. 8M的選自氯化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液、氫氧化鈉溶液和磷酸鹽緩沖液的 洗脫劑洗脫步驟（8)的柱，獲得洗脫液III ; (10) 分別透析洗脫液I、洗脫液II以及洗脫液III ;和 (11) 對步驟（9)所獲得的各透析部分進行分子排阻色譜純化，用去離子水洗脫，分別 收集含有多糖的部分。8. 權(quán)利要求6或7所述方法的步驟（3)及步驟（3)之后各步所獲得的含胞外多糖的組 合物。9. 一種抗氧化劑或保鮮劑，其特征在于，所述抗氧化劑或保鮮劑含有權(quán)利要求1 一 5和 8中任一項所述的組合物。10. 權(quán)利要求1 一 5和8中任一項所述的組合物在抗氧化和果蔬保鮮中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及微藻發(fā)酵液胞外多糖、其制備方法及用途。具體而言，本發(fā)明提供一種胞外多糖組合物，以該胞外多糖的摩爾百分比計，該胞外多糖含有半乳糖73.00-85.00％，葡萄糖5.50-8.50％，甘露糖2.50-8.00％，鼠李糖2.00-6.00％，巖藻糖1.50-3.80％和木糖1.20-2.50％。本發(fā)明還涉及該組合物的制備方法，以及采用該方法制得的組合物。本發(fā)明的組合物具有顯著的抗氧化活性，可以應(yīng)用于食品抗氧化以及果蔬保鮮。因此，本發(fā)明還涉及含有所述組合物的抗氧化劑和保鮮劑，以及所述組合物在抗氧化和果蔬保鮮中的應(yīng)用。
【IPC分類】C07H1/06, C12R1/645, A23L3/3562, A23B7/154, C12P19/02, C07H3/02
【公開號】CN105685766
【申請?zhí)枴緾N201410699259
【發(fā)明人】張戈, 徐志村, 鄒彥平, 常桂芳
【申請人】豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
【公開日】2016年6月22日
【申請日】2014年11月27日