一種乳酸菌胞外多糖的制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種乳酸菌胞外多糖的發(fā)酵制備方法，屬于微生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌胞外多糖是一種被分泌到細(xì)胞外的多糖，它或者W芙膜的形式附著在細(xì) 胞表面，或者W粘液的形式分散在胞外環(huán)境中，分別被稱為附著胞外多糖和游離胞外多糖 (或芙膜多糖和黏液多糖）。在自然環(huán)境中，胞外多糖通常起著保護(hù)微生物的作用，它可W 避免細(xì)胞干燥脫水，遭隧菌體浸染、受抗生素或者有毒物質(zhì)損害、原生動(dòng)物傷害，還可W穩(wěn) 定滲透壓、支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)、參與細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞構(gòu)成等。
[0003] 近幾年，乳酸菌胞外多糖作為深入探討對(duì)象是因?yàn)閃下兩個(gè)原因：一是，由于乳酸 菌胞外多糖物理化學(xué)的特性，常常當(dāng)作添加劑加入到食物中或者由乳酸發(fā)酵的食品里，運(yùn) 會(huì)優(yōu)化食品的特性，如保證良好的質(zhì)構(gòu)、提高穩(wěn)定性、保證持水性W及延長(zhǎng)保質(zhì)期等；二是， 乳酸菌胞外多糖擁有大量對(duì)人體生命活動(dòng)有益的生物功能。
[0004] 乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生胞外多糖受到多種因素相互作用，主要是培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件 對(duì)胞外多糖合成量和組成存在較大相互作用。雖然乳酸菌產(chǎn)生的胞外多糖的功能及應(yīng)用廣 泛，但是現(xiàn)有的方法產(chǎn)量低，如何提高乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量是現(xiàn)在面臨的主要問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)乳酸菌產(chǎn)生胞外多糖產(chǎn)量的問題，本發(fā)明的目的是提供一種能提高乳酸菌胞 外多糖產(chǎn)量的制備方法。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，包括如下步驟：
[0007]1)將乳酸菌從平板上活化，挑取單菌落至IOmlMRS培養(yǎng)液，37°C，18化pm搖床培養(yǎng)12h，得到乳酸菌發(fā)酵液。
[000引。將乳酸菌發(fā)酵液W1-5 %的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始抑值為 4. 5-8. 5,于25-40°C下，培養(yǎng)8-16h，得乳酸菌胞外多糖。
[0009] 所述的MRS液體培養(yǎng)基的組成為：按重量百分比，碳源2%，氮源1%，憐酸氨二鐘 0. 1-0.8%，牛肉膏1 %，酵母粉0. 5%，巧樣氨二胺0. 2%，乙酸鋼0. 5%，硫酸儀0. 058%，硫 酸儘0. 025%，蒸饋水IL;組成的MRS液體培養(yǎng)基的碳氮比為3:1-1: 3。
[0010] 3)純化：將乳酸菌胞外多糖溶于水中，然后緩慢加入DEAE-D52纖維素柱中，用 蒸饋水和0. 1-2.OmoL/L濃度的化Cl進(jìn)行梯度洗脫，合并洗脫主峰的洗脫液，用分子量在 1000 kd-SOOOkd的透析袋中透析2地。
[0011] 上述的一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，所述的MRS液體培養(yǎng)基中，所述的碳源 為葡萄糖、乳糖、薦糖、果糖或殼聚糖。優(yōu)選的，所述的碳源為葡萄糖。
[0012] 上述的一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，所述的MRS液體培養(yǎng)基中，所述的氮源 為蛋白腺、膜蛋白腺、尿素、氯化錠或硫酸錠。優(yōu)選的，所述的氮源為蛋白腺。
[0013] 上述的一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，所述的MRS液體培養(yǎng)基中，優(yōu)選的，所述 的憐酸氨二鐘的含量為0.6%。
[0014] 上述的一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，所述的MRS液體培養(yǎng)基中，優(yōu)選的，所述 的碳氮比為2:1。
[0015] 優(yōu)選的，上述的一種乳酸菌胞外多糖的制備方法，將乳酸菌發(fā)酵液W2%的接種量 接種于MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始抑值為7. 5,于34°C下，培養(yǎng)12h。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明在MRS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，通過培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條 件的優(yōu)化，得出乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量最高的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，W此來增加乳酸菌胞 外多糖的產(chǎn)量，通過本發(fā)明的方法制備的乳酸菌胞外多糖具有抗氧化、抑制胃癌細(xì)胞增殖、 誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞調(diào)亡等作用。
【附圖說明】
[0017] 圖1是胞外多糖純化結(jié)果。
[0018] 圖2是Gimesa染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0019] 其中，Al:空白作用化細(xì)胞形態(tài)變化；A2:加藥作用化細(xì)胞形態(tài)變化；
[0020] Bl:空白作用1化細(xì)胞形態(tài)變化；B2 :加藥作用1化細(xì)胞形態(tài)變化；
[0021]Cl:空白作用24h細(xì)胞形態(tài)變化；C2:加藥作用24h細(xì)胞形態(tài)變化。
[0022] 圖3是DNALadder法實(shí)驗(yàn)結(jié)果；
[002引其中，M :Marker ;K:空白對(duì)照；6:加藥作用6小時(shí)；12:加藥作用12小時(shí)；24:加藥 作用24小時(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1乳酸菌胞外多糖培養(yǎng)基的確定
[002引方法：1)將乳酸菌從平板上活化，挑取單菌落至IOmlMRS培養(yǎng)液，37°C，18化pm搖 床培養(yǎng)12h，得到乳酸菌發(fā)酵液；
[0026] 2)將乳酸菌發(fā)酵液W2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)初始抑值為 6. 5,于 37°C下，轉(zhuǎn)速為 200r/min，培養(yǎng) 12h。
[0027] 3)W不接種乳酸菌發(fā)酵液為空白對(duì)照組，根據(jù)苯酪硫酸法，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在 490nm處的吸光度，計(jì)算多糖濃度。
[0028](一）不同碳源的影響
[0029] 方法同上，MRS液體培養(yǎng)基的組成為：按重量百分比，碳源（種類如表1)2%，蛋白 腺1 %，憐酸氨二鐘0. 2%，牛肉膏1 %，酵母粉0. 5 %，巧樣氨二胺0. 2%，乙酸鋼0. 5%，硫 酸儀0.058 %，硫酸儘0.025 %，蒸饋水IL;結(jié)果如表1。
[0030] 表1
[0031]
[0032] 由表1可見，對(duì)碳源的優(yōu)化可W看出乳糖為碳源時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量最高，可達(dá)到 57ug/ml，葡萄糖和薦糖的胞外多糖的產(chǎn)量分別為42ug/ml、40ug/ml。果糖和殼聚糖的產(chǎn)量 比較低。
[0033](二）不同氮源的影響
[0034] 方法同上，MRS液體培養(yǎng)基的組成為：按重量百分比，葡萄糖2%，氮源（種類如表 2) 1 %，憐酸氨二鐘0. 2 %，牛肉膏1 %，酵母粉0. 5 %，巧樣氨二胺0. 2 %，乙酸鋼0. 5 %，硫酸 儀0.058 %，硫酸儘0.025 %，蒸饋水1L。結(jié)果如表2。
[0035]表2
[0036]
陽037] 由表2可見，在氮源的篩選實(shí)驗(yàn)中，氯化錠作為氮源時(shí)胞外多糖的產(chǎn)量達(dá)到最高， 150ug/ml。膜蛋白腺和蛋白腺胞外多糖的產(chǎn)量分別為110ug/ml、100ug/ml。尿素和硫酸錠 的產(chǎn)量較低。
[0038] (S)不同憐酸氨二鐘含量的影響
[0039] 方法同上，MRS液體培養(yǎng)基的組成為：按重量百分比，葡萄糖2%，蛋白腺1%，憐 酸氨二鐘含量如表3,牛肉膏1 %，酵母粉0. 5%，巧樣氨二胺0. 2 %，乙酸鋼0. 5 %，硫酸儀 0.058 %，硫酸儘0.025 %，蒸饋水1L。結(jié)果如表3。
[0040]表 3
[0041]
陽04引由表3可見，隨著憐酸鹽含量的增加，胞外多糖的產(chǎn)量也隨著增加，在0.8%達(dá)到 最高，產(chǎn)量為167ug/ml。憐酸鹽含量為0. 1%時(shí)，胞外多糖的產(chǎn)量最低可達(dá)到llOug/ml。
[0043](四）不同碳氮比的影響
[0044] 方法同上，MRS液體培養(yǎng)基的組成為：按重量百分比，葡萄糖2%，蛋白腺1%， 憐酸氨二鐘0. 2 %，牛肉膏1 %，酵母粉0. 5 %，巧樣氨二胺0. 2 %，乙酸鋼0. 5 %，硫酸儀 0.058%，硫酸儘0. 025%，蒸饋水1L。組成的MRS液體培養(yǎng)基的碳氮比如表4。結(jié)果如表 4。
[0045]表 4
[0046]
[0047] 由表4可見，在碳氮比的試驗(yàn)中，胞外多糖產(chǎn)量最高的為3:1，可達(dá)到180ug/ml，在 1:2時(shí)產(chǎn)量可W達(dá)到126ug/ml，當(dāng)比例為2:1時(shí)產(chǎn)量為110ug/ml，l:3時(shí)可達(dá)到106ug/ml， 產(chǎn)量最低的比例為1:1，產(chǎn)量為75ug/ml。
[0048](五）培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)
[0049]在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，W不同碳源，不同氮源，不同碳氮比，不同憐酸氨二鐘含 量四個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化胞外多糖的最佳培養(yǎng)基成分。實(shí)驗(yàn)分組如表5,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如 表6
[0050]表 5
[005引根據(jù)表6可知，最佳的培養(yǎng)條件為AiBiCA，即W葡萄糖為碳