專利名稱：一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物胞外多糖，尤其是涉及一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法。
背景技術(shù)：
近幾十年來，由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結(jié)構(gòu)、性能及生產(chǎn)方面所具有的特殊優(yōu)勢而得到大力研究和開發(fā)，微生物胞外多糖的開發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點之一。乳酸菌胞外多糖(Exopolysaccharide，EPS)是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的粘液多糖或莢膜多糖，它們具有增稠、乳化、保濕和穩(wěn)定等作用，有助于改善發(fā)酵乳制品的流變學(xué)特性，減少乳清析出現(xiàn)象，改善發(fā)酵乳質(zhì)地和感官質(zhì)量，一些乳酸菌胞外多糖還具有調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤等作用。由于乳酸菌是食品級工業(yè)生產(chǎn)菌，與其他菌相比安全性高，所以近年來對乳酸菌胞外多糖的研究逐漸增多，特別是它在發(fā)酵乳制品中的的作用一直是國內(nèi)外學(xué)者研究開發(fā)的熱點之一。但由于其產(chǎn)量和功能活性較低，是制約其大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素一。研究發(fā)現(xiàn)，多糖的活性直接或間接地受其分子結(jié)構(gòu)的影響，采取一定的方法對多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可以提高或賦予多糖更多活性、降低其毒副作用。目前對多糖進(jìn)行修飾的常見方法有硫酸化、羧甲基化、乙酰化、烷基化、磺?；?，許多天然多糖經(jīng)硫酸化修飾后的生物活性增強，尤其是抗病毒、抗腫瘤、抗艾滋病、對機體的免疫功能方面顯著增強，因而受到極大關(guān)注。近年來，多糖的硒化修飾也開始引起人們的關(guān)注，研究者對植物或微生物進(jìn)行富硒栽培或培養(yǎng)，通過它們的生長代謝，對硒進(jìn)行富集和生物轉(zhuǎn)化，或通過多糖硒化修飾，將硒或含硒的功能基團(tuán)接枝到多糖分子上，以獲得活性更強的硒多糖。研究證明，硒多糖的生物活性普遍高于多糖和硒，更易于被機體吸收和利用，如通過富硒培養(yǎng)獲得的靈芝硒多糖比靈芝多糖有更顯著的抑制腫瘤生長的活性。但是乳酸菌胞外多糖的富硒載培或培養(yǎng)所得硒多糖，存在硒含量不高等不足，而現(xiàn)有多糖的硒化修飾技術(shù)，常使用大量的有機溶劑，產(chǎn)品既不安全又容易污染環(huán)境，而且存在硒結(jié)構(gòu)相對單一等缺點。磷酸化修飾是一種共價修飾，是支鏈上的羥基被磷酸根取代的過程。磷酸化多糖可使一些原本不具有活性的多糖顯示了抗腫瘤等生理活性。但是目前關(guān)于磷酸化修飾主要集中在淀粉、殼聚糖和纖維素等，乳酸菌胞外多糖磷酸化修飾方面的研究至今未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可同時對乳酸乳球菌乳亞種菌株產(chǎn)的胞外多糖進(jìn)行硒化和磷酸化修飾，使硒含量充足并且安全環(huán)保的功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，該功能性乳酸菌胞外多糖具有顯著抗氧化和免疫增強效應(yīng)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，具體包括如下步驟(1)乳酸菌胞外粗多糖的制備
將乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵劑按體積百分比3. 0-5. 0%的接種量，接種在改進(jìn)的BLX 培養(yǎng)基上,先在37°C下培養(yǎng)20 h，再在下培養(yǎng)10-15h，6000-7000rpm離心15-20min 除去菌體細(xì)胞得含胞外多糖的發(fā)酵液，然后對發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，再按濃縮液質(zhì)量的10% 的加入三氯醋酸沉淀，0-4°C下放置8-12小時，然后6000-7000rpm離心15-20min，取上清液進(jìn)行超濾濃縮，得粗多糖濃縮液，再加入體積為粗多糖濃縮液3倍的90-95%的乙醇溶液，在 4°C靜置10-12小時，然后6000-7000rpm離心20-25min，取沉淀物冷凍干燥，得粉末狀的乳酸菌胞外粗多糖；
(2)乳酸菌胞外粗多糖的分離純化
將步驟(1)獲得的乳酸菌胞外粗多糖溶解于少量蒸餾水中，先經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱分離純化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第一洗脫峰的洗脫液，冷凍濃縮至5-6mL后， 再經(jīng)kpharose CL-6B凝膠柱層析分離純化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第二洗脫峰的洗脫液，將洗脫液經(jīng)截留分子量為觀0-320道爾頓的納濾膜納濾脫鹽，再經(jīng)超濾濃縮， 90-95%的乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷凍干燥，得到乳酸菌胞外純多糖；
(3)乳酸菌胞外純多糖的磷酸化
將步驟(2)得到的乳酸菌胞外純多糖與磷酸鹽溶液按質(zhì)量比6:1 3的比例混勻，并調(diào)節(jié)PH至4. 0-6. 0,冷凍干燥至粉末狀，然后移至干燥箱內(nèi)，在70-90°C下加熱反應(yīng)4_6h， 然后用70-75%的乙醇溶液沖洗除去多余的鹽類，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸餾2-3小時，除去
殘留的乙醇，真空冷凍干燥，獲得固體磷酸化多糖，其中磷酸根接枝量達(dá)到1.64-1. 70 mg/ g ；
(4)硒酸化
將步驟(3)獲得的固體磷酸化多糖溶于水中得到質(zhì)量百分比為15%的磷酸化多糖溶液，將磷酸化多糖溶液與硒化劑按質(zhì)量比9:1的比例混勻，并調(diào)節(jié)pH至1.5-2.5，冷凍干燥至粉末狀，然后移至干燥箱內(nèi)，在45-55°C下加熱反應(yīng)12-1 ，然后用70-75%的乙醇溶液沖洗除去多余的硒化劑，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸餾，除去殘留的乙醇，放入透析袋內(nèi)，置于蒸餾水中透析除去殘留的硒化劑，透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的多糖溶液到入燒杯，加入3倍多糖溶液體積的90-95%乙醇沉淀，4°C靜置10-12小時，6000-7000rpm離心20_25min，取沉淀物冷凍干燥，即得磷酸化及硒酸化多糖產(chǎn)物即功能性乳酸菌胞外多糖，其中硒的含量為 0.17-0. 18 mg/g。所述的乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵劑的活菌數(shù)含量達(dá)到105—7個/mL。所述的改進(jìn)BLX培養(yǎng)基，其組成如下1. 5-2. 0%葡萄糖，1. 0-1. 2%果糖，1. 3-1. 5% 大豆蛋白胨，1. 3-1. 5%胰蛋白胨，初始pH為6. 0-6. 5。步驟(1)、步驟(2)中所述的超濾濃縮過程為采用裝有孔徑為50千道爾頓內(nèi)壓式中空纖維膜，在操作壓力為0. 25-0. 40MPa，操作溫度為20_25°C的條件下，對乳酸乳球菌乳亞種發(fā)酵液中胞外多糖進(jìn)行超濾濃縮。步驟(3)中所述的磷酸鹽溶液為磷酸鹽與水按質(zhì)量比20:1的比例混合而成。所述的磷酸鹽指六偏磷酸鈉(Na6P6O18)、三聚磷酸鈉(Na5P3Oltl)和焦磷酸鈉 (Na4P2O7)中的任一種；所述的硒化劑指乙酸硒醚或亞硒酸鈉(Na2SeO3)或二者混合物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，通過制備乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)胞外粗多糖，DEAE-纖維素離子交換柱和凝膠柱層析柱的分離純化、超濾濃縮、納濾脫鹽、超濾濃縮、加熱磷酸化和硒酸化，再冷凍干燥得到具有抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能的乳酸菌胞外多糖，該方法首次公開了利用干燥加熱法制備具有顯著抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能之磷酸化及硒酸化多糖的方法，與其它硒酸化方法相比，此法具有不使用有毒的有機溶劑，具有簡潔、環(huán)保、安全、高效等特點，在相同濃度條件下，與未磷酸化及硒酸化的多糖相比，所得磷酸化及硒酸化多糖的總抗氧化能力、抗超氧陰離子(O2- ·)自由基、 抑制羥自由基能力分別提高了 30%、35%、39%，對對環(huán)磷酰胺致免疫低下小鼠單核巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)提高了 16. 32%，白細(xì)胞數(shù)增加了 15. 68%，脾指數(shù)和胸腺指數(shù)分別提高了 11. 52% 和 15. 46%ο綜上所述，本發(fā)明建立了一種即在硒化劑及磷酸鹽存在時，用干燥加熱的方法，對乳酸乳球菌乳亞種菌株產(chǎn)的胞外多糖進(jìn)行硒化和磷酸化修飾，獲得具有顯著抗氧化和免疫增強效應(yīng)的功能性乳酸乳球菌胞外多糖，為開發(fā)新的保健因子、功能性食品或藥品提供理論依據(jù)。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一、實驗測定方法
1、多糖含量的測定
(1)多糖的含量 苯酚-硫酸法測得的總糖含量-DNS法測得的還原糖含量；
(2)苯酚-硫酸法測發(fā)酵液中總糖含量樣品中總糖含量的測定用苯酚-硫酸法。取樣品液1. OmL,加入1. OmL蒸餾水，再加入6. 0%苯酚溶液1. OmL,最后加入5. OmL濃硫酸。 每個樣品做三次平行，再用蒸餾水做一個對照。試劑加齊后，靜止lOmin，再搖勻，室溫放置 20min后在490nm處測其OD值。測定后，取所測得樣品的OD平均值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程133x+0. 628，計算出相應(yīng)的總糖含量，其中χ為OD (490nm)值，y為葡萄糖濃度 (mg/L)；
(3)樣品中還原糖含量的測定取樣品液l.OmL，再加入LOmL蒸餾水，最后加入 1.5mL3’，5’-二硝基水楊酸(DNS)。每個樣品做三次平行樣，再用蒸餾水做一個對照。將各管溶液混勻，在沸水浴中加熱5min，取出后立即用冷水冷卻到室溫再向每管加入21. 5mL 蒸餾水，搖勻，于520nm波長處測OD值。測定后，取所測得樣品的OD平均值，根據(jù)DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程y=54. 617X+1. 4934，計算出相應(yīng)的還原糖含量，其中χ為OD (490nm)值，y 為葡萄糖濃度(mg/L)。2、磷酸根的測定(銷藍(lán)比色法)
以磷酸二氫鉀為標(biāo)準(zhǔn)物，分別置于25mL的比色管中，依次加入5% 2. OmL的鉬酸銨溶液，搖勻，靜置幾秒后，分別加入21 1. OmL亞硫酸鈉溶液和0. 5% 1. OmL的對苯二酚溶液，搖勻，加水至刻度，靜置30min后，以參比調(diào)零，在660nm處測定吸光度[16]，以磷酸根濃度為橫坐標(biāo)、相對應(yīng)吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=l. OlOOx-O. 1472，X為吸光度值)。取適量的樣品于燒杯中，分別加入ImL的濃硫酸和濃硝酸，在電爐上加熱至冒煙， 然后待冷卻后加入ImL的30%的過氧化氫，再緩慢加熱，重復(fù)以上的步驟直至瓶內(nèi)不再冒煙，溶液呈無色透明或淡黃色。冷卻后加入ImL 6mol/mL的鹽酸，在電爐上加熱使酸徹底分解，轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中定容，取5ml按標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法測定吸光度，根據(jù)回歸曲線計算出磷的含量。3、硒含量的測定
以亞硒酸鈉為標(biāo)準(zhǔn)物，加入8mL 0. 鄰苯二胺溶液，80%甲酸調(diào)pH值為1.5-2.5，轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，定容。在暗處放置50 min0用10 mL甲苯萃取，靜置。將萃取的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，甲苯為參比，在λ=334ηπι處有最大吸收，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取20. 0 mg硒多糖置于錐形瓶中，加入2 mL混酸HCI04+H2S04+HN03 (體積比1 :1 :4)，消化至溶液澄清時冷卻，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出硒含量。4、抗氧化能力指標(biāo)測定
(1)總抗氧化能力的測定在氧化反應(yīng)體系中添加初步純化的胞外多糖，利用i^enton 反應(yīng)體系產(chǎn)生羥自由基，以抗壞血酸作為陽性對照，反應(yīng)結(jié)束后于510nm處測定吸光值；總抗氧化能力按下面的公式計算
權(quán)利要求
1.一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于具體包括如下步驟(1)乳酸菌胞外粗多糖的制備將乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵劑按體積百分比3. 0-5. 0%的接種量，接種在改進(jìn)的BLX 培養(yǎng)基上,先在37°C下培養(yǎng)20 h，再在下培養(yǎng)10-15h，6000-7000rpm離心15-20min 除去菌體細(xì)胞得含胞外多糖的發(fā)酵液，然后對發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮，再按濃縮液質(zhì)量的10% 的加入三氯醋酸沉淀，0-4°C下放置8-12小時，然后6000-7000rpm離心15-20min，取上清液進(jìn)行超濾濃縮，得粗多糖濃縮液，再加入體積為粗多糖濃縮液3倍的90-95%的乙醇溶液，在 4°C靜置10-12小時，然后6000-7000rpm離心20-25min，取沉淀物冷凍干燥，得粉末狀的乳酸菌胞外粗多糖；(2)乳酸菌胞外粗多糖的分離純化將步驟(1)獲得的乳酸菌胞外粗多糖溶解于少量蒸餾水中，先經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱分離純化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第一洗脫峰的洗脫液，冷凍濃縮至5-6mL后， 再經(jīng)kpharose CL-6B凝膠柱層析分離純化，收集含有乳酸菌胞外粗多糖的第二洗脫峰的洗脫液，將洗脫液經(jīng)截留分子量為觀0-320道爾頓的納濾膜納濾脫鹽，再經(jīng)超濾濃縮， 90-95%的乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷凍干燥，得到乳酸菌胞外純多糖；(3)乳酸菌胞外純多糖的磷酸化將步驟(2)得到的乳酸菌胞外純多糖與磷酸鹽溶液按質(zhì)量比6:1 3的比例混勻，并調(diào)節(jié)PH至4. 0-6. 0,冷凍干燥，至粉末狀，然后移至干燥箱內(nèi)，在70-90°C下加熱反應(yīng)4_6h， 然后用70-75%的乙醇溶液沖洗除去多余的鹽類，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸餾2-3小時，除去殘留的乙醇，真空冷凍干燥，獲得固體磷酸化多糖，其中磷酸根接枝量達(dá)到1.64-1. 70 mg/ g ；(4)硒酸化將步驟(3)獲得的固體磷酸化多糖溶于水中得到質(zhì)量百分比為15%的磷酸化多糖溶液，將磷酸化多糖溶液與硒化劑按質(zhì)量比9:1的比例混勻，并調(diào)節(jié)pH至1.5-2.5，冷凍干燥至粉末狀，然后移至干燥箱內(nèi)，在45-55°C下加熱反應(yīng)12-1 ，然后用70-75%的乙醇溶液沖洗除去多余的硒化劑，再置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸餾，除去殘留的乙醇，放入透析袋內(nèi)，置于蒸餾水中透析除去殘留的硒化劑，透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的多糖溶液到入燒杯，加入3倍多糖溶液體積的90-95%乙醇沉淀，4°C靜置10-12小時，6000-7000rpm離心20_25min，取沉淀物冷凍干燥，即得磷酸化及硒酸化多糖產(chǎn)物即功能性乳酸菌胞外多糖，其中硒的含量為0.17-0.18 mg/g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于 所述的乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵劑的活菌數(shù)含量達(dá)到105—7個/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于所述的改進(jìn)BLX培養(yǎng)基，其組成如下1. 5-2. 0%葡萄糖，1. 0-1. 2%果糖，1. 3-1. 5%大豆蛋白胨，1.3-1. 5%胰蛋白胨，初始pH為6. 0-6. 5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于步驟 (1)和步驟(2)中所述的超濾濃縮過程為采用裝有孔徑為50千道爾頓內(nèi)壓式中空纖維膜， 在操作壓力為0. 25-0. 40MPa，操作溫度為20_25°C的條件下，對乳酸乳球菌乳亞種發(fā)酵液中胞外多糖進(jìn)行超濾濃縮。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的磷酸鹽溶液為磷酸鹽與水按質(zhì)量比20:1的比例混合而成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于所述的磷酸鹽為六偏磷酸鈉(Na6P6018)、三聚磷酸鈉(Nii5P3Oici)和焦磷酸鈉(Na4P2O7)中的任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，其特征在于步驟(4)中所述的硒化劑指乙酸硒醚或亞硒酸鈉或二者混合物。
全文摘要
本發(fā)明一種功能性乳酸菌胞外多糖的制備方法，特點是具體包括將乳酸乳球菌乳亞種菌株發(fā)酵劑接種培養(yǎng)，然后對發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮、沉淀、乙醇提取，再離心取沉淀物冷凍干燥，得粉末狀的乳酸菌胞外粗多糖的步驟；依次經(jīng)過DEAE-纖維素離子交換柱分離純化和SepharoseCL-6B凝膠柱層析分離純化，再經(jīng)脫鹽、超濾濃縮、乙醇溶液沉淀，取沉淀物冷凍干燥，得到乳酸菌胞外純多糖的步驟；最后乳酸菌胞外純多糖的磷酸化加熱磷酸化和硒酸化的步驟，優(yōu)點是用干燥加熱的方法，對乳酸乳球菌乳亞種菌株產(chǎn)的胞外多糖進(jìn)行硒化和磷酸化修飾，獲得具有顯著抗氧化和免疫增強效應(yīng)的功能性乳酸乳球菌胞外多糖。
文檔編號C12R1/01GK102250984SQ201110191610
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者曹錦軒, 曾小群, 潘道東 申請人:寧波大學(xué)