專利名稱：從紅薯塊根中提取過氧化物酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及紅薯中過氧化物酶的制備，適合于從紅薯中制備RZ值大于2的過氧化物酶。
背景技術(shù)：
過氧化物酶通過還原H2O2和過氧化物來氧化細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)和無機(jī)的毒性物質(zhì)。在實(shí)際中，過氧化物酶是一個很有用的工具酶，能作為分析酶定量檢測，應(yīng)用于臨床化學(xué)、環(huán)境化學(xué)和食品工業(yè)領(lǐng)域，如草酸含量檢測、乙醇酸含量檢測；過氧化物酶還能作為定位檢測的工具酶，如用于ELISA檢測。由于過氧化物酶是一個很有用的工具酶，在實(shí)際應(yīng)用中，需要高純度的過氧化物酶，不少研究者試圖分離純化過氧化物酶。過氧化物酶為含血紅素的糖蛋白，其制備的純度采用RZ值衡量，RZ值大于1的過氧化物酶制劑能用于分析測定，RZ值大于2的過氧化物酶制劑能用于實(shí)驗(yàn)室分析中的定位檢測。有人從大豆、大蒜、辣根、苦瓜、茶葉中純化了過氧化物酶。其中，只有從辣根中純化的過氧化物酶得到了商業(yè)化應(yīng)用，而已報(bào)道的從其他植物中提純過氧化物酶的方法均需要采用多步層析，回收率均小于10%，其分離純化的步驟復(fù)雜， 產(chǎn)量低，制備過氧化物酶的成本高。從辣根中制備過氧化物酶的純度高，5公斤辣根能制備RZ值大于2的過氧化物酶 20mg，但辣根的栽培條件苛刻，只在我國的東部沿海少數(shù)地區(qū)有少量栽培。因此，用辣根制備過氧化物酶，原料成本偏高。我們對多種常見作物的過氧化物的純化方法進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)紅薯有較高的過氧化物酶活性，研究表明此酶的穩(wěn)定性和耐受金屬離子和有機(jī)溶劑的能力較強(qiáng)，有利于工業(yè)化制備。而且紅薯是一種常見的農(nóng)作物，在我國大部分地區(qū)能夠正常生長，產(chǎn)量高，價格低，以紅薯為原料有利于低成本制備過氧化物酶制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服已有的制備過氧化物酶方案的不足，提供一種低成本、高回收率的快速制備過氧化物酶方法。本發(fā)明是利用紅薯為原料，根據(jù)紅薯中過氧化物酶對金屬離子和有機(jī)溶劑的耐受能力強(qiáng)的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)通過硫酸銨分級分離、丙酮分級分離和硫酸鋅沉淀的純化方案，實(shí)現(xiàn)制備RZ大于2. 0的過氧化物酶。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的(1)粗提液的硫酸銨分級分離將紅薯塊根按固液比1 1加入蒸餾水，在0 4°C 下勻漿，然后置于0 4°C下浸提24小時。浸提液于4°C IOOOOg離心10分鐘，收集上清液，然后向上清液中加入固體硫酸銨達(dá)到40 %飽和度，0 4°C靜置24小時后于4°C IOOOOg 離心10分鐘，收集上清液，再加入固體硫酸銨于收集的上清液中，達(dá)到70%飽和度，于0 4°C靜置24小時；然后于4°C IOOOOg離心10分鐘，收集沉淀，在沉淀中按固液比1 1加入蒸餾水，置于透析袋中透析5小時，透析后的溶液于4°C IOOOOg離心10分鐘收集上清液。
(2)丙酮分級分離純化過氧化物酶測量步驟(1)收集的上清液的體積Vtl，向其中加入1. 5倍Vtl體積的-40°c預(yù)冷的丙酮，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集上清液，上清液中加入0. 3倍Vtl體積的-40°C預(yù)冷的丙酮，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集沉淀。向沉淀中按固液比1 1加入蒸餾水，溶解沉淀，置于培養(yǎng)皿中在4°C下風(fēng)干，得到丙酮分級分離后純化的固體過氧化物酶制劑。(3)硫酸鋅分離純化過氧化物酶取步驟(2)制備的過氧化物酶，按固液比 1 1000加入蒸餾水溶解過氧化物酶，然后加入1. Omol/L硫酸鋅，使硫酸鋅終濃度達(dá)到 0.0015mol/L，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集沉淀，按固液比1 1000在沉淀中加入蒸餾水溶解沉淀，置于透析袋中透析除鹽。透析后的溶液置于培養(yǎng)皿中在4°C下風(fēng)干，得到硫酸鋅分離純化的固體過氧化物酶制劑。本發(fā)明從紅薯塊根中提取過氧化物酶的方法的效果是(1)回收率高，2公斤紅薯塊根能最終制備RZ大于2過氧化物酶量超過40mg ；(2)制備方法簡單，只需使用冷凍離心機(jī)、冰箱、可控溫培養(yǎng)箱、硫酸銨、丙酮、硫酸鋅等設(shè)備和藥品，制備過程快捷、操作簡單、成本低，便于推廣；(3)制備的過氧化物酶純度高，經(jīng)過丙酮分級分離得到的過氧化物酶的RZ值大于 1，經(jīng)過硫酸鋅分級分離后得到的過氧化物酶的RZ值大于2。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例丙酮分級分離純化的過氧化物酶的制備稱取2公斤紅薯塊根，用蒸餾水洗凈，加入2000ml蒸餾水于0 4°C下勻漿，然后置于0 4°C下浸提24小時。浸提液于 40C IOOOOg離心10分鐘，得到2400ml上清液。向上清液中緩緩加入583g固體硫酸銨，攪拌溶解后置于0 4°C靜置24小時，然后4°C IOOOOg離心10分鐘，棄沉淀，再向上清液中緩緩加入655g固體硫酸銨，攪拌溶解后置于0 4°C靜置24小時，然后4°C IOOOOg離心10 分鐘，棄上清液，收集沉淀。然后將沉淀溶于400ml蒸餾水，裝入透析袋，在蒸餾水中透析 5小時，期間換水兩次，然后將透析袋中的溶液于4°C IOOOOg離心10分鐘，收集上清液，共 460ml。向上清液中加入690ml-40°C預(yù)冷的丙酮，4°C IOOOOg離心10分鐘，收集上清液，然后再往上清液中加入138ml-40°C預(yù)冷的丙酮，4°C IOOOOg離心10分鐘，收集沉淀，向沉淀中按固液比1 1加入蒸餾水，溶解沉淀，置于培養(yǎng)皿中在4°C下風(fēng)干，得到丙酮分級分離后純化的固體過氧化物酶制劑130mg。硫酸鋅分離純化的過氧化物酶制備取以上制備的過氧化物酶120mg，溶于120ml 蒸餾水中，然后加入1. Omol/L硫酸鋅，使硫酸鋅終濃度達(dá)到0. 0015mol/L，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集沉淀，用60ml蒸餾水溶解沉淀，置于透析袋中透析除鹽。透析1小時后，將溶液置于培養(yǎng)皿中在4°C下風(fēng)干，得到硫酸鋅分離純化的固體過氧化物酶制劑50mg。純度檢測將提純的過氧化物酶溶于蒸餾水中，濃度為0. 5 lmg/ml，測量RZ，RZ 的定義為A4tl3A275。
權(quán)利要求
1. 一種從紅薯塊根中提取過氧化物酶的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)粗提液的硫酸銨分級分離將紅薯塊根按固液比1 1加入蒸餾水，在0 4°C下勻漿，然后置于0 4°C下浸提24小時，浸提液于4°C IOOOOg離心10分鐘，收集上清液，然后向上清液中加入固體硫酸銨達(dá)到40%飽和度，0 4°C靜置24小時后于4°C IOOOOg離心 10分鐘，收集上清液，再加入固體硫酸銨于收集的上清液中，達(dá)到70%飽和度，于0 4°C靜置24小時，然后于4°C IOOOOg離心10分鐘，收集沉淀，在沉淀中按固液比1 1加入蒸餾水，置于透析袋中透析5小時，透析后的溶液于4°C IOOOOg離心10分鐘收集上清液；(2)丙酮分級分離純化過氧化物酶測量步驟(1)收集的上清液的體積Vtl，向其中加入 1.5倍Vtl體積的-40°C預(yù)冷的丙酮，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集上清液，上清液中加入 0. 3倍Vtl體積的-40°c預(yù)冷的丙酮，于4°C IOOOOg離心10分鐘收集沉淀，向沉淀中按固液比1 1加入蒸餾水，溶解沉淀，置于培養(yǎng)皿中在4°c下風(fēng)干，得到丙酮分級分離后純化的固體過氧化物酶制劑；(3)硫酸鋅分離純化過氧化物酶取步驟(2)制備的過氧化物酶，按固液比1 1000加入蒸餾水溶解過氧化物酶，然后加入1. Omol/L硫酸鋅，使硫酸鋅終濃度達(dá)到0. 0015mol/L, 于4°C IOOOOg離心10分鐘收集沉淀，按固液比1 1000在沉淀中加入蒸餾水溶解沉淀，置于透析袋中透析除鹽，透析后的溶液置于培養(yǎng)皿中在4°C下風(fēng)干，得到硫酸鋅分離純化的固體過氧化物酶制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及酶制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及紅薯塊根中過氧化物酶的制備，適合于從紅薯塊根中制備RZ值大于2的過氧化物酶，它包括以下步驟粗提液的硫酸銨分級分離勻漿紅薯塊根，蒸餾水浸提24小時，40％～70％飽和度的硫酸銨分級分離，離心收集沉淀，沉淀溶于蒸餾水后透析除鹽，然后向透析液加入1.5倍體積預(yù)冷的丙酮，離心棄沉淀，上清液加入0.3倍透析液體積的預(yù)冷丙酮，離心收集沉淀，風(fēng)干得到丙酮分級分離純化的過氧化物酶制劑，其RZ值大于1；然后將丙酮分級分離純化的過氧化物酶制劑溶于蒸餾水中，加入硫酸鋅，離心收集沉淀，沉淀溶于蒸餾水后透析除鹽，風(fēng)干得到硫酸鋅分離純化的過氧化物酶，其RZ值大于2。采用本發(fā)明制備紅薯過氧化物酶，具有制備方法簡單、回收率高、制備的過氧化物酶純度高的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N9/08GK102250850SQ20111019148
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者吳娟, 張夢成, 胡一鴻 申請人:湖南人文科技學(xué)院