專利名稱：一種從豬血紅細胞中提取超氧化物歧化酶sod的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種超氧化物歧化酶的提取方法，特別涉及一種從豬血紅細胞中提取超氧化物歧化酶SOD的方法。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,以下簡稱SOD)是一種能夠清除機體內(nèi)過量自由基的金屬酶，已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人和動物體內(nèi)的多種組織中。SOD具有抗衰老、 防止色素沉積、消炎和保護機體免疫功能的作用。目前已經(jīng)被廣泛應用于食品、保健品、化妝品和農(nóng)業(yè)等方面?，F(xiàn)有的從血細胞中提取SOD的方法在前期的取血、抗凝、生理鹽水洗滌和低溫溶血等步驟上大同小異。后期的雜蛋白變性大多采用氯仿和乙醇法去除血紅蛋白，然后清液用丙酮沉淀，沉淀物上色譜柱(S^hadex G-100或DE-32或金屬螯合層析法)，其缺點在于 (1)用氯仿和乙醇去除血紅蛋白成本較高，同時氯仿還是有毒試劑，試劑殘留的安全性沒有保證；(2)在用氯仿乙醇法去除血紅蛋白的過程中，由于SOD與血紅蛋白的共沉作用，造成 SOD得率降低；C3)由于色譜柱體積的限制，純化處理量小，設(shè)備成本投入高，不利于大規(guī)?；a(chǎn)。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種規(guī)?；a(chǎn)SOD的方法，該法工藝簡單，提取的SOD純度和安全性高、同時可以減少成本投入。

發(fā)明內(nèi)容
如上構(gòu)思，本發(fā)明的技術(shù)方案是一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶 SOD的方法，其特征在于依照下列步驟完成①收集新鮮健康的豬血；②將豬血進行抗凝處理；③將抗凝后的豬血進行高速離心處理得到血球液；④將血球液進行溶血破碎；血球液先經(jīng)過膠體磨破碎兩次，然后加入2倍體積的蒸餾水或者高純水在0°c -4°C溶脹過夜，得到溶血液；⑤將上述溶血液通過兩次熱變除雜過程得到SOD粗酶液；具體方法是溶血液中先加入食品級鈉鹽使飽和度為4% _12%，然后分別加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到 0. 5mm0l/L-3mm0l/L，在50°C _70°C恒溫設(shè)備中保溫10min-30min，冷卻，然后用三足式分離機分離20min-30min，取上清液，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到lmm0l/L-6mm0l/L，在60°C _70°C下恒溫設(shè)備中保溫 10min-30min，冷卻，然后用三足式分離機分離20-30min，取上清液，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液；⑥將上述步驟⑤得到的上清液進行超濾濃縮得到濃縮液；
⑦將濃縮液進行梯度洗脫；具體方法是對濃縮液進行多級的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液的初級濃度為lmmol/L-3mm0l/L，最終濃度為50mmOl/L-70mmOl/L，每兩級的濃度梯度倍數(shù)為2-5倍，上清液每級濃度梯度處理前先降溫至1°C _5°C，然后加入 1-2倍的冷丙酮，迅速在2000r/min-4000r/min下冷凍離心3_10min，取沉淀，上清液用作丙酮回收；沉淀用3-15倍的磷酸鹽緩沖液溶解，迅速在4000r/min-6000r/min下冷凍離心 5-15min，取上清，棄沉淀；⑧將上述步驟⑦得到的上清液裝入透析袋中在0°C -4°C下流動透析24h_3^!進行透析除鹽；⑨冷凍干燥將透析好的上清液冷凍干燥，即制得SOD產(chǎn)品。上述抗凝劑為食品級檸檬酸鈉，添加量4. 0-6. Og/kg豬血。上述熱變除雜過程中加入的鈉鹽可以是氯化鈉、溴化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉中的一種或者幾種的混合物；加入的銅鹽可以是氯化銅、硫酸銅或者硝酸銅中的一種或者幾種混合物；加入的鋅鹽可以是氯化鋅、硫酸鋅或者硝酸鋅中的一種或者幾種混合物。上述上清液超濾濃縮的具體方法是將上清液經(jīng)截留分子量為6000的中空纖維膜超濾機，不斷加入4°C左右高純水，除去小分子雜蛋白和金屬離子后再經(jīng)濃縮得到濃縮液。上述濃縮液進行2-7級的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫。上述磷酸鹽緩沖液所用的鹽為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的兩種或者多種混合物，其PH在6. 5-8. 0之間。上述透析除鹽所用的透析液前期用蒸餾水，后期可以用高純水或者 PEG-600(V20000。發(fā)明具有如下的優(yōu)點和積極效果1、本發(fā)明為了防止血液凝固和血細胞破裂進行了抗凝處理。2、本發(fā)明在細胞溶血的過程中采用了均質(zhì)破碎技術(shù)，同時結(jié)合細胞低溫溶脹技術(shù)，不僅最大程度上的破碎了細胞，釋放了細胞內(nèi)溶物，而且整個過程在低溫下進行，最大程度上保留了 SOD活性。3、本發(fā)明沒有采用常規(guī)的氯仿乙醇法去除血紅蛋白，而是采用兩次熱變除雜法使血紅蛋白變性的的方法，此方法中添加了銅鹽和鋅鹽，不僅對SOD有很好的保護作用，而且提高了雜蛋白變性的幾率，同時在熱變的過程中添加了鈉鹽，鈉鹽在熱變過程中起到鹽解的作用，適當?shù)碾x子強度可以最大程度的降低熱變過程中的共沉作用，同時又不會因為過高的離子濃度而降低SOD活性，從而提高了 SOD產(chǎn)率和活性。并且，在熱變除雜分離的過程中采用了兩種分離機聯(lián)用的方法，不僅去除了微小的變性蛋白，而且提高了生產(chǎn)效率，縮短了生產(chǎn)周期。4、本發(fā)明在后期的純化步驟中采用了梯度洗脫的方法，而傳統(tǒng)工藝往往需要采用層析柱法，因此本發(fā)明可以避免層析柱法過高的設(shè)備投入和層析柱產(chǎn)率較低的問題，這樣不僅有利于工業(yè)化生產(chǎn)，而且提高了 SOD產(chǎn)率，可以創(chuàng)造更高的利潤。同時，梯度洗脫法在后期純化的過程中所產(chǎn)生的丙酮廢液可以通過簡單的蒸餾法回收，因此節(jié)約了成本，更加利于大規(guī)模的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明所采用的梯度洗脫法操作簡單，在規(guī)?；a(chǎn)中更容易掌握。
具體實施例方式一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法，依照下列步驟完成1、收集新鮮健康的豬血；新鮮健康的豬血是指加工的動物血液全部來自定點大型屠宰場，所有的豬只必須經(jīng)過國家動物檢疫部門檢驗無疫病。2、將豬血進行抗凝處理采用的抗凝劑為食品級檸檬酸鈉，添加量4. 0-6. Og/kg 豬血。3、將抗凝后的豬血通過管式離心機的高速離心得到體積為50L的血球液。管式離心機的轉(zhuǎn)速為 14000r/min-16000r/min。4、將血球進行溶血破碎；血球先經(jīng)過膠體磨破碎兩次，然后加入2倍體積的蒸餾水或者高純水在0°c -4°c溶脹過夜；5、在溶血液中先加入氯化鈉，使其飽和度為6%，然后分別加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到lmmol/L，在65°C恒溫設(shè)備中保溫15min，冷卻，然后用三足式分離機分離30min， 取上清，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到2mmol/L，在70°C恒溫設(shè)備中保溫15min，冷卻，然后用三足式分離機分離30min， 取上清，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液。6、將上清液經(jīng)截留分子量為6000的中空纖維膜超濾機，不斷加入4°C左右高純水，除去小分子雜蛋白和金屬離子后，濃縮得到濃縮液。7、對濃縮液進行4級磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液的初級濃度為 1. 5mmol/L,最終濃度為40. 5mmol/L,緩沖液pH = 7. 0。每兩級的濃度梯度倍數(shù)為3倍，上清液每級濃度梯度處理前先降溫至1°C，然后加入2倍體積的冷丙酮，迅速在4000r/min下離心5min，取沉淀，上清液用作丙酮回收。沉淀用6倍的磷酸鹽緩沖液溶解，迅速在5000r/ min下離心lOmin，取上清，棄沉淀。8、將上清液裝入透析袋中，在0°C _4°C下流動透析Mh，透析液前期用蒸餾水，后期用PEG-6000進行濃縮。9、將透析好的上清液冷凍干燥，即制得的SOD產(chǎn)品。
權(quán)利要求
1.一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于依照下列步驟完成①收集新鮮健康的豬血；②將豬血進行抗凝處理；③將抗凝后的豬血進行高速離心處理得到血球液；④將血球液進行溶血破碎；血球液先經(jīng)過膠體磨破碎兩次，然后加入2倍體積的蒸餾水或者高純水在0°C -4°C溶脹過夜，得到溶血液；⑤將上述溶血液通過兩次熱變除雜過程得到SOD粗酶液；具體方法是溶血液中先加入食品級鈉鹽使飽和度為4% -12%，然后分別加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到0. 5mmol/ L-3mmol/L，在50°C _70°C恒溫設(shè)備中保溫10min-30min，冷卻，然后用三足式分離機分離20min-30min，取上清液，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液；上清液中加入銅鹽和鋅鹽，使其濃度達到lmm0l/L-6mm0l/L，在60°C _70°C下恒溫設(shè)備中保溫 10min-30min，冷卻，然后用三足式分離機分離20-30min，取上清液，再用管式固液分離機分離，去除沉淀，收集上清液；⑥將上述步驟⑤得到的上清液進行超濾濃縮得到濃縮液；⑦將濃縮液進行梯度洗脫；具體方法是對濃縮液進行多級的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫，磷酸鹽緩沖液的初級濃度為lmmol/L-3mm0l/L，最終濃度為50mmOl/L-70mmOl/L，每兩級的濃度梯度倍數(shù)為2-5倍，上清液每級濃度梯度處理前先降溫至1°C _5°C，然后加入1-2 倍的冷丙酮，迅速在2000r/min-4000r/min下冷凍離心3_10min，取沉淀，上清液用作丙酮回收；沉淀用3-15倍的磷酸鹽緩沖液溶解，迅速在4000r/min-6000r/min下冷凍離心 5-15min，取上清，棄沉淀；⑧將上述步驟⑦得到的上清液裝入透析袋中在0°C-4°C下流動透析24h-3^!進行透析除鹽；⑨冷凍干燥將透析好的上清液冷凍干燥，即制得SOD產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述抗凝劑為食品級檸檬酸鈉，添加量4. 0-6. Og/kg豬血。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述熱變除雜過程中加入的鈉鹽可以是氯化鈉、溴化鈉、硝酸鈉、硫酸鈉中的一種或者幾種的混合物；加入的銅鹽可以是氯化銅、硫酸銅或者硝酸銅中的一種或者幾種混合物；加入的鋅鹽可以是氯化鋅、硫酸鋅或者硝酸鋅中的一種或者幾種混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述上清液超濾濃縮的具體方法是將上清液經(jīng)截留分子量為6000的中空纖維膜超濾機，不斷加入4°C左右高純水，除去小分子雜蛋白和金屬離子后再經(jīng)濃縮得到濃縮液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述濃縮液進行2-7級的磷酸鹽緩沖液梯度洗脫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于上述磷酸鹽緩沖液所用的鹽為磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀中的兩種或者多種混合物，其PH在6. 5-8. 0之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從豬血紅細胞中提取銅鋅超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于上述透析除鹽所用的透析液前期用蒸餾水，后期可以用高純水或者 PEG-600(V20000。
全文摘要
一種從豬血紅細胞中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，該方法采用抗凝處理，防止血液凝固和血細胞破裂。采用膠體磨破碎和低溫溶脹使血細胞內(nèi)溶物最大程度的釋放得到溶血液。溶血液經(jīng)過兩次熱變除雜去血紅蛋白和大量雜蛋白得到SOD粗酶液，SOD粗酶液再經(jīng)過超濾濃縮、梯度洗脫、透析除鹽和冷凍干燥得到SOD產(chǎn)品。本發(fā)明不僅操作簡單，容易掌握，而且可有效提高產(chǎn)品質(zhì)量，降低生產(chǎn)成本，縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12N9/08GK102181411SQ20111008166
公開日2011年9月14日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月1日
發(fā)明者夏繼華, 宋古全, 張立娟, 沈峰, 王長維 申請人:黑龍江寶迪肉類食品有限公司