專利名稱：食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物體中提取超氧化物歧化酶技術(shù)，具體為一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝。
背景技術(shù)：
超氧化物歧化酶(以下簡稱SOD)，是一種生物活性蛋白質(zhì)，是目前為止發(fā)現(xiàn)的唯一以自由基為底物的酶。具有抗衰老、提高機體對多種疾病的抵抗力、增強機體對外界環(huán)境的適應(yīng)能力等生理功能?，F(xiàn)有的SOD提取來源主要有動物血、動物肝臟、植物可食部分、酵母等。但是隨著瘋牛病、口蹄疫等蛋白傳染疾病的出現(xiàn)，人們也發(fā)現(xiàn)動物血SOD因子中也含有治病因子，所以現(xiàn)在世界血防組織已經(jīng)明令禁止使用動物血提取SOD。而使用植物原料提取SOD要消耗掉大量的農(nóng)產(chǎn)品，在社會現(xiàn)有的階段仍然無法規(guī)?；a(chǎn)。微生物中提取SOD是最好的途徑之一，但這方面除酵母之外，在微生物中還沒有其它開發(fā)的材料。而我國食用菌年產(chǎn)量達到近900萬噸，食用菌種類很多，關(guān)于食用菌SOD的研究有不少報道，既有其含量的報道，也有分離提純后對其性質(zhì)研究的報道；既有子實體的報道，也有菌絲體的報道。從這些報道可知，SOD廣泛的存在于各種食用菌中，不同的食用菌其含量不同。對于現(xiàn)有技術(shù)中食用菌進行SOD提取技術(shù)的文獻主要有“蛹蟲草超氧化物歧化酶分離純化及其穩(wěn)定性的研究”《生物技術(shù)》第15卷第5期，(利用超聲波破碎，然后離心，然后沉淀，最后用柱層析的方法分離)；雙孢蘑菇子實體超氧化物歧化酶的分離純化及部分性質(zhì)《河北大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》第22卷第3期；……等，然而上所述資料均為在實驗室的條件下，對食用菌的子實體中含有的SOD進行的提純分離研究。上述提出的工藝流程的特點是工藝簡單，設(shè)備一般，經(jīng)濟實用，而在我國現(xiàn)實生產(chǎn)生活中，食用菌種類、產(chǎn)量和消耗量都很大，而且對于直接用食用菌本身提取SOD來說，會消耗掉大量的資源，而且也沒有成熟的提取工藝，現(xiàn)有的文獻中公開的一些提取方法雖然也能提取出高純度的SOD(目的都是集中在對SOD的定性研究階段)，但是成本很高，根本無法適用于工業(yè)化生產(chǎn)。在食用菌SOD研究方面，主要集中在理論研究上，雖然研究子實體SOD的報道不少，但是還沒有人探討從食用菌子實體中提取SOD工藝的研究，更沒有人研究從菌糠的菌絲體提取SOD的工藝。(食用菌菌糠食用菌在固體培養(yǎng)基上(包括椴木)生長后形成的原料與菌絲體的混合物，無論是出菇還是未出菇，是固體還是粉末，均稱為菌糠。但一般所指的菌糠為食用菌栽培后的剩余料，也叫下角料、菇渣、菇糠等。)我國每年培養(yǎng)食用菌而產(chǎn)生的廢料——菌糠，內(nèi)含有大量的菌絲體，研究發(fā)現(xiàn)菌糠中也含有大量的SOD，目前無任何文獻資料公開過關(guān)于在食用菌菌糠中提取出SOD的工藝，現(xiàn)有的在植物中和微生物中提取SOD的工藝主要問題集中在以下四個方面一、粗酶液的制備。以子實體為原料是記載于現(xiàn)有文獻中，而菌絲體，所有的報道均集中在用發(fā)酵液來提取SOD，二、細胞壁的破壁方法。由于食用菌的菌絲體有細胞壁，不利于SOD的提取，現(xiàn)有關(guān)于微生物破壁的方法主要有物理法，化學(xué)法、生物法，具體那種辦法適用于菌絲體，還未見報道；三、SOD的提純。SOD的提純過程實際是雜蛋白的去除過程。第四是色素的去除。在以固體培養(yǎng)基菌絲體為原料時，由于培養(yǎng)基主要組成是棉籽殼，含有大量色素，必須予以去除。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒有從食用菌菌糠中提取SOD的工藝的問題而提供了一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝。
本發(fā)明是由以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，包括以下步驟(粗酶液的制備，超聲波破壁、分離提純、色素去除)1、菌糠加水振蕩20～60分鐘，過濾，得到混合液，即SOD粗酶液；2、混合液離心得到菌絲體沉淀物和上清液(胞外酶)，由于菌絲體附著于棉籽殼組成的培養(yǎng)基上，需要將菌絲體與培養(yǎng)基分離，由于SOD存在胞內(nèi)酶和胞外酶兩種形式，在制備粗酶液時需要將二者全部收集。
3、菌絲體沉淀物破壁后離心得到胞內(nèi)酶液。破壁可采用超聲波或甲苯破壁法；超聲波功率范圍60～150W，時間3～10min，4、上清液和胞內(nèi)酶液混合得到濃縮的粗酶液，5、濃縮的粗酶液在45～60℃保溫30～60分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為(4.0～6.0)，得到混濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到混濁液，對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5～1倍丙酮得到混濁液，對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得到SOD粗品，
6、粗品加水溶解得水溶液，水溶液加硫酸銨得混濁液，離心收集沉淀，脫鹽即可得到最終產(chǎn)品。
整個工藝流程圖詳見附圖18一、最佳提取SOD材料的選擇研究1目的和意義為了能在眾多的食用菌中選取最佳的品種，選種最佳的生長狀態(tài)(子實體、菌絲體、菌糠)的SOD提取原料，以生產(chǎn)車間培育的食用菌子實體和菌糠為材料對它們不同生長期的SOD含量進行測定。根據(jù)研究結(jié)果，結(jié)合經(jīng)濟效益，首先選定食用菌的品種，然后確定是用子實體還是菌絲體，在哪個時期進行SOD的提取，從而確定最佳提取材料。
2材料與方法2.1材料2.1.1食用菌白靈菇、杏鮑菇不同生長期的子實體即小蕾、大蕾、小子實體、成品子實體；不同生長期即養(yǎng)菌期、出菇期、出菇后期的菌糠。猴頭菇、靈芝、蛹蟲草成品子實體。
2.2方法粗酶液制備和SOD活性測定見本申請相關(guān)部分3結(jié)果與分析3.1白靈菇不同生長期子實體SOD活性據(jù)有關(guān)資料報道，生物體內(nèi)SOD含量隨著生長期的不同而不同，為了能了解食用菌不同生長期SOD含量的變化，我們依次選定了白靈菇不同生長期子實體(見圖1)用于測定SOD活性。
經(jīng)過測定，其SOD活性分別為大子實體SOD活性＝360.82U/g小子實體；SOD活性＝428.57U/g大蕾SOD活性＝484.47U/g小蕾SOD活性＝550.09U/g白靈菇子實體不同生長期SOD活性有比較見圖2。
由結(jié)果可見，在白靈菇的四種子實體中，SOD活性由高到低依次是小蕾、大蕾、小子實體、大子實體。這是因為小蕾處于生長旺盛時期，氧代謝過程中產(chǎn)生了大量的O2-·，而小蕾體內(nèi)細胞增殖迅速，活性物質(zhì)SOD也會大量產(chǎn)生，從而維持了動態(tài)平衡。小蕾發(fā)育成大子實體后，細胞分裂緩慢，SOD合成減弱，所以，隨著子實體的生長成熟，SOD活性逐漸降低。雖然小蕾SOD活性高，但是其絕對量不大，考慮到提取SOD的量，還是應(yīng)選擇大子實體。
3.2杏鮑菇不同生長期子實體SOD活性我們依次選定了杏鮑菇不同生長期子實體(見圖3)用于測定SOD活性。
經(jīng)過測定，其SOD活性分別為大子實體SOD＝569.44U/g小子實體SOD＝630.30U/g大蕾SOD＝704.21U/g小蕾SOD＝746.64U/g不同生長期杏鮑菇子實體SOD活性比較見圖4。
由結(jié)果可知，杏鮑菇不同生長階段子實體內(nèi)超氧化物歧化酶的含量并不相同，其含量變化規(guī)律是小蕾＞大蕾＞小子實體＞大子實體，即越幼嫩的子實體中超氧化物歧化酶的含量越高。說明在幼嫩的組織中細胞的代謝旺盛，細胞代謝過程中產(chǎn)生過多的自由基，相應(yīng)的細胞就合成較多的超氧化物歧化酶用于清除體內(nèi)過多的自由基，維持自由基的代謝平衡。這個結(jié)果與白靈菇子實體的結(jié)果是相同的。
不同生長期白靈菇和杏鮑菇子實體的結(jié)果提示我們，雖然食用菌子實體SOD活性是小蕾最大，隨著子實體的生長，其SOD活性不斷下降。但是每個子實體的總重在不斷增加，SOD總活性在不斷增加。因此如果選擇子實體作為提取SOD的材料，應(yīng)該選擇成品子實體。
3.3干品食用菌SOD活性我們分別測定了材料中的干品食用菌，測定結(jié)果如下(表1)表1 不同干品食用菌SOD活性

這些結(jié)果告訴我們，在四種干品食用菌子實體中。猴頭菇的SOD活性是最高的，達4235.73U/g可以作為子實體提取SOD的首選材料。
靈芝的SOD活性較低于猴頭菇，是由于其木質(zhì)化程度高于猴頭菇，鑒于靈芝是價值較高的食用菌，所以不宜選用它作為提取SOD的材料。
銀耳的SOD活性水平位于所試食用菌的中游，不宜作為提取SOD的材料。
蛹蟲草子座SOD活性并不高，同時考慮到蛹蟲草的市場價格比較高，所以它不宜作為提取SOD的材料。
菌糠不同提取時間和方法提取效果的比較由于菌絲體緊密附著于培養(yǎng)基，況且，菌糠中含有大量的胞外SOD，必須經(jīng)過一定時間的提取，并且提取過程中振蕩與靜置提取也有區(qū)別。該方面結(jié)果見圖5由圖5可知，振蕩提取效率始終比靜置提取高。振蕩提取到30min以后酶活性不再增長，說明提取效率達到最大。結(jié)果提示我們，應(yīng)該用振蕩法提取30min可以達到好的提取效果。
3.4菌糠SOD活性3.4.1杏鮑菇菌糠中菌絲體胞SOD內(nèi)酶與胞外酶的比較文獻報道在大多數(shù)的生物中超氧化物歧化酶為胞內(nèi)酶，主要存在于細胞的線粒體等細胞器中，但少數(shù)生物如真菌和動物中也存在一定數(shù)量的胞外酶。為了研究食用菌菌絲體胞內(nèi)酶與胞外酶的分布，我們以杏鮑菇、蛹蟲草菌絲體為材料進行了研究。其結(jié)果為在杏鮑菇剛長滿菌絲體時超氧化物歧化酶胞外酶含量為544.88U/g。
剛長滿菌絲體時破壁后粗酶液中超氧化物歧化酶含量為1134.45U/g。
由結(jié)果可知，菌絲體胞外超氧化物歧化酶含量比較高，占菌絲體總中總酶量的48％。說明在杏鮑菇菌絲體中超氧化物歧化酶在胞外存在量約占總酶量的50％。這個結(jié)果提示我們，在提取過程中，既要注意胞內(nèi)SOD，又要注意胞外SOD。
3.4.2杏鮑菇不同生長階段菌糠中SOD含量比較我們比較了杏鮑菇不同生長階段菌絲體中超氧化物歧化酶的含量，意在找出超氧化物歧化酶的含量隨菌絲體生長的變化規(guī)律。杏鮑菇不同生長階段菌絲體粗酶液中SOD含量見表2。
表2 杏鮑菇不同生長階段菌糠的菌絲體粗酶液中SOD含量

杏鮑菇不同生長階段菌糠中SOD含量比較見圖6由結(jié)果可知不同生長階段的菌絲體中SOD含量也不相同，隨著菌絲體的生長經(jīng)歷了從低到高再到低的過程。
杏鮑菇菌絲體處于養(yǎng)菌后期時SOD的含量達到最高點，但是到出菇后期其SOD活性依然為1088.26U/g。這也是一個相當(dāng)不錯的活性。
從以上結(jié)果我們可以得知，杏鮑菇菌糠SOD活性很高，即使到了出菇后期，其SOD活性依然高于其他菇類。各種菇類的子實體中，猴頭菇子實體SOD活性最高，其次是靈芝和銀耳，但是它們是干品，若按鮮品算，最高的是蛹蟲草，其次是杏鮑菇。用蛹蟲草作為提取SOD的原料有些得不償失，所以所試子實體材料中，杏鮑菇是最佳選擇。從子實體生長不同時期SOD活性看，酶活性由高及低也依次是小蕾、大蕾、小子實體、大子實體。從經(jīng)濟效益看，應(yīng)該選擇大子實體。菌糠與子實體綜合考慮。由于杏鮑菇子實體有著相當(dāng)不錯的市場價格，可以為生產(chǎn)單位創(chuàng)造利潤，而出菇后期的菌糠只是廢料，所以我們選定杏鮑菇出菇后期的菌糠為提取SOD的材料。
二、細胞壁破壁方法的研究1研究的目的和意義由粗酶液制備結(jié)果可知，食用菌SOD既有胞內(nèi)酶，也有胞外酶。食用菌的菌絲體有細胞壁，要想提高SOD的提取率，必須要破壁。現(xiàn)在常用的破壁方法有機械法，即使用勻漿器、研缽、組織搗碎機等利用機械力漿細胞破碎；有化學(xué)法，即利用丙酮、氯仿、甲苯等脂溶性溶劑溶解細胞膜，使細胞結(jié)構(gòu)破壞的方法；有物理處理法，包括反復(fù)凍融法、冷熱交替法、超聲波振蕩法、滲透壓沖擊法等；有酶解法，即利用溶菌酶破碎微生物細胞壁。這些方法中，最常用的是氯仿破壁法、甲苯破壁法和超聲波破壁法。由于氯仿毒性比較大，我們一般用甲苯和超聲波破壁法分別以杏鮑菇菌絲體為材料，分別進行了處理，并對這兩種方法的條件進行了試驗。目的在于確定一種安全有效的破壁方法。
2材料與方法2.1材料2.1.1菌絲體。杏鮑菇菌絲體，來源于眾成公司食用菌生產(chǎn)車間，處于養(yǎng)菌后期。
2.1.2試劑。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、鄰苯三酚(焦性沒食子酸)、抗壞血酸、鹽酸、Tris-Base、考馬斯亮藍G250、磷酸、95％乙醇、牛血清白蛋白、氯化鈉、甲苯、丙酮等，其中考馬斯亮藍為進口分裝，牛血清白蛋白為生化試劑，其余均為國產(chǎn)分析純。
2.1.3儀器。HY-5調(diào)速多用振蕩器，TDL-5離心機，7200型可見分光光度計，UV-2000型紫外可見分光光度計，JY92-II超聲波細胞粉碎機，PHS-2C型精密酸度計，三用電熱恒溫水箱。
2.2方法2.2.1直接法(對菌絲體不作任何處理)按每g杏鮑菇菌糠培養(yǎng)基加入4ml磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7.8，含0.1mmol/L EDTA)，放在振蕩器上洗滌30min，四層紗布過濾，收集液體，靜置30min，收集上清液，此即SOD粗提液。
2.2.2甲苯破壁法用直接法獲得SOD提取液，4000r/min離心20min，收集上清液與沉淀，上清夜備用；每g沉淀加入0.8g甲苯，35℃破壁45min，以20mmol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)提取30min，4000r/min離心20min，收集上清液，與原上清液混合，此即甲苯破壁法的SOD粗提液。
2.2.3超聲波破壁法用直接法獲得SOD提取液，4000r/min離心20min，收集上清液與沉淀，上清夜備用；沉淀以20mmol/L pH7.8磷酸緩沖液(含0.1mmol/L EDTA)溶解，100W超聲波破壁5min，靜置提取30min，4000r/min離心20min，收集上清液，與原上清液混合，此即超聲波破壁法的SOD粗提液。
3結(jié)果與討論3.1甲苯破壁法3.1.1工藝流程設(shè)計。根據(jù)資料報道和我們以前的工作經(jīng)驗，設(shè)計了甲苯破壁法工藝流程見圖73.1.2破壁時間的選擇甲苯破壁是比較溫和的辦法，完全使細胞壁破壁需要一定的時間。我們在25-65min范圍內(nèi)作了破壁時間的選擇試驗，其結(jié)果見圖8。
由結(jié)果可知，在25-45min范圍內(nèi)，隨著甲苯處理時間的延長，溶液中酶活性不斷上升，到45min以后，酶活性基本穩(wěn)定，這說明甲苯破壁的最佳作用時間為45min。
3.1.3破壁溫度的選擇溫度對甲苯破壁的效果如何影響，報道很少，為了了解溫度對破壁效果的影響，我們在20-45℃范圍內(nèi)研究了破壁溫度對提取效果的影響。結(jié)果見圖9。
由結(jié)果可知，在低于25℃時，提取的SOD活性比較低，當(dāng)高于25℃后提取的酶活性變化不大，但以35℃最高。這結(jié)果提示我們甲苯的破壁溫度需在25℃以上，以35℃最好。
3.1.4甲苯破壁后提取時間的確定甲苯處理菌絲體后，只是使細胞壁和生物膜出現(xiàn)漏洞，通透性增加，要使酶溶到提取液中，需要一定的時間。我們在15-45min范圍內(nèi)研究了甲苯破壁后的最佳提取時間，結(jié)果見表3。
表3 甲苯破壁后不同提取時間的SOD活性

由表3數(shù)據(jù)我們可以了解到，甲苯破壁后，隨著靜置時間的延長，提取液中SOD活性不斷增長，說明即使已經(jīng)破壁，菌絲體胞內(nèi)SOD的滲出是需要一定時間的。當(dāng)靜置達到30min以后提取液中SOD別樣基本不再增加，這說明，胞內(nèi)SOD基本已經(jīng)滲出。結(jié)果說明甲苯破壁后，再靜置提取30min可以達到較好的提取效果。
3.1.5小結(jié)通過如上試驗，我們了解到，甲苯破壁法實施最佳條件是在35℃條件下，甲苯作用樣品45min，然后靜置提取30min。
3.2超聲波破壁法3.2.1超聲波破壁法工藝流程設(shè)計超聲波破壁法制備SOD全酶粗提液過程見圖103.2.2超聲波破碎功率對SOD的提取率及活性的影響在相同時間內(nèi)，考察不同功率下的破碎情況。結(jié)果見圖11。
由結(jié)果可知，在0～50W時，總蛋白含量與比活性基本不變，說明超聲波對細胞破碎及酶活性作用不很明顯；在60～160W時，總蛋白含量有所提高，酶比活在80W達到最大，以后逐步下降，在100W時蛋白量與酶比活達到平衡。說明最佳破碎功率為100W。
3.2.3超聲波破碎時間對SOD的提取率及活性的影響在一定的功率下，考察不同破碎時間所得浸提液的總蛋白含量和總酶活性。結(jié)果見圖12。
由結(jié)果可知，在0～3min時總蛋白含量基本接近，總酶活及比活基本不變，說明破碎的細胞數(shù)量沒有增多，SOD的活性也沒有損失；在3～7min時總蛋白含量提高了5％左右，但在6min后酶的比活有所下降，說明超聲波使部分酶失活，由圖12可以得出，最佳破碎時間為5min.
3.2.4小結(jié)根據(jù)試驗結(jié)果，超聲波破壁的操作為100W，破壁5min提取效果最佳。
4討論與結(jié)論我們用出菇后期菌絲體固體培養(yǎng)基為材料，研究了不破壁，甲苯破壁和超聲波破壁三種不同方法提取SOD的效果，其比較結(jié)果見表4。
表4 三種不同方法提取SOD效果的比較

結(jié)果表明，三種方法提取SOD粗酶液的總酶活力，甲苯破壁法最高，為10882.6U，超聲波波破壁法次之，為10023.3U，不破壁最低，為5626.8U；說明利用菌絲體提取SOD必需要破壁。我們所用的兩種方法差異不大，都可以用于生產(chǎn)。從酶比活力看，甲苯破壁法也最高，為566.44U/mg，直接法次之，為529.75U/mg，超聲波波破壁法最低，為514.48U/mg。雖然有所差異，但是差異不大。考慮到雖然使用超聲波法需購買價格較高的設(shè)備，但這只是一次性投入，而且超聲波法無任何污染，所以選用超聲波法破壁。
三、SOD提純方法的研究(一)雜蛋白去除方法的研究1目的和意義粗酶液中除了水溶性的雜質(zhì)之外，主要是雜蛋白。如何將雜蛋白與SOD分離是分離提純SOD的關(guān)鍵。關(guān)于分離雜蛋白的方法有多種，有鹽析法、有機溶劑沉淀法、等電點沉淀法、熱變性沉淀法、凝膠層析法、離子交換法等，根據(jù)SOD的熱穩(wěn)定性、水溶性以及等電點等性質(zhì)，根據(jù)多個研究微生物SOD的報道，我們擬采用熱變性沉淀、酸沉淀和有機溶劑沉淀等幾種方法的綜合應(yīng)用，以形成食用菌子實體和菌絲體SOD分離提純方法。
2材料與方法2.1材料2.1.1食用菌杏鮑菇菌糠，由眾成公司生產(chǎn)車間提供。
2.1.2試劑丙酮，鹽酸為分析純，其余試劑同SOD活性測定部分。
2.1.3設(shè)備UnicoUV-2000型紫外分光光度計，SHH.W21.600型三用電熱恒溫水箱，TDL-5型高速冷凍離心機，PHS-2C型精密酸度計，HY-5型調(diào)速多用振蕩器。
2.2方法2.2.1粗酶液制備見本申請相關(guān)部分。
2.2.2熱不穩(wěn)定蛋白的去除將SOD粗提液置于50℃恒溫水浴箱中保溫30min，出現(xiàn)白色沉淀，4000r/min離心20min，沉淀為熱不穩(wěn)定雜蛋白，去除，收集上清液。
2.2.3酸不穩(wěn)定蛋白的去除。將上述用上清液2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，用pH計測定酸堿度，出現(xiàn)沉淀，4000r/min離心20min，沉淀為酸不穩(wěn)定雜蛋白，去除，收集上清液。
2.2.4丙酮沉淀雜蛋白。上述上清液加入0.6倍冷丙酮，攪拌均勻后，4000r/min離心20min，除去沉淀雜蛋白，收集上清液。
2.2.5丙酮沉淀SOD。上述上清液再加入0.6倍冷丙酮，攪拌均勻后，4000r/min離心20min，除去上清液，收集沉淀，此即SOD純化產(chǎn)品。
3結(jié)果與分析3.1熱不穩(wěn)定雜蛋白的去除在較高溫度下，蛋白質(zhì)分子由于各個原子的動能增大，使得穩(wěn)定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的作用力不足以保證其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，則蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，嚴(yán)重時會造成空間結(jié)構(gòu)的破壞，即發(fā)生變性沉淀。不同的蛋白質(zhì)其熱穩(wěn)定性不同。據(jù)報道SOD分子具有較好的熱穩(wěn)定性，75℃作用15分鐘，活性不變。根據(jù)SOD的這個性質(zhì)，我們將SOD粗酶液加熱，讓那些熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀，從而把這一部分雜蛋白分離去除。在這個步驟中，加熱的溫度和時間是必要的兩個條件。
3.2.1熱不穩(wěn)定雜蛋白去除的溫度溫度越高，熱不穩(wěn)定雜蛋白越易去除，但是溫度太高，又會影響到SOD的活性。所以需要對熱不穩(wěn)定雜蛋白去除的溫度進行選擇。我們在40-65℃范圍內(nèi)隔5℃設(shè)置一個溫度，并保溫25min，結(jié)果見圖13。
由圖13可知，45-50℃范圍內(nèi)，SOD比活力在上升，到50℃以后，略有下降，所以熱不穩(wěn)定雜蛋白去除的溫度以50℃為好。
3.2酸不穩(wěn)定雜蛋白的去除蛋白質(zhì)具有一定的酸堿穩(wěn)定性，如果偏離其穩(wěn)定的酸堿范圍，則其活性就會下降，如果酸堿偏離過大，就會造成酸堿變性，從而發(fā)生沉淀。據(jù)報道，SOD在pH5.3-9.6間穩(wěn)定性能良好，在pH4.5-11.0間能穩(wěn)定存在。我們通過調(diào)節(jié)提取液pH值，作了酸不穩(wěn)定雜蛋白沉淀試驗。結(jié)果見圖14。
由結(jié)果可知，當(dāng)pH為6時SOD比活力較小，因為此時溶液中雜蛋白沉淀比較少，雖然SOD多，但是蛋白總量也多，所以比活力小；當(dāng)pH為4時SOD比活力也較小，這可能是雖然雜蛋白已部分去除，但SOD活性有所下降所致。酶活力最高的pH是5。所以酸沉淀雜蛋白的pH應(yīng)選5.0。
3.3丙酮去除雜蛋白有機溶劑是常規(guī)的蛋白質(zhì)沉淀劑。但是并不是所有的蛋白質(zhì)都能被有機溶劑沉淀。比如乙醇和丙酮，能夠使一些蛋白質(zhì)沉淀，但是，有一些蛋臼質(zhì)可以在這些溶劑中穩(wěn)定存在。不同濃度的乙醇和丙酮，沉淀蛋白質(zhì)的種類也不同。不同倍數(shù)冷丙酮沉淀雜蛋白的結(jié)果見圖15。
由結(jié)果可知，隨著丙酮的加入，提取液中SOD比活力提高，說明雜蛋白去除量增加，但超過0.6倍后SOD活力略有下降。說明0.6倍丙酮是沉淀雜蛋白的較好濃度。
3.4丙酮沉淀SODSOD屬于在中等丙酮濃度下能夠穩(wěn)定存在的酶類。所以我們利用丙酮沉淀了雜蛋白質(zhì)后，再增加丙酮濃度，使SOD得以沉淀。結(jié)果如圖16。
由圖16結(jié)果我們可以知道，要想使很好地SOD沉淀下來，需要再加入0.6倍的丙酮。
4討論與結(jié)論在研究中，我們分別采用了熱沉淀法分離雜蛋白、酸沉淀法分離雜蛋白和丙酮沉淀雜蛋白的方法，通過條件研究，分別確定了各自的最佳條件，從而得到了符合規(guī)定的產(chǎn)品。所以這個工藝流程是可行的。
具體工藝流程為首先粗酶液經(jīng)50℃保溫30min，4000r/min離心15min，除去熱不穩(wěn)定性雜蛋白；然后用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至5.0，4000r/min離心15min，除去酸不穩(wěn)定雜蛋白；上清液中加入0.6倍冷丙酮，攪拌均勻，4000r/min離心20min，除去沉淀雜蛋白；上清液中繼續(xù)加入0.6倍的冷丙酮，離心收集沉淀，便可得到純化的SOD產(chǎn)品。
四、產(chǎn)品中殘余色素的去除1研究的目的和意義由于菌絲體附著于棉籽殼等組成的培養(yǎng)基上，這種培養(yǎng)基含有不少水溶性色素，雖然在提取過程中這些色素被逐步去掉，但是在最后產(chǎn)品中，還有少量色素存在。這些殘余色素必須去除，才能保證產(chǎn)品的質(zhì)量。
2材料與方法2.1材料2.1.1試驗材料上述步驟得到的SOD。
2.1.2試劑硫酸銨，分析純。
2.1.3設(shè)備TDL-5離心機3結(jié)果鑒于粗酶液的提取用的是水溶液，所以殘余的色素都是水溶性的，可以通過水溶解法加以去除。我們采取二次水溶解法去除殘余色素，即在得到的SOD產(chǎn)品中加入一定量的水，使SOD溶解，然后加入90％硫酸銨，使SOD二次沉淀，從而使色素和SOD分離，然后脫鹽即可得到符合質(zhì)量指標(biāo)的產(chǎn)品。
操作流程見操作流程示意圖174結(jié)論根據(jù)如上結(jié)果，水二次溶解，鹽析沉淀所得到的產(chǎn)品符合要求，該方法可以用于SOD工藝。
五、動物血液、植物、食用菌提取(純)SOD工藝的比較通過三類SOD提取(純)工藝的比較，我們可以得知首先，從工藝成熟程度看，動物血液提取SOD的工藝流程相當(dāng)成熟。植物提取SOD的工藝流程液比較成熟。微生物提取SOD的研究中，利用酵母生產(chǎn)SOD的工藝初步提出，而食用菌SOD的研究只是處于理論研究階段，利用食用菌作為提取材料生產(chǎn)SOD還沒有人進行研究，所以其工藝流程還沒有形成。
其次從工藝的實用性看，由于經(jīng)過多少年的生產(chǎn)實踐，人們在不斷探索動物血液提取SOD的新工藝，比如有以血液為材料，有以血塊為材料，有的提出綜合提取辦法等，動物血液提取SOD的工藝流程相當(dāng)實用。植物提取SOD的工藝研究雖然起步較晚，但是由于有動物血液的基礎(chǔ)，其工藝流程也相當(dāng)實用。在微生物提取SOD的工藝研究中，酵母SOD提取工藝正在走向?qū)嵱?，已?jīng)使用了生產(chǎn)中常用的有機溶劑(乙醇氯仿沉淀法，冷丙酮沉淀法)沉淀法等。而食用菌SOD提取還處于實驗室階段，使用的技術(shù)完全是實驗室技術(shù)，如細胞壁酶解法，硫酸銨鹽析法，DEAE離子交換法等。這些方法只能用于實驗室極小批量的提純研究，無法用于生產(chǎn)中的，該方面技術(shù)還是不實用的。
再次從工藝經(jīng)濟效益看。從動物血液和植物提取SOD的生產(chǎn)工藝，由于工藝流程成熟，所用技術(shù)都是生產(chǎn)化的技術(shù)，所以其經(jīng)濟效益顯著的。從微生物提取SOD的研究中，雖然發(fā)酵法生產(chǎn)SOD產(chǎn)量高，但由于在技術(shù)使用上還有部分高投入技術(shù)；還需要人工培養(yǎng)酵母菌，這要求有技術(shù)和投入較高的培養(yǎng)基；特別是需要投入很大的資金配備發(fā)酵罐及其配套設(shè)備。所以發(fā)酵法生產(chǎn)SOD的經(jīng)濟效益不是很好。食用菌提取SOD只處于理論研究階段，還不能和經(jīng)濟效益掛鉤。
最后從工藝的原料來源和安全性看。我國動物血源豐富，牛血、豬血的價格較低，生產(chǎn)SOD工藝簡單。所以，用牛血、豬血來提取SOD是目前市場SOD的主要來源。但隨著國際上瘋牛病、口啼疫等傳染性疾病的漫延，動物血液中提取的SOD的使用給人們帶來了不少的危險因素。動物原料來源充足，有安全隱患。
利用植物如玉米、大蒜、綠豆等生產(chǎn)SOD生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)成熟，正在走向市場。與動物原料相比，植物原料易于收集存放。加工容易，副產(chǎn)物可以綜合利用，植物SOD制劑比血液SOD制劑性能穩(wěn)定使用安全。植物SOD克服了血液SOD的缺點，所用技術(shù)方法先進，產(chǎn)品安全可靠。但是植物原料易受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和社會需求的影響。
由于食用菌生產(chǎn)SOD的全過程屬于人工控制，食用菌的來源不受限制。食用菌更是在全國廣泛種植，其出菇后的培養(yǎng)基毫無應(yīng)用價值，該工藝的原料來源十分廣泛。
不同材料生產(chǎn)SOD工藝的比較見下表5。
表5 不同材料生產(chǎn)SOD工藝的比較

這些工藝的比較結(jié)果顯示，從動物血液和植物提取SOD各有不足，而以食用菌為材料提取SOD的原料來源非常豐富，產(chǎn)品安全性高，只要能有一個經(jīng)濟實用的工藝流程，其經(jīng)濟效益是顯著的。所以本工藝流程具有很好的實用性和經(jīng)濟效益。
本發(fā)明的創(chuàng)新點在食用菌菌糠提取SOD工藝流程中，我們在其他人工作的基礎(chǔ)上進行了創(chuàng)新，主要的創(chuàng)新點有1、現(xiàn)在正在使用的SOD生產(chǎn)工藝，其原料有動物血液，植物可食部分，酵母等，但是沒有關(guān)于利用食用菌生產(chǎn)SOD的報道。正如前面述及，這些原料各有所長，但是也都有不可避免的不足。本工藝以出完菇的菌糠為原料，可以將食用菌生產(chǎn)的廢料變廢為寶，提高了食用菌生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。也開辟了提取SOD的新途徑，填補了國內(nèi)外SOD生產(chǎn)原料不足的空白。同時，這個創(chuàng)新點的創(chuàng)立，形成了食用菌生產(chǎn)的綜合模式，可以提高食用菌生產(chǎn)的經(jīng)濟效益，形成了該產(chǎn)業(yè)的又一個亮點。
2、在我們的生產(chǎn)工藝中，使用了三種新的技術(shù)——食用菌生產(chǎn)用固體培養(yǎng)基(料)菌絲體提取技術(shù)、菌絲體細胞壁破壁技術(shù)和殘余色素去除技術(shù)。
在提取研究菌絲體SOD過程中，需要將菌絲體與培養(yǎng)基分離。由于現(xiàn)有的研究都是理論研究，其菌絲體都是從液體培養(yǎng)基中過濾而得或固體培養(yǎng)基上直接刮取。從食用菌固體培養(yǎng)基(即料)中如何提取SOD用菌絲體還無人報道。使用我們創(chuàng)立的食用菌生產(chǎn)用固體培養(yǎng)基(料)菌絲體提取技術(shù)，可以將SOD胞外酶和菌絲體一起分離得到，離心或過濾即可得到菌絲體。從而解決了從食用菌生產(chǎn)用固體培養(yǎng)基(料)提取菌絲體的問題。
食用菌菌絲體破壁現(xiàn)在只是實驗室的方法，雖然微生物破壁方法很多，但是哪一種適用于食用菌菌絲體，哪一種可以用于食用菌SOD的生產(chǎn)報道甚少。經(jīng)過試驗，我們認(rèn)為超聲波破壁法使用方便，適于生產(chǎn)，均可以用于食用菌SOD的生產(chǎn)。
雜蛋白去除技術(shù)和殘余色素去除技術(shù)是我們的又一個創(chuàng)新，這個技術(shù)解決了雜蛋白、色素影響產(chǎn)品穩(wěn)定性和活性的問題，是產(chǎn)品質(zhì)量研究的又一突破，具有國際影響意義。
本工藝的特點是流程簡單，設(shè)備簡單，試劑簡單。從粗酶液的制備到得到產(chǎn)品也只需幾個大步驟，所以是流程簡單的工藝；整個操作過程，只需振蕩器、攪拌機機、加熱設(shè)備、普通離心機和普通玻璃器皿，而無需像其他微生物提取SOD工藝，需要發(fā)酵罐、超濾設(shè)備等，因此本工藝設(shè)備簡單，投資不大；生產(chǎn)過程所需試劑只有丙酮，這是普通化學(xué)試劑。所以在工藝上也具有其他生產(chǎn)工藝所不可比擬的優(yōu)勢。


圖1不同生長期的白靈菇子實體圖2白靈菇子實體不同階段SOD活性圖3杏鮑菇不同生長期子實體圖4杏鮑菇不同生長階段子實體粗酶液中SOD活性圖5菌糠不同提取時間和提取方法的提取效率比較圖6杏鮑菇不同生長階段菌糠粗酶液中SOD含量圖7甲苯破壁法工藝流程圖8甲苯破壁時間對提取效果的影響圖9甲苯破壁溫度對提取效果的影響圖10超聲波破壁法工藝流程設(shè)計圖11超聲波破碎功率對SOD的提取率及活性的影響圖12超聲波破碎時間對SOD的提取率及活性的影響圖13不同溫度下提取液中SOD的比活力圖14不同pH時提取液中SOD的比活力圖15加入不同倍數(shù)丙酮后SOD的比活力圖16不同倍數(shù)丙酮沉淀SOD的變化圖17分離色素操作流程示意圖18本發(fā)明工藝流程圖具體實施方式
實施例1一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，包括以下步驟以杏鮑菇菌糠為例，杏鮑菇菌糠為出菇后期的杏鮑菇固體培養(yǎng)基，在出完二茬菇后由菇棚直接轉(zhuǎn)運到SOD生產(chǎn)車間，根據(jù)《原料標(biāo)準(zhǔn)》對菌棒進行逐個檢查，剔除有雜菌的菌棒，去掉培養(yǎng)袋，人工拍碎，即為杏鮑菇菌糠。
(1)菌糠加水振蕩30分鐘，過濾，得到SOD粗酶液；菌糠和水的(重量)比例為1∶4，過濾用4層紗布，過濾后棄去殘渣。
(2)粗酶液離心得到菌絲體沉淀物和上清液(胞外酶)，粗酶液離心4000r/min，15min(由于菌絲體附著于棉籽殼組成的培養(yǎng)基上，首先需要將菌絲體與培養(yǎng)基分離，由于SOD存在胞內(nèi)酶和胞外酶兩種形式，在制備粗酶液時需要將二者全部收集。)(3)菌絲體沉淀物超生波破壁后離心得到胞內(nèi)酶液，超聲波破壁100W時間5～8min(4)上清液和胞內(nèi)酶液混合得到的粗酶液，然后濃縮(用超過濾機反滲透的方法濃縮)，(5)濃縮后的濃縮液在50℃度保溫30分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，加2mol/L的HCl調(diào)整PH值為(5.0)，得到渾濁液，離心4000r/min，15min，離心后的沉淀為熱不穩(wěn)定蛋白，棄去。
再離心，收集上清液，離心4000r/min，15min，離心后的為酸沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，棄去。
在收集到的上清液中加入0.6倍體積的冷丙酮得到的混濁液，(冷丙酮的溫度為7℃)對混濁液離心收集上清液，離心4000r/min，20min，離心后的為雜酸沉淀熱不穩(wěn)定蛋白，棄去。
再在收集的上清液中加入0.6倍體積的7℃丙酮得到混濁液，對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀(SOD)，離心4000r/min，20min。
(6)加水溶解得水溶液，水溶液加90％的硫酸銨得到混濁液，離心收集沉淀，脫鹽即可得到最終產(chǎn)品。4000r/min，15min。
安全評價根據(jù)衛(wèi)生部《食品安全性毒理學(xué)評價程序》對按照本工藝提取出的超氧化物歧化酶進行毒理學(xué)評價，從實驗結(jié)果看，ID50＞20ml/kg，根據(jù)急毒性分級屬于實際無毒級。在三項突變實驗(Ames試驗，微核試驗，精子畸變試驗)中，其結(jié)果均為陰性，根據(jù)《食品安全性毒理學(xué)評價程序》該方法獲得的SOD單位高，無污染，屬純天然活性酶。
實施例2步驟同實施例1，其中步驟(1)振蕩時間為20分鐘；步驟(2)的離心參數(shù)(離心2000r/min，時間持續(xù)30分鐘)；步驟(3)超聲波功率時間范圍(60W，10min)；步驟(5)中，濃縮后的濃縮液在45℃保溫60分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為(4.0)，得到渾濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5倍的4℃冷丙酮得到的混濁液，離心2000r/min，時間持續(xù)30分鐘；
對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入1倍4℃冷丙酮得到混濁液，離心2000r/min，時間持續(xù)15分鐘；對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得SOD粗品。離心2000r/min，時間持續(xù)15分鐘；步驟(6)中，離心2000r/min，時間持續(xù)30分鐘。
實施例3步驟同實施例1，其中步驟(1)振蕩時間為60分鐘；步驟(2)的離心參數(shù)(離心3000r/min，時間持續(xù)20分鐘)；步驟(3)超聲波功率時間范圍150W，3min；步驟(5)中，濃縮后的濃縮液在60℃保溫30分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為(6.0)，得到渾濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入1倍的0℃冷丙酮得到的混濁液，離心3000r/min，時間持續(xù)20分鐘；對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5倍0℃冷丙酮得到混濁液，離心3000r/min，時間持續(xù)20分鐘；對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得SOD粗品。離心3000r/min，時間持續(xù)20分鐘；步驟(6)中，離心3000r/min，時間持續(xù)20分鐘。
實施例4步驟同實施例1，其中步驟(1)振蕩時間為40分鐘；步驟(2)的離心參數(shù)(離心3500r/min，時間持續(xù)25分鐘)；步驟(3)超聲波功率時間范圍(80W，7min)；步驟(5)中，濃縮后的濃縮液在55℃保溫50分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為(4.5)，得到渾濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.7倍的10℃冷丙酮得到的混濁液，離心2500r/min，時間持續(xù)25分鐘；對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.7倍10℃冷丙酮得到混濁液，離心3500r/min，時間持續(xù)25分鐘；對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得SOD粗品。3500r/min，時間持續(xù)20分鐘；步驟(6)中，離心2500r/min，時間持續(xù)25分鐘。
實施例5步驟同實施例1，其中步驟(3)采用甲苯破壁法，實施最佳條件是在35℃條件下，加甲苯作用于樣品45min，然后靜置提取30min。
權(quán)利要求
1.一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于包括以下步驟(1)、菌糠加水振蕩20～60分鐘，過濾，得到SOD粗酶液，(2)、粗酶液離心得到菌絲體沉淀物和上清液，(3)、菌絲體沉淀物破壁后離心得到胞內(nèi)酶液，(4)、上清液和胞內(nèi)酶液混合得到的粗酶液濃縮，(5)、濃縮后的濃縮液在45～60℃保溫30～60分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為4.0～6.0，得到渾濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到的混濁液，對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.5～1倍的丙酮得到混濁液，對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得SOD粗品，(6)、加水溶解得水溶液，水溶液加硫酸銨得到混濁液，離心收集沉淀，脫鹽即可得到最終SOD純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于包括以下步驟，(1)、菌糠加水振蕩30分鐘，過濾，得到SOD粗酶液，(2)、粗酶液離心得到菌絲體沉淀物和上清液(胞外酶)，(3)、菌絲體沉淀物超聲波破壁后離心得到胞內(nèi)酶液，超聲波功率時間為100W，5min，(4)、上清液和胞內(nèi)酶液混合得到的粗酶液濃縮，(5)、濃縮后的濃縮液在50℃保溫30分鐘得到混濁液，混濁液離心，收集上清液，調(diào)整PH值為5.0，得到渾濁液，再離心，收集上清液，在收集到的上清液中加入0.6倍的丙酮得到的混濁液，丙酮溫度為0～10℃，對混濁液離心收集上清液，再在收集的上清液中加入0.6倍的丙酮得到混濁液，丙酮溫度為0～10℃，對混濁液離心分離，棄上清液，收集沉淀，得SOD粗品，(6)、加水溶解得水溶液，水溶液加90％的硫酸銨得到混濁液，離心收集沉淀，脫鹽即可得到最終SOD純品，離心4000r/min，時間持續(xù)15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于菌糠選用杏鮑菇菌糠。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于步驟(3)中菌絲體沉淀物破壁選用超聲波破壁，超聲波功率范圍60～150W，時間3～10min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于步驟(2)離心參數(shù)2000～4000r/min，時間持續(xù)15～30分鐘，步驟(5)三次的離心均分別為2000～4000r/min，時間持續(xù)15～30分鐘，步驟(6)離心2000～4000r/min，時間持續(xù)15～30分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝，其特征在于步驟(2)離心參數(shù)4000r/min，時間持續(xù)15分鐘，步驟(5)三次的離心分別為4000r/min，時間持續(xù)15分鐘；4000r/min，時間持續(xù)20分鐘；4000r/min，時間持續(xù)20分鐘，步驟(6)離心4000r/min，時間持續(xù)15分鐘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物體中提取超氧化物歧化酶技術(shù)，具體為一種食用菌菌糠超氧化物歧化酶提取工藝。解決了現(xiàn)有技術(shù)中沒有從食用菌菌糠中提取SOD的工藝的問題。包括以下步驟粗酶液的制備，超聲波破壁、分離提純、色素去除等。本工藝以出完菇的菌糠為原料，可以將食用菌生產(chǎn)的廢料變廢為寶，提高了食用菌生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。也開辟了提取SOD的新途徑，填補了國內(nèi)外SOD生產(chǎn)原料不足的空白，本工藝的特點是流程簡單，設(shè)備簡單，試劑簡單。
文檔編號C12N9/08GK1924010SQ20061004829
公開日2007年3月7日 申請日期2006年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月13日
發(fā)明者王金勝, 杜雙田, 張玉標(biāo), 秦革年, 郭誠, 申紅兵 申請人:山西眾成生物工程有限公司