一種微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物催化領(lǐng)域，具體設(shè)及一種脂肪酶催化混合油的游離脂肪酸及棟桐 酸甘S醋（tripalmitin，PP巧合成母乳脂肪替代品及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 母乳脂肪作為嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育期間的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它對(duì)嬰兒細(xì)胞膜的構(gòu)建、維 生素的吸收、能量補(bǔ)充及智力發(fā)育有著重要的作用。當(dāng)母乳供應(yīng)不足，或者嬰兒斷奶后需 要增加輔食時(shí)，母乳脂肪替代品（HumanmUkfatsubsititute,HMF巧作為代替母乳的 嬰兒喂養(yǎng)食物，其結(jié)構(gòu)功能應(yīng)當(dāng)與天然母乳脂肪及其類似，除了提供母乳所能提供的營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)之外，還必須給予嬰幼兒更多有助于他們身體、智力發(fā)育的必要元素和有機(jī)物。添加 HMK的配方奶粉，在體內(nèi)主要Wsn-2棟桐酸甘油單醋和游離油酸的形式吸收，防止產(chǎn)生游 離棟桐酸和Ga2+形成不溶的皂巧影響脂肪酸和Ga2+的吸收，造成大量巧質(zhì)的流失化ipid Technology, 2010, 22 (6) : 126-129)，從而引起嬰幼兒便秘及腹痛。
[0003] 此外，與喂食普通奶粉的嬰兒相比，喂食高含量sn-2棟桐酸配方奶粉的嬰兒骨骼 礦物質(zhì)的吸收率更高，從而更好地支持嬰幼兒體格和骨骼的自然成長(zhǎng)。因此，HMK的化學(xué) 結(jié)構(gòu)和脂肪酸組成是影響嬰幼兒配方奶粉營(yíng)養(yǎng)功能的重要因素。
[0004] 目前，現(xiàn)階段市場(chǎng)上的人工合成HMFS的原料主要有魚油、豬油、牛乳脂等動(dòng)物油， 棟桐油、菜巧油等植物油，雖然來(lái)源豐富，但是運(yùn)些底物均有相應(yīng)的缺點(diǎn)。如魚油易氧化 不穩(wěn)定，豬油中含過(guò)多硬脂酸，易使產(chǎn)物結(jié)塊，影響嬰兒吸收并且會(huì)受人文宗教因素的限 審IJ;牛乳代替母乳直接喂養(yǎng)，難W被嬰兒吸收，已被市場(chǎng)所淘汰；植物油中雖然說(shuō)其組成與 HMFS具有相似性，但是脂肪酸甘油S醋中分布結(jié)構(gòu)的不同（AmericanDai巧ScienceAsso ciation，2007, 90(4) :2147-2154)，導(dǎo)致了嬰兒還是難W吸收。綜上，運(yùn)些原材料來(lái)源往往 受到諸多方面的限制，且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也良莽不齊；制備工藝過(guò)程繁瑣，不飽和脂肪酸易氧化， 生產(chǎn)成本高；不同國(guó)家、地區(qū)、民族、及文化背景等地域文化的限制客觀存在。因此，都不是 人工合成HMFS的最佳原料。 陽(yáng)0化]近年來(lái)，隨著陸地資源的枯竭，促使人類走向海洋尋求新型的資源，與此同時(shí)，易 培養(yǎng)、高油脂、富含DHA、脂肪酸組成及分布多樣化的微藻的出現(xiàn)帶給人類前所未有的機(jī)遇。 研究表明，藻油作為一種新興的純天然油脂，其總多不飽和脂肪酸含量很高（50%W上）， 含有豐富的DHA、DPA等W-3 不飽和脂肪酸巧uropeanJournalofLipidScienceand Technology, 2013, 115(9) :965-976)，而且具有安全、無(wú)污染、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，理論上是 制備功能性HMK的優(yōu)質(zhì)原料。但是，由于藻油甘油S醋中脂肪酸組成及分布的自身特點(diǎn)， 其sn-1，3位含有一定量的棟桐酸，不利于嬰幼兒的消化吸收，不能直接用作HFMS。因此， 本專利選擇將天然的藻油進(jìn)行合理的酶法結(jié)構(gòu)改造，將其與富含短碳鏈的挪子油、富含單 不飽和脂肪酸的橄攬油和富含DHA的藻油按照相應(yīng)的比例制備成酷基供體，與PPP酶促合 成更加符合嬰幼兒營(yíng)養(yǎng)需求的母乳化HMK是一種非常合理且切實(shí)可行的途徑。
[0006] 酶法制備母乳脂肪替代品，除了上述酶和原材料的開發(fā)和研究W外還有生物 催化技術(shù)的改進(jìn)。由于油脂粘度較高，給反應(yīng)過(guò)程的傳質(zhì)傳熱效應(yīng)帶來(lái)負(fù)面的影響，然 而，近年來(lái)發(fā)展的利用低溫微波技術(shù)來(lái)增強(qiáng)液-液非均相體系的傳質(zhì)是一種有效的解 決油脂流動(dòng)性問(wèn)題的手段度ioresource Technology, 2011, 102(11) :6617-6620)。與 傳統(tǒng)反應(yīng)器相比，微波場(chǎng)強(qiáng)化能夠增強(qiáng)醋類合成反應(yīng)的場(chǎng)效應(yīng)，促使酶促反應(yīng)高效進(jìn) 行，大大提高了目標(biāo)產(chǎn)物的時(shí)空產(chǎn)率，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高酶的穩(wěn)定性度ioresource Technology, 2013, 149:367-374)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生物催化中，尤其是非水相酶促反應(yīng) 中。
[0007] 目前"微波福射-酶禪合催化技術(shù)"已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究度ioresourceTec hnology，2010, 101 (13) :4851-4861)，用恒定的微波福射功率結(jié)合恒定的反應(yīng)溫度，使微波 的非致熱效應(yīng)得到顯著加強(qiáng)。然而，截至目前，利用微波輔助酶促合成母乳脂肪替代品的文 獻(xiàn)報(bào)道較少，但是，考慮到微波的場(chǎng)致特性，它在HMK合成中的應(yīng)用將會(huì)逐漸擴(kuò)大。因此， 本文考察了脂肪酶催化混合游離脂肪酸與PPP反應(yīng)制備HMK的同時(shí)，通過(guò)控制水活度來(lái)試 圖提高產(chǎn)物得率，將低溫微波技術(shù)應(yīng)用到酶促轉(zhuǎn)醋化制備富含DHA的HMK上，分別闡明微 水、微波對(duì)酶促轉(zhuǎn)醋化的影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明針對(duì)用于嬰兒配方食品的現(xiàn)有Hire及其制備方法的相 關(guān)問(wèn)題，W富油棟桐酸（C16:0)的橄攬油、含有辛酸（C8:0)、月桂酸（C10:0)等短碳鏈脂肪 酸的挪子油，及富含DHA的微藻為原料，提供一種微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替 代品及其制備方法，選擇性富集甘油S醋中sn-1，3位上DHA等不飽和脂肪酸的含量，制備 出的HMFS不用再額外添加DHA。本方法制備出的HMK提高了sn-2位上棟桐酸的含量，能 與母乳脂肪sn-2位保持一致，即60%W上。對(duì)于HMFS的功能提高有很大幫助。
[0009] 技術(shù)方案：一種微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品的制備方法，其步 驟為：1)水活度的控制方法：分別將3A分子篩及Li化、LiCl、CH3COOK、Mg(N〇3)2?6&0、 化Cl、KCl、Kz化2〇7配制成飽和溶液放置于密閉的容器中，室溫下3A分子篩用于控制水活度 < 0. 01，各個(gè)飽和溶液所控制的水活度分別為0. 05、0. 11、0. 23、0. 54、0. 75、0. 85、0. 95 ;將 通過(guò)尿素包合法純化得到的游離脂肪酸橄攬油、挪子油和藻油按照質(zhì)量比為70:15:15~ 98:1:1混合，與棟桐酸甘=醋一起作為脂肪酶酶促醋交換的底物，并將游離脂肪酸混合物 和棟桐酸甘=醋混合置于同一反應(yīng)瓶中，將反應(yīng)瓶及盛有脂肪酶的濾紙分別放入各個(gè)密閉 的容器中于室溫下平衡2-3d;2)脂肪酶催化酸解：上步平衡結(jié)束后，取出底物、脂肪酶放入 螺口玻璃瓶密閉，分別在恒溫水域搖床及微波反應(yīng)器中進(jìn)行酶法醋交換反應(yīng)，所述棟桐酸 甘=醋與混合游離脂肪酸的混合質(zhì)量比為1:1~1:15,醋交換反應(yīng)后，經(jīng)減壓蒸饋分離出 反應(yīng)所得到的油脂并精煉，即得母乳脂肪替代物。
[0010]所述脂肪酶為L(zhǎng)ipozyme RM IM、Lipozyme IM60、Lipozyme IM20、Lipase SP435、 Lipase SP382、Candida rugosa lipase、Lipase MC7、Lipozyme TL IM、Novozym 435、 Candida antarctica lipase B、R275A lipase或豬膜脂肪酶。
[0011] 所述配制成飽和溶液的溶劑為乙醇、正下醇、正己燒、環(huán)己燒、乙酸乙醋或乙酸下 醋。
[0012] 所述脂肪酶占反應(yīng)體系的質(zhì)量比例為I%~15%，所述酶法醋交換反應(yīng)的反應(yīng)溫 度為30~80°C，反應(yīng)時(shí)間為15~120min。
[0013] 上述方法制備得到的母乳脂肪替代品。
[0014] 有益效果：本發(fā)明采用sn-1，3位特異性脂肪酶催化混合脂肪酸與PPP定向合成 HMFS。反應(yīng)終產(chǎn)物中富含DHA且其sn-2位上的棟桐酸含量也相對(duì)較高，可W保證與天然母 乳脂肪中sn-2位上棟桐酸含量相當(dāng)，即達(dá)到70%左右。更重要的是，將低溫微波技術(shù)應(yīng)用 到酶促轉(zhuǎn)醋化合成HMK中，為今后規(guī)?；苽銱MK提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，對(duì)于國(guó)外壟 斷產(chǎn)品的國(guó)產(chǎn)化、提高富油微藻的資源利用度、延伸我國(guó)乳品行業(yè)的產(chǎn)業(yè)鏈具有積極的現(xiàn) 實(shí)指導(dǎo)意義。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0016] 用于脂肪酸的定性定量分析的方法是高效氣相色譜，其條件為：采用Agilent 6820氣相色譜儀，型號(hào)HP-INN0WAX，色譜柱長(zhǎng)30m，外徑0. 25mm，內(nèi)徑0. 25ym，采用梯度升 溫方式，初始溫度80°C，柱箱最高溫度250°C，后進(jìn)樣口最高溫度250°C，后檢測(cè)器最高溫度 280°C，總計(jì)43min，進(jìn)樣量為1yL。
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 本實(shí)施例說(shuō)明醋交換所用底物的脂肪酸組成分析。
[0019] 分別將橄攬油、挪子油、藻油通過(guò)尿素包合法純化得到游離脂肪酸，將=種油的游 離脂肪酸按照質(zhì)量比為70:15:15~98:1:1(橄攬油：挪子油：藻油）混合后經(jīng)過(guò)氣相色 譜測(cè)定，得到橄攬油、挪子油和藻油W及混合游離脂肪酸中（W質(zhì)量比橄攬油：挪子油：藻 油=90:5:5為例）各個(gè)脂肪酸的含量見下表1。后續(xù)實(shí)施例所用混合游離脂肪酸均W本實(shí) 施例為原料。
[0020] 表1橄攬油、挪子油和藻油W及混合油（橄攬油：挪子油：藻油=90:5:5)中各 個(gè)脂肪酸的含量
[0021]
陽(yáng)0巧 a:未檢測(cè)到
[0023] W下實(shí)施例說(shuō)明W脂肪酶作催化劑催化醋化反應(yīng)的過(guò)程。
[0024] 實(shí)施例2 陽(yáng)0巧]將PPP(0. 62g)與混合游離脂肪酸（1. 88g)摩爾比1:9混合后，加入sn-1，3位特 異性脂肪酶LipozymeRMIM10% (0.25g)，放入60 °C水浴搖床中反應(yīng)化。 陽(yáng)〇%] 反應(yīng)結(jié)束后取出500yL，加入60mg豬膜脂肪酶水解3min，用乙酸萃取，取有機(jī)層 進(jìn)行薄層層析，刮取sn-2位單甘脂條帶。加入2血正己燒和2血0.5molKOH