一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物保護(hù)領(lǐng)域，特別涉及一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]木爾坦棉花曲葉病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMuV)最先被發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦木爾坦地區(qū)棉花上一種植物病毒，是引起巴基斯坦棉花曲葉病大流行的主要病原病毒之一。該病毒屬雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)；由煙粉虱以持久方式傳播，但不能通過(guò)機(jī)械摩擦接種和種子帶毒傳播。該病毒基因組僅含A組分(DNA-A)，為單鏈環(huán)狀，是一種單組分雙生病毒。目前已報(bào)道的CLCuMuV各分離物普遍伴有β衛(wèi)星分子(先前稱之為DNA β)0 CLCuMuV主要分布于巴基斯坦、印度、菲律賓、老撾、越南及我國(guó)的廣東、廣西、海南、云南、福建、江蘇等地，已報(bào)道的自然寄主包括棉花、朱槿、垂花懸鈴花、黃秋葵、紅麻等5種植物。
[0003]建立植物病毒人工接種方法，將其接種到相關(guān)寄主植物上，是研究病毒的致病性和為害性的前提和基礎(chǔ)。關(guān)于CLCuMuV人工接種寄主植物的方法，目前已報(bào)道的方法有三種。Briddon等于2001年通過(guò)基因槍轟擊接種方法將CLCuMuV接種棉花，并引起曲葉病(Briddon等，Virology, 2001, 285(2):234-243)。林林等于2011年通過(guò)煙粉虱傳毒接種方法將CLCuMuV接種棉花、紅麻、朱槿、西菲葵、黃蜀葵等5種植物，并引起它們發(fā)病(林林等，植物保護(hù)，2011，37(4):44-47)。湯亞飛和何自福等于2015年通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆注射接種方法將CLCuMuV接種棉花，并引起曲葉病(湯亞飛等，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015)。截止目前，還沒(méi)有關(guān)于通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆注射接種方法將CLCuMuV接種紅麻的報(bào)道。
[0004]煙粉虱傳毒接種方法，是利用煙粉虱在毒源植株上獲毒(CLCuMuV)飼育一定時(shí)間，然后傳毒接種到待健康植株上。該方法不足之處在于需要分離、純化、飼養(yǎng)和保持煙粉虱種群，要求專業(yè)性強(qiáng)，且耗時(shí)，接種成功與否還受季節(jié)等環(huán)境因子影響明顯，同時(shí)煙粉虱可能將毒源上包括CLCuMuV在內(nèi)的各種病毒等微生物無(wú)區(qū)別地全部傳播到接種植株上?；驑屴Z擊接種方法，是利用專業(yè)設(shè)備基因槍將包裹了帶有CLCuMuV的高速微彈直接送入完整的植物組織細(xì)胞中。該方法不足在于需要購(gòu)買(mǎi)價(jià)格昂貴的專業(yè)儀器基因槍，且需要專業(yè)人才操作，運(yùn)行成本昂貴，難以適用于大量樣本的操作。侵染性克隆注射接種方法，是將CLCuMuV的基因組克隆到植物表達(dá)載體上，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，通過(guò)人工注射接種到植物組織中，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物的侵染。該方法操作簡(jiǎn)便、成本低、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但需要針對(duì)不同寄主植物研制不同的接種方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于提供一種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法，該方法操作具有簡(jiǎn)便、成本低、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
[0006]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]—種木爾坦棉花曲葉病毒侵染紅麻的接種方法，包括如下步驟:
[0009](I)侵染性克隆的構(gòu)建
[0010]將木爾坦棉花曲葉病毒(Cottonleaf curl Multan virus，CLCuMuV) 1.3 ?2.0個(gè)拷貝的正向重復(fù)全長(zhǎng)基因組(DNA-A)和2個(gè)拷貝的正向重復(fù)β衛(wèi)星分子φΝΑβ)分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體上，得到含有1.3?2.0個(gè)拷貝的正向重復(fù)全長(zhǎng)基因組的侵染性克隆I和含有2個(gè)拷貝的正向重復(fù)β衛(wèi)星分子的侵染性克隆II ;
[0011](2)接種菌液的準(zhǔn)備
[0012]將步驟⑴構(gòu)建的侵染性克隆I和II分別導(dǎo)入到農(nóng)桿菌中，獲得含有侵染性克隆I的農(nóng)桿菌和含有侵染性克隆II的農(nóng)桿菌；分別培養(yǎng)并收集含有侵染性克隆I和II的農(nóng)桿菌菌體，用接種緩沖液重懸菌體并靜置2?3h，得到用于接種紅麻的接種菌液I和II ;
[0013]⑶接種處理
[0014]將步驟⑵制得的接種菌液I和II按1:1體積比混合，得到混合菌液，將混合菌液分6?8點(diǎn)注射接種4?5葉期的紅麻植株的葉肉組織和莖干維管束組織中，然后將接種后的紅麻植株繼續(xù)培養(yǎng)；
[0015]步驟(I)中所述的植物表達(dá)載體優(yōu)選為pBinPLUS或pGreen II 049 ；
[0016]步驟(I)中所述的侵染性克隆I優(yōu)選為pBinPLUS-Ι.85A或pGreen II 049-1.6A ；
[0017]步驟(I)中所述的侵染性克隆I進(jìn)一步優(yōu)選為pBinPLUS-Ι.85A ；
[0018]步驟(I)中所述的侵染性克隆II優(yōu)選為和pBinPLUS-2.0 β或pGreen II 049-2.0 β ；
[0019]步驟(I)中所述的侵染性克隆II進(jìn)一步優(yōu)選為和pBinPLUS_2.0f3 ；
[0020]步驟(2)中所述的農(nóng)桿菌優(yōu)選為EHA105或GV3101 ；
[0021]步驟(2)中所述的含有侵染性克隆I和II的農(nóng)桿菌菌體優(yōu)選通過(guò)如下方法獲得:分別活化含有侵染性克隆I和II的農(nóng)桿菌菌種，然后挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，28°C、180?220rpm振蕩培養(yǎng)20?24小時(shí)，獲得種子液；取種子液接種于液體培養(yǎng)基中，280C、180?220rpm振蕩培養(yǎng)20?24小時(shí)，收集菌液，離心，棄上清，分別獲得含有侵染性克隆I和II的農(nóng)桿菌菌體；
[0022]步驟⑵中所述的接種緩沖液優(yōu)選包含如下組分=1mmol.L 1MgCl2,1mmol.L 1MES,500 μ mol.L 1AS ；
[0023]步驟⑵中所述的接種菌液I和II的OD6。。值優(yōu)選為0.9?1.1 ;
[0024]步驟(3)中所述的混合菌液的用量?jī)?yōu)選為0.6?ImL ；
[0025]步驟(3)中所述的紅麻植株優(yōu)選通過(guò)如下方法獲得:將播種后的紅麻種子置于26°C?28°C、16h光照/8h黑暗條件下培養(yǎng)，待紅麻植株長(zhǎng)至4?5葉期時(shí)用于接種；
[0026]步驟(3)中所述的紅麻植株繼續(xù)培養(yǎng)的條件優(yōu)選為26°C?28°C、16h光照/8h黑暗;
[0027]步驟(3)中所述的紅麻植株繼續(xù)培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為30?60天；
[0028]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0029]截止目前，國(guó)內(nèi)外僅林林等(2010)報(bào)道通過(guò)煙粉虱傳毒接種紅麻的方法，至今還未見(jiàn)有利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆人工注射接種方法接種紅麻的報(bào)道。主要原因有兩方面:一是構(gòu)建的CLCuMuV侵染性克隆對(duì)紅麻不具有侵染能力；二是人工接種紅麻的生育期選擇不正確；三是人工接種紅麻的接種部位選擇不正確。
[0030]本發(fā)明正是突破上述這三個(gè)技術(shù)瓶頸，構(gòu)建了對(duì)紅麻具有侵染性的CLCuMuV及其β 衛(wèi)星分子的侵染性克隆 pBinPLUS-1.85A 或 pGreen II 049-1.6A 及 pBinPLUS-2.0 β 或pGreen II 049-2.0 β ;通過(guò)人工注射接種方法，將侵染性克隆接種到4?5葉期的紅麻，實(shí)現(xiàn)CLCuMuV對(duì)紅麻的侵染，接種效率達(dá)到30% (比Briddon等用基因槍法接種棉花的效率高一倍以上)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法不需昂貴的儀器、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、效率較高，且不會(huì)出現(xiàn)其他病毒等交叉污染，適合于大規(guī)模樣品的處理。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆接種法接種紅麻的癥狀表現(xiàn)結(jié)果分析圖；其中，A:pBinPLUS-l.85A 和 pBinPLUS-2.0 β 混合接種(60d) ；B:pBinPLUS-l.85A 和pBinPLUS-2.0 β 混合接種(3Od) ;C:pBinPLUS_l.85Α 單獨(dú)接種(3Od) ；D:pBinPLUS-2.0 β單獨(dú)接種(30d) ;E:健康紅麻植株(對(duì)照)。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0033]實(shí)施例1
[0034]CLCuMuV及β衛(wèi)星分子侵染性克隆的構(gòu)建
[0035]CLCuMuV的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A、pBinPLUS-2.0 β (侵染廣東黃秋葵的雙生病毒分子特征及其侵染性克隆構(gòu)建，碩士論文，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010)由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所蔬菜病害研究室構(gòu)建。
[0036]以木爾坦棉花曲葉病毒廣東分離物基因組DNA(GenBank:FJ770370)為模板，用引物 OPAL:5’ -GGTACCTCCCAGATATATGCGCCAT-3’(引入 Kpn I 位點(diǎn))和 OPAR:5’ -GGTACCAAATCCCCTTTATTTCAAG-3’(含Kpn I位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得I倍全長(zhǎng)DNA-A，測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，選取序列本身帶有的Sal I酶切位點(diǎn)和引入Kpn I酶切，獲得0.85A，插入經(jīng)同樣酶切的植物表達(dá)載體pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-Ο.85A。然后用Kpn I酶切全長(zhǎng)1.0A，插入經(jīng)同樣酶切的pBinPLUS-Ο.85A，通過(guò)酶切篩選正向重復(fù)，獲得含有1.85個(gè)拷貝的正向重復(fù)全長(zhǎng)基因組的侵染性克隆pBinPLUS-Ι.85A。同樣以木爾坦棉花曲葉病毒廣東分離物基因組DNA(GenBank:FJ770371)為模板，以相鄰反向引物 β 05:5’-GAATTCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 EcoR I 位點(diǎn))和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3’ (引入 Kpn I 位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，將該克隆經(jīng)EcoR I和Kpn I酶切，插入經(jīng)同樣酶切的植物表達(dá)載體pBinPLUS，得到克隆pBinPLUS-L 0β。以相鄰反向引物β 01:5’-GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’ (引入 Kpn I 位點(diǎn))和 β 02:5’-GGTACCTACCCTCCCAGG GGTACAC-3?(引入Kpn I位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后，用Kpn I酶切β 01和β 02擴(kuò)增獲得的全長(zhǎng)及pBinPLUS-Ι.0 β，通過(guò)酶切篩選正向重復(fù)，獲得含有2.0個(gè)拷貝的正向