專利名稱：一種hiv侵染細胞的篩選系統(tǒng)及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種模擬HIV侵染細胞的細胞-細胞融合的藥物篩選系統(tǒng)，及其在篩選趨化因子CCR5和CXCR4拮抗劑中的應用。
(二)
背景技術：
fflV的包膜糖蛋白基因e打v在編碼成mRNA后，在Rev蛋白的作用下從被侵染的細胞核內(nèi)運輸至細胞質中，然后在糙面內(nèi)質網(wǎng)上合成前體蛋白gpl60;gpl60在其內(nèi)部gp41域上的信號肽引導下隨即進入內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)，并發(fā)生分子內(nèi)二硫鍵的形成，寡聚化，gpl20域部分高度的糖基化修飾；在從內(nèi)質網(wǎng)轉往高爾基#^的過程中，gpl60前體蛋白在宿主蛋白酶(fUrinor a forin-like enzyme )的作用下，發(fā)生切割，形成成熟的包膜糖蛋白gpl20和跨膜糖蛋白gp41復合體。包膜糖蛋白復合體以三聚體的形式通過gp41錨定在細胞膜上，gp41與gpl20之間通過非共價鍵連接。
fflV侵染細胞的第一步是gpl20識別被侵染細胞的人分化抗原4蛋白CD4。結合細胞的CD4蛋白后，gpl20的構象發(fā)生轉變，導致輔助受體CCR5或者CXCR4進一步結合上述復合體，使得gp41發(fā)生進一步的構象變化，引起gp41參與的fflV包膜與被侵染細胞的結合最終引起膜融合。
傳統(tǒng)的篩選CCR5拮抗劑方法是I125標記的配體結合測試法。但是最近的研究發(fā)現(xiàn)，配體結合測試法獲得CCR5潛在拮抗劑或者抗體在抗病毒作用分析方法獲得的結果成不相關性。由于HIV病毒對實-險操作者潛在的感染性，通過抗病毒侵染法大規(guī)模篩選HIV侵染抑制劑顯得不切實目前已經(jīng)有報道了多種模擬HIV病毒-細胞融合的替代檢測方法。大體上可以分為兩大類j艮fflV病毒-細胞融合測試法和細J包-細月包融合法。假HIV病毒-細胞融合測試法是通過弱化的HIV病毒或者其它帶有fflV包膜糖蛋白的病毒粒子作為融合載體。這種方法的缺陷在于每次分析需要準備新的病毒粒子，并且耗費很長的孵育時間。這使得難以運用于大規(guī)才莫篩選試驗。細胞-細胞融合測試法基于人類細胞在被fflV病毒侵染后能夠與未發(fā)生侵染的細胞發(fā)生融合，并且這種融合方式的機理類似與病毒侵染細胞的方式。運用不同的細胞系和融合4僉測方法，目前已經(jīng)有許多測試方法，這其中包括1、通過細胞膜和細胞核染色來觀察細胞-細胞間的融合，該方法冗長的操作步驟不適用于大規(guī)模藥物篩選試驗。2、通過細胞融合后轉錄激活信號基因的表達來檢測細胞的融合，該方法已經(jīng)有運用于大規(guī)模篩選試驗，但是由于通過信號蛋白轉錄激活需要耗費一定時間，因此篩選時間有待提高。
內(nèi)含肽(intein)是來自細菌的蛋白翻譯產(chǎn)物(前體蛋白)閱讀框架內(nèi)的一段氨基*列，它靠自我剪切的方式從前體蛋白中釋放出來，同時以肽鍵將兩端肽鏈相連形成成熟蛋白的方式介導蛋白質剪接(splicing)。1998年報道的來自藍藻S;v"ec/wc"泡sp. PCC6803的DnaE intein是一種內(nèi)含肽，其N端和C端剪接結構域的基因被750kb的基因組序列分開，蛋白翻譯產(chǎn)物仍可以通過內(nèi)含肽片段間的識別、重建完成外蛋白子(DnaEext-N和DnaEext-C )的剪接，最終形成完整的DanEext蛋白。DnaE'內(nèi)含肽同樣存在于另外些藍藻中。DnaE intein的剪接特性應用于蛋白環(huán)化、蛋白純化、蛋白片段同位素標記等，特別是應用于蛋白間的相互作用。將2個具有相互作用蛋白分別融合進DnaE intein的2個剪接片段，再直接與報告蛋白(如可發(fā)光4企測的熒光素酶、增強型綠色熒光蛋白等)的C端和N端相連。兩個蛋白相互作用導致內(nèi)含肽相互靠近進而折疊顯示出
6剪接活性,使兩個分別在不同載體表達的無活性報告蛋白片段恢復完整的蛋白活性而發(fā)光，通過光檢測而定量定性蛋白間相互作用。已報道用此方法來監(jiān)測線粒體釋放蛋白、核定位蛋白等。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應用細菌DnaE內(nèi)含肽的自我剪切功能以及HIV病毒包膜蛋白Env與人類CD4蛋白和CCR5或CXCR4趨化因子蛋白間相互作用可以誘導細胞融合的特點，提供了 一種可用于CCR5或CXCR4趨化因子介導的細胞融合檢測模型和拮抗HIV侵染細胞的藥物篩選模型。
本發(fā)明采用的技術方案是
一種HIV侵染細胞的篩選系統(tǒng)，包括趨化因子受體篩選細胞系和HIV包膜蛋白Env篩選細胞系，所述篩選系統(tǒng)由如下方法構建(l)將DnaE內(nèi)含肽基因(任意克隆的具有蛋白拼接功能的DnaE內(nèi)含肽都適用)的C端與報告基因的C端拼接(^^e-Oe/ toW-C),插入質粒1中獲得融合表達載體l;將DnaE內(nèi)含肽基因的N端與報告基因的N端拼接(wptoW-N-d加e -N),插入質粒1中獲得融合表達載體2; (2)將人CD4蛋白基因插入質粒2，獲得重組表達載體3;將人趨化因子CCR5基因ccr5或CXCR4基因cxcW插入質粒1,獲得重組表達載體4; ( 3 )將fflV-l不同的病毒抹Env基因HXB2-em;或SF162-gpM0基因插入質粒3,獲得重組表達載體5; (4)將載體1或載體2中的一個，與載體3和4共轉染至HEK293細胞或CHO細胞，獲得穩(wěn)定表達的趨化因子受體篩選細胞系；(5)將載體1或載體2中的另一個，與載體5共轉染至CHO細胞或HEK293細胞(步驟(4 )和步驟(5 ) —般使用不同的細胞，以防止使用相同細胞引起自身融合造成篩選拮抗劑時出現(xiàn)假陽性。但是如果同時做好對照的話，也是可行的(等于增加了一個步驟))，獲得穩(wěn)定表達的HIV包膜蛋白Env篩選細胞系；所述質粒l、質粒2、質粒3為常規(guī)的在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達蛋白的載體，質粒1、質粒2可選用pcDNA3.1(Invitrogen公司產(chǎn)品)，pTARGET ( Promega公司產(chǎn)品)等，二種載體可以相同也可以不同，質粒3可選用pSV7d或pCAGGS;所述才艮告基因為常規(guī)用于檢測的有活性的酶基因或可發(fā)光的蛋白基因，包括各種發(fā)光蛋白(例如GFP, YFP, CFP, BFP, RFP等)及其突變體，還包括7Jc母發(fā)光蛋白或克林霉素，以及各種熒光素酶、P-半乳糖苷酶、酪氨酸酶和其它許多種酶類等。把報告基因一分為二，即報告基因N端和報告基因C端，這二部分均失去酶的活性或焚光，只有經(jīng)內(nèi)含肽(intern)把^艮告蛋白N端和報告蛋白C端重新拼接成完整的蛋白，才恢復原有的酶活性或熒光。趨化因子受體篩選細胞系表達^7ae-C-^ptoW-C的重組載體時，HIV包膜蛋白Env篩選細胞系選擇含-N- -N的重組載體；反之亦然。
具體的，所述篩選系統(tǒng)由如下方法構建(1 )將DnaE內(nèi)含肽基因(核苦酸序列見SEQ ID NO. 1,氨基S1^列見SEQ ID NO.2 )的C端與報告基因的C端拼接，插入質粒pcDNA3.1中獲得融合表達載體1;將DnaE內(nèi)含肽基因的N端與報告基因的N端拼接，插M粒pcDNA3.1中獲得融合表達載體2; (2)將人CD4基因(核苷^列見SEQIDNO.15,氨基酸序列見SEQ ID N0.16)插入質粒pFLAG-CMVTM-3，獲得重組表達載體3;將人趨化因子CCR5 (核苷^列見SEQIDNO.U，氨基^列見SEQ ID NO.12 )或CXCR4 (核香酉L^列見SEQ ID N0.13,氨基酉^>列見SEQID'N0.14)基因插入質粒pcDNA3.1,獲得重組表達載體4; (3)取表達HXB2-e打v (核苷酸序列見SEQIDN0.19,氨基酸序列見SEQIDNO.20)或SF162-砂M0 (核苷酸序列見SEQ ID NCU7，氨基酸序列見SEQIDN0.18)基因的重組表達載體5，所述載體5可自行構建，也可由NIH AIDS Research and Reference Reagent Program提供；(4 )將載體1或
8載體2中的一個，與載體3和4共轉染至HEK293細胞或CHO細胞，獲得穩(wěn)定表達的趨化因子受體篩選細胞系；(5)將載體1或載體2的另一個，與載體5共轉染至CHO細胞或HEK293細胞，獲得穩(wěn)定表達的fflV包膜蛋白Env篩選細胞系。
當步驟(2 )重組表達載體4中插入的目的基因為人趨化因子基因ccr5時，步驟(3 )重組表達載體5中插入的目的基因為HIV-1病毒抹SF162的包膜蛋白基因SF162欲M0。
當步驟(2)重組表達載體4中插入的目的基因為人趨化因子基因cxc^時，步驟(3 )重組表達載體5中插入的目的基因為fflV-l病毒4朱HXB2的包膜蛋白基因HXB2-e"v。
優(yōu)選的，所述報告基因為下列之一①綠色熒光蛋白(EGFP)基因、②紅色熒光蛋白(DsRed)基因、③Renilla熒光素酶(及em'〃a luciferase)基因、 Firefly焚光素酶(Firefly luciferase )基因、⑤堿性磷酸酶(SEAP )基因、⑥Bete-內(nèi)酰胺酶(Beta-lactamase )基因、⑦半乳糖苷酶(P-Gal)基因。
優(yōu)選的，所述DnaE內(nèi)含肽基因來自藍J求藻Jwac"船mV/w/araR2 PCC7942或點狀念抹藻7Vostoc pw""z/onwe PCC73102。具體的DnaE內(nèi)含肽基因從藍球藻菌抹爿憩c"他m'血/am R2 (PCC7942)或點狀念林藻/ 朋cfz/orwe PCC73102基因組DNA中克隆DnaE內(nèi)含肽基因的N端(c/wae-N)和C端(<i"ae-C )。
本發(fā)明構建的細胞水平高通量篩選細胞系主要基于具蛋白自我剪接功能的DnaE intein以及異源表達的CCR5/CXCR4蛋白和CD4蛋白能與細胞內(nèi)表達的fflV包膜糖蛋白Env相互作用，模擬fflV侵染細胞時的細胞融合，其原理參見

圖1。由報告蛋白如氯霉素乙酰轉移酶(CAT)、熒光素酶(Luc)、堿性磷酸化酶(SEAP)、半乳糖苷酶(卩-Gal)和綠色熒光蛋白(GFP) —分為二成報告基因N端和報告基因C端，報告基因N端與具有蛋白剪接功能的^ae-N (DnaE內(nèi)含肽基因N端)融合表達；報告基因C端則與具有蛋白剪接功能的d朋e-C (DnaE內(nèi)含肽基因C端)融合表達。將兩個表達載體分別轉染含趨化因子的HEK293細胞或CHO細胞或者含HIV包膜蛋白Env的HEK293細胞或CHO細胞，并構建成穩(wěn)定表達細胞抹。當兩株穩(wěn)定細胞混合培養(yǎng)時，細胞發(fā)生融合，從而促使DnaE-C和DnaE-N能夠相互接觸作用，而由DnaE-N和DnaE-C共同作用把報告蛋白N端和報告蛋白C端連接成一個完整的報告蛋白，最后通過檢測報告蛋白活性便可知細胞的融合程度。
本發(fā)明構建的篩選細胞系是利用HIV病毒包膜蛋白Env與人類分化抗原CD4蛋白和CCR5或CXCR4趨化因子蛋白間相互作用可以誘導細胞融合的原理，與所選用的細胞系來源無關，不受報告基因類型的影響。
在趨化因子受體篩選細胞系中，趨化因子和CD4蛋白在細胞膜上過量表達；報告基因和DnaE內(nèi)含肽的融合片段則在細胞質內(nèi)高效表達，并且報告基因沒有任何活性。fflV包裝糖蛋白Env基因篩選細胞系中，env基因在轉錄翻譯成前體蛋白gpl60后，在高爾基上經(jīng)過切割，形成糖蛋白gpl20和gp41 ，并錨定在細胞膜上。報告蛋白和DnaE的融合片段則在細胞質內(nèi)高效表達，但不具任何活性。當趨化因子受體篩選細胞系和fflV包裝糖蛋白Env基因篩選細胞系混合培養(yǎng)時，gpl20與CD4蛋白和趨化因子相互作用，發(fā)生構象的改變，促使gp41作用于趨化因子受體篩選細胞系，引起細胞融合。'細胞融合后，分別位于不同細胞系間的報告蛋白與DnaE兩個互補融合片斷發(fā)生充分的隨機碰撞，DnaE內(nèi)含肽發(fā)生自我剪接，，使得報告蛋白發(fā)生拼接恢復完整活性。通it^目應的檢測工具，就可以檢測到報告蛋白的活化程度，從而用來確定細胞的融合比例。
本發(fā)明還涉及所述的篩選系統(tǒng)在高通量篩選CCR5或CXCR4拮抗劑中的應用。
具體的，所述應用為將趨化因子受體篩選細胞系細胞和fflV包膜 蛋白Env篩選細胞系細胞加入添加有待篩選藥物的常規(guī)適用于CHO細胞 或HEK293細胞的培養(yǎng)基(如DMEM培養(yǎng)基、DMEM/F12 1:1培養(yǎng)基、 IMDM培養(yǎng)基等)中，混合培養(yǎng)4 8小時，培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)洗滌、細胞裂解， 加入與l艮告蛋白相對應的反應底物(如果是i^"z7/a luciferase 4艮告蛋白， 用 promega .公司的 i em'〃a luciferase assay systerm ; 反應底物是 coelenterazine及其書亍生物；如果是刀rey7少luciferase凈艮告基因的話，用的 是D-luciferin),獲得待測藥物活性數(shù)據(jù)。如報告基因為可發(fā)光的蛋白基 因，則只需檢測熒光強度，可獲得測藥物活性數(shù)據(jù)。
如通過啟動子，反式作用轉錄因子(Tat， T 7 polymerase )構建的才艮 告基因篩選模型，細胞發(fā)生融合后要通過一 系列信號轉導，才能引起報告 基因表達，所以需要孵育的時間數(shù)小時，長的要8小時之久。而本發(fā)明要 構建的篩選模型是利用DnaE intein的自我剪接功能，將已經(jīng)表達的蛋白 片斷連接成完整功能的報告蛋白，所以在細胞發(fā)生融合的數(shù)分鐘到半小時 就能檢測到報告蛋白的活性。
將具拼接功能的內(nèi)含肽使沒有活性的報告基因兩部分合而為有活性 的酶或發(fā)光蛋白用以研究細胞內(nèi)蛋白間的作用機理是一種有效靈活的方 法，本發(fā)明將這種使用方法應用于檢測利用HIV膜蛋白與人體細胞表面 蛋白建立的細胞-細胞間的相互作用，將使之成為發(fā)現(xiàn)或篩選預防和治療 艾滋病藥物的重要研究工具。這種方法可以直接檢測分子間的相互作用， 而不必通過次級反應，如轉錄活性；不必要用大分子標記蛋白，如完整的 熒光蛋白；更不需要對細胞進行染色。這種方法可使用多種報告蛋白，能 為任何儀器平臺、自動搡作系統(tǒng)、細胞類型和需要的試驗方案特定設計。 根據(jù)報告蛋白的選擇，可以構建高通量檢測系統(tǒng)。在高通量檢測系統(tǒng)中，
ii可以通過標準熒光全自動定量繪圖酶標儀定量檢測流式細胞，多孔板或微 量滴定板。這種方法能夠高通量篩選與趨化因子受體的作用的HIV藥物，
也可以高通量篩選能與HIV的Env基因編碼的gpl20或者gp41作用的藥 物，最后決定是否有合適的藥物能夠拮抗細胞-細胞融合作用。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了 一種細胞水平高通量篩選系 統(tǒng)，檢測耗時短，操作簡便。
(四) 附圖il明
圖l為本發(fā)明建模原理圖2為實施例中構建的載體結構示意圖；A:重組表達載體pCDNA-ccr5; B:重組載體pCMV-flag-cd4; C:質粒pCAGGS- SF162 -gpl60; D:融 合表達載體pCDNA -rluc-N-dnae-N; E:融合表達載體pCDNA-dnae-C-rluc-C;
圖3為實施例中運用本發(fā)明篩選一批CCR5拮抗劑所得的炎光值示意圖； m:添加濃度為30nM的maraviroc, TAK:添加1 jaM的TAK-779, T-20: 添加1 ji g/ml的T-20， ck:陽性對照；
圖4為不同濃度的CCR5拮抗劑mamviroc對由CCR5介導的細胞融合的 抑制作用。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述,但本發(fā)明的保護范圍
并不僅限于此:
實施例1:
(1)從藍球藻菌抹」"ac"^剛Ww/aw R2 (PCC7942 )基因組DNA中克 隆DnaE內(nèi)含肽基因的N端(dnae-N)和C端(dnae-C); AAA巨 噬細胞基因組中克隆CCR5基因(核苷酸序列見SEQIDNO.ll，氨
12基酉拼列見SEQ ID N0.12), CD4基因(核香^/f列見SEQ ID N0.15,氨基^Jf列見SEQIDN0.16);
(2)將爿"^y幼's m'(iw/ara R2 dnae-C (1-36 aa,核苦^Jf列見SEQ ID NO.9,氨基酸序列見SEQ ID NO.10)與i em7/a熒光素酶基因C 端(rluc-C, lll-311aa,核苷酸序列見SEQ ID NO.5,氨基酸序列 見SEQ ID NO.6 )通過overlap PCR將dnae-C與rluc-C拼4妄起來， 在dnae-C與rluc-C之間加入CFNGT 5個氨基酸序列；將i em%2熒 光素酶基因N端(rluc-N, l-110aa,核苷酸序列見SEQ ID NO.3, 氨基酸序列見SEQ ID NO.4)與j船cjvto m^w/<ms R2 dnae-N (37-152aa，核苷S交序列見SEQ ID NO.7,氨基酸序列見SEQ ID NO.8 )通過overlap PCR將rluc-N與dnae-N 4并接起來，在rluc-N 與dnae-N之間加入GS兩個氨基酸序列；
(3 )將上述構建的dnae-C與rluc-C及rluc-N與dnae-N，趨化因子受體 基因ccr5分別插入到質粒pcDNA3.1中，便可獲得融合表達載體I : pCDNA-dnae-C畫rluc-C (圖2-E )和融合表達載體II: pCDNA -rluc-N-dnae-N (圖2-D ),重組表達載體pCDNA-ccr5 (圖2-A); 將CD4基因插入到表達載體pCMV-flag ( pFLAG-CMVTM-3 EXPRESSION VECTOR sigma 7>司產(chǎn)品)中獲得重組載體 pCMV-flag-cd4 (圖2國B );從NIH AIDS Research and Reference Reagent Program免費獲取質粒pCAGGS畫SF162 -gpl60 (圖2隱C );
(4 ) HEK293 細胞以3xl05密度傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中'，在含10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37°C, 5。/。C02環(huán)境培養(yǎng)。第二天用磷 酸鈣轉染試劑(invitrogen公司產(chǎn)品)共轉染質粒pCDNA-dnae畫 C-rluc-C， pCDNA-ccr5, pCMV-flag-cd4,轉染后繼續(xù)培養(yǎng)12小時。 CHO細胞以3xl05密度傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中，在含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，37°C, 5%C02環(huán)境培養(yǎng)。第二天用 Lipofectamine 2000 (invitrogen ^>司)共轉染質粒pCAGGS國SF162 -gpl60， pCDNA-rluc-N-dnae-N，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)12小時。
(5 )將轉染后的HEK293細胞和CHO細胞在96孔板中混合培養(yǎng)4小時， 混合前培養(yǎng)基(需具體)中加入待篩選的細胞融合拮抗藥物。
(6 )吸去上述培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS洗兩次，再用i ew/〃a Luciferase Assay System (Promega公司產(chǎn)品)裂解液裂解細胞，4安試劑盒要 求進行加入反應底物(codenterazine)，用化學發(fā)光4全測儀FBI2 luminometer( Berthold乂>司產(chǎn)品)測定熒光強度(延時Is, 4企測2s), 結果如圖3所示，由圖中可知濃度為30nM的mamviroc(CAS登 錄號376348-65-1 ), 1 ji M的TAK-779( CAS登錄號229005-80-5 ) 和1 m g/ml的T-20 (商品名Fuzeon,化學名entuvirtide )對ccr5 介導的細胞融合均有明顯的抑制作用。不同濃度的CCR5拮抗劑 maraviroc對由CCR5介導的細胞融合的抑制作用結果見圖4，從圖 中可以看出，maraviroc濃度越大，其對CCR5介導的細胞融合的抑 制作用越強。
結論CCR5 、 CXCR4趨化因子受體是研制抗HIV藥物的重要靶位， 本發(fā)明篩選系統(tǒng)可以筒單、快速的用來高通量篩選CCR5或CXCR4拮抗 劑，為高效篩選抗HIV新型藥物提供了一條有效途徑。SEQUENCE LISTING
<110>浙江大學
<120〉 一種HIV侵染細胞的篩選系統(tǒng)及其應用
<130〉
<160> 20
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 936
<212〉 腿
<213> Renilla reniformis
<400> 1
atgacttcgaaagtttatgatccagaacaa3gga幼cgg8tgeit幼ctggtccgcagtgg60
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tcgttcgttgagcgsgttctcaaaaatgaa936
<210> 2
<211> 311
<212> PRT
<213> Renilla reniformis
<400> 2
Met Thr Ser 1
Gly Pro Gin
Lys
Trp 20
Phe lie Asn 35
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Met Gly Lys Ser
Phe Leu His 50
Pro His lie 65
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Trp Tyr Asn Pro
Gly 85
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Pro Cys
Glu 40
Ala Ala 55
Ser Arg Lys Ser Gly
Val Ala 70
Glu
Lys 25
Lys Ser Cys Asn
Gin 10
Gin His Tyr lie
Gly 90
Arg Met Ala Leu
lie 75
Ser
1-ys
Asn
Glu
Trp 60
Pro Tyr
Arg
Val
Asn 45
Arg Asp Arg
Met
Leu 30
Ala His Leu Leu
lie 15
Asp Val Val lie
Leu 95
Thr Ser lie Val
Gly 80
AspHis Tyr
Lys lie
Tyr Ser 130
Ser Val 145
Glu Asp
Glu Asn
Lys Leu
Lys Gly 210
Leu Val 225
Asn Ala Ser Asp Phe Pro
Glu Asp 290
Arg Val 305
Lys
lie 115
Tyr
Val
lie
Asn
Glu 195
Glu
Lys
Tyr
Pro
Asn 275
Ala Leu
Tyr Leu Thr 100
Phe Val Gly
Glu His Gin
Asp Val lie 150
Ala Leu lie 165
Phe Phe Val 180
Pro Glu Glu
Val Arg Arg
Gly Gly Lys 230
Leu Arg Ala 245
Gly Phe Phe 260
Thr Glu Phe Pro Asp Glu
Ala Trp
His Asp 120
Asp Lys 135
Glu Ser
Lys Ser
Glu Thr
Phe Ala 200
Pro Thr 215
Pro Asp Ser Asp Ser Asn
Phe 105
Trp
lie
Trp
Glu
Met 185
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Val Lys 280
Ala 265
Val
Glu
Gly
Lys
Asp
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Leu
Tyr
Ser
Val
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Leu Leu
Ala Cys
Ala lie 140
Glu Trp 155
Gly Glu
Pro Ser
Leu Glu
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Gin lie 235
Pro Lys Val Glu Gly Leu
Asn
Leu 125
Val
Pro
匕ys
Lys
Pro 205
Arg Val Met Gly
Met Gly Lys Tyr lie Lys 295 300
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His
Asp
Met
lie 190
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Glu
Arg
Phe
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Phe Phe
Pro
Phe
Ala
lie
Val 175
Met
tys
lie
Asn
lie 255
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Lys
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Glu Lys Gin Glu
Lys Asn Glu 310
Gin
<210〉 3
<211> 333
<212〉 DNA
<213> Renilla reniformis
<400> 3
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tgggccagatgaatgttcttgattcattta tt犯ttattatgattcagaa120
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<21'0〉 4
<211〉 110
<212> PRT
<213〉 Renilla reniformis
<400〉 4
Met Thr Ser Lys Val Tyr Asp 1 5
Gly Pro 'Gln Trp Trp Ala Arg 20
Phe lie Asn Tyr Tyr Asp Ser 35
Pro Glu Gin Arg Lys Arg Met lie Thr 10 15
Cys Lys Gin Met Asn Val Leu Asp Ser 25 30
Glu Lys His Ala Glu Asn Ala Val lie 40 45Phe Leu His Gly Asn Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 50 55
Pro His lie Glu Pro Val Ala Arg Cys lie lie 65 70 75
Met Gly Lys Ser Gly Lys Ser Gly Asn Gly Ser 85 90
His Tyr Lys Tyr Leu Thr Ala Trp Phe Glu Leu 100 105
<210〉 5 〈211〉 603 <212> DNA
<213> Renilla reniformis <400〉 5
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Pro Asp Leu lie Gly 80
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<213〉 Renilla reniformis
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Phe
Ala
lie
Val 65
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Glu
Glu 50
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Tyr 130
Tyr
Ser 35
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Leu 115
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lie
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Asp
Asn
Leu
Gly 100
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lie 5
Tyr
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lie
Asn
Glu 85
Glu Lys Tyr
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Glu
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Ala
Phe 70
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Val
Leu 55
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Gly
Gin
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Lys 120
Ala
His
Asp 25
Glu
Lys
Glu
Phe
Pro 105
Pro Ser
Asp 10
Lys
Ser
Ser
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Ala 90
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Trp
lie
Trp
Glu
Met 75
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Gly
Lys
Asp
Glu 60
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Leu 140
Ala
Ala
Glu 45
Gly Pro Leu Trp
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Cys
lie 30
Trp
Glu
Ser
Glu
Pro 110
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Leu 15
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Pro
Lys
Lys
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17lie Glu Ser Asp Pro Gly Phe Phe Ser Asn Ala lie Val Glu Gly Ala
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Val Glu Arg Val Leu Lys Asn Glu Gin 195 200
160
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<210〉 7 <211> 351 <212> DNA <213> Anacystis nidulajis
<400〉 7 gccgaatattgtttggcggcagatacagaagttctgaccgttgaat8tgg cccgatcgcg60
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<210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Anacystis nidulans
<400〉 8
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153tg犯CCggggagtcccttttaggcacttgcttctggtgctgc幼ctggcgctcctccca60gcagccactcagggaaag犯agtggtgctgggcaaaaaaggggatacagtgg犯ctgacc120tgtacagcttcccagaagaagagcatacaattccactggaaaaactccaaccag3ta犯g180attctgggap—cttcttaact犯EiggtccatccaBgctgaatgatcgcgct240gactcaagaagaagcctttgggaccaaggaaactttcccctgatcatc幼g犯tcttaag300atagaagactcagatacttacatctgtgaagtggaggaccagaaggaggaggtgcaattg360ctagtgttcggattgactgccaactctgacacccacctgcUceiggggcagagcctgacc420ctgaccttggagagcccccctggtagtagcccctcagtgcaatgtaggagtcc卿gggt■aaaaacatacagggggggaagaccctctccgtgtctcagctggagctccagg3t3gtggC540acctggacatgcactgtcttgcag犯ccagaag幼ggtgg3gttC犯肪tagacatcgtg600gtgctagctttccagaaggcctccagcstagtctataagaaagsggggga8c鄉(xiāng)tggag660ttctccttcccactcgccttt3C3gttgaaaagctgacgggcagtggcgagctgtggtgg720caggcggagagggcttcctcctccaagtcttggatcacctttgacctg犯gaacaaggaa780gtgtctgtaaaacgggttEicccaggaccctaagctccagatgggc卿aagctcccgctc840cacctcaccctgccccaggccttgcctcagtatgctggctCtgg犯3CCtcaccctggcc900cttgaagcgagttgcatcaggaagtgaacctggtggtgatgagagcca^ct960C3gctccsgaaa肪tttgacctgtgaggtgtggggacccacctcccctaagctgatgctg1020agtttgaaactggag肪ceiaggaggcaaaggtctcgaagcgggag幼ggcggtgtgggtg1080ctgaaccctgaggcggggatgtggcagtgtctgctgagtgactcgggacaggtcctgctg1140gaatccaacatcaaggttctgcccacatggtccaccccggtgcagccaatggccctgatt1200gtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttctgtgtc1260aggtgccggcaccgaaggcgccaagcagagcggatgtctc3gatc犯gagactcctcagt132022gagaagaaga 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<210〉 17
<211> 2544
<212> DNA
<213> Hu邁an astrovirus
<400〉 17
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cgcttg卿gacttaatcttgattgcagcg aggattgtgg aacttctggg acgcaggggg2340
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<210> 18
<211> 847
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<213> H咖an astrovirus
<400> 18
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Gly Thr Leu Leu Leu Gly 20
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His Cys Thr Asn Leu Lys 130
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Arg Lys Asn Tyr Gin His 10
Met Leu Met lie Cys Ser 25
Tyr Gly Vsl Pro VbI Trp 40
Ser Asp Ala Lys Ala Tyr 55 60
His Ala Cys Val Pro Thr 75
Asn Val Thr Glu Asn Phe 90
Met His Glu Asp lie lie 105
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Leu Trp Arg Gly 15
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Lys Glu Ala Thr 45
Asp Thr Glu Val
Asp Pro Asn Pro 80
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Cys Val Thr Leu 125
Asn Ala Thr Asn Thr Lys Ser Ser Asn Trp 135 140
Glu lie Lys Asn Cys Ser Phe Lys Val Thr
25145
Thr Ser
Leu Asp
Asn Cys
Glu Pro 210
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Leu Leu
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Ser Val 290
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Gly Asp
Asn Thr
Lys Thr
Met His 370
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Gly Lys 450
Asp Met 465
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lie
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Asn 195
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Leu
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Glu
Cys 435
Glu Arg Glu Arg
Gly 515
Gin Asn Leu Leu
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Pro
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Asn 165
Pro
Ser
lie
Lys
Cys 245
Gly
Asp
Asn
Pro
Gin 325
Gin
Phe
Asn
Ser
Thr 405
Gly
Ser
Ser
Asn
Leu 485
Lys Ala Arg Ala
150 Lys
lie
Val
His
Lys 230
Thr
Ser
Asn
Cys
Gly 310
Ala
lie
Lys
Cys
Thr 390
Leu
Lys
Asn
Asn
Trp 470
Gly Arg Gly Gin lie
Met
Asp
lie
Tyr 215
Phe
His
Leu
Ala
Thr 295
Arg
His
Val
Gin
Gly 375
Trp
Pro
Ala
lie
Thr 455
Arg Val Ala Ser
Leu 535
Glu
Gin
Asn
Thr 200
Cys
Asn
Gly
Ala
Lys 280
Arg
Ala
Cys
Thr
Ser 360
Gly
Asn
Cys
Met
Thr 440
Thr
Ser
Ala
Val
Thr 520
Leu Ala
Lys
Asp 185
Gin
Ala
Gly
lie
Glu 265
Thr
Pro
Phe
Asn
Lys 345
Ser
Glu
Asn
Arg
Tyr 425
Gly
Glu
Glu
Pro
Thr 505
Met Ser Gin
Glu 170
Asn
Ala
Pro
Ser
Arg 250
Glu
lie
Asn
Tyr
lie 330
Leu
Phe
Thr
lie 410
Ala
teu
lie
Leu
Thr 490
Leu Gly Gly Gin
155 Tyr
Thr
Cys
Ala
Gly 235
Pro
Gly
lie
Asn
Ala 315
Ser
Gin
Gly
Phe
lie 395
Lys
Pro
Leu
Phe
Tyr 475
Lys Gly Ala lie His
Ala Leu
Ser Tyr
Pro Lys 205
Gly Phe 220
Pro Cys Val Val
Val
Val
Asn 300
Thr
Gly
Ala
Asp
Tyr 380
Gly
Gin
Pro
Leu
Arg 460
Lys Ala Ala Ala
Val 540
Leu
Val
Gin 285
Thr
Gly
Glu
Gin
Pro 365
Cys
Pro
lie
lie
Thr 445
Pro
Tyr
Lys
Met
Ser 525
Gin Leu
Phe
Lys 190
Val
Ala
Thr
Ser
lie 270
Leu
Arg
Asp
Lys
Phe 350
Glu
Asn
Asn
lie
Arg 430
Arg
Gly
Lys
Arg
Phe 510
Leu Gin Gin
160
Tyr Lys 175
Leu lie
Ser Phe
lie Leu
Asn Val 240
Thr Gin 255
Arg Ser Lys Glu
Lys
lie
Trp 335
Gly
lie
Ser
Asn
Asn 415
Gly
Asp
Gly
Val
Arg 艦
Leu Thr Gin Leu
Ser
lie 320
Asn
Asn
Val
Thr
Thr 400
Arg
Gin
Gly
Gly
Val 480
Val Gly Leu Asn Thr545 Val
Tyr
Leu
Ser
Glu 625
Gin
Trp
lie
Val
Pro 705
Pro
Ser
Ser
Ala
Lys 785
Ser Thr His
Trp
Leu
lie
Leu 610
lie
Asn
Ala
Lys
Phe 690
Leu
Glu
Pro
Leu
Ala 770
Tyr Ala Asp lie
Gly
Lys
Cys 595
Asp
Asp
Gin
Ser
lie 675
Thr
Ser
Gly
Leu
Cys 755
Arg Trp Val Arg
Pro 835
lie
Asp 580
Thr
Gin
Asn
Gin
leu 660
Phe
Val
Phe
lie
Val 740
Lou lie Gly Ser
lie 820
Arg
Lys 565
Gin
Thr
lie
Tyr
Glu 645
Trp
lie
Leu
Gin
Glu 725
His
Val
Asn
Leu 805
lie Arg
550
Gin Leu Gin Als
Gin Leu
Ala Val
Trp Asn 615
Thr Asn 630
Lys Asn
Asn Trp
Met lie
Ser lie 695
Thr Arg 710
Glu Glu
Gly Leu
Ser Tyr
Glu Leu 775
Leu Leu 790
Phe Asp Glu Val lie Arg
Leu
Pro 600
Asn
Leu
Glu
Phe
Val 680
Val
Phe
Gly
Leu
His 760
Leu Gin Ala Ala
Gly 585
Trp
Met
lie
Gin
Asp 665
Gly
Asn
Pro
Gly
Ala 745
Arg Gly Tyr lie
Gin 840
Gin 825
Gly
Arg 570
lie
Asn
Thr
Tyr
Glu 650
lie
Gly
Arg
Ala
Glu 730
Leu
Leu
Arg
Trp
Ala 810
Arg Phe
555
Val Leu Ala Val
Trp Gly
Ala Ser
Trp Met 620
Thr Leu 635
Leu Leu
Ser Lys
Leu Val
V3I Arg 700
Pro Arg 715
Arg Asp
lie Trp
Arg Asp
Arg Gly 780
lie Gin 795
lie Ala lie Gly Glu Arg
Cys
Trp 605
Glu
lie
Glu
Trp
Gly 685
Gin
Gly
Arg
Asp
Leu 765
Trp Glu Val Arg
Ser 590
Ser
Trp
Glu
Leu
Leu 670
Leu
Gly
Pro
Asp
Asp 750
lie Glu Leu Ala
Ala 845
Ala 830
Leu
Glu 575
Gly
Asn
Glu
Glu
Asp 655
Trp
Arg
Tyr
Asp
Arg 735
Leu
Leu
Ala
Lys
Glu 815
Phe Leu
560 Arg
Lys
Lys
Arg
Ser 640
Lys
Tyr
lie
Ser
Arg 720
Ser
Arg
lie
Leu
Asn 800
Gly Leu
<210> 19
<2ll> 2571
<212〉 DNA
<213> Human astrovirus
<400> 19
atgagagtgatcagcacttgtggagatgggggtgg卿tggggcsccatg60
ctccttgggatgttgatgatctgtagtgctacagaa肪attgtgggtcacagtctattat120
ggggtacctgtgtggaaggaagC幼CC3CCactctattttgtgcatcagatgct貼8gca180
tatgatacagaggtacataatgtttgggccacacatgcctgtgtacccaca^gacccc38C240
ccacaag幼gtagtattggtaaatgtgacagaaaattttaacatgtggaaaaatgacatg300
gtag朋cagatgcatgaggatataatcagtttatgggatca幼gcct犯agccatgtgta360
a犯ttaaccccactctgtgttagttta犯gtgcactgatttgaagaatgatactaatacc420aatagtagtagcggg卿8tgataatggagaaaggagag3ctctttcaat480
3tcagcac犯gc由柳ggtaaggtgcag3犯gaatatgcatttttttataaacttgat540
ataataccaatagataatgatactaccagctataagttgacasLgttgteiacacctcagtc600
3"tt3C3Caggcctgtcca犯ggtatcctttgagccaattcccatacattattgtgccccg660
gctggttttgCg3ttCt8肪3￡iga_cgttc3atgg犯caggaccatgtaca720
aatgtcagcacagtacaatgtacacatggaattaggccagtagtatcaactcaactgctg780
tta犯tggcagtctagcagagtEiattagatctgtcaatttcacggacaat840
gctaaaaccagctgaacac3tctgtagaaattaattgtacaagaccc犯c■
ccgtatccagagaggaccaggg卿gcatttgttacaat8960
ggaaaastaggaaatatgag3caagcacattgtaacattagtagagcaaaatggaataac1020
ac 111 aaaacag自gctagcaaattaagag犯caatttgaacaataatc1080
tttaagcaatcctcaggsggggaccc3g肪attgtaacgcacagttttaattgtggaggg1140
gaa/tttttctactgtaattcaacacaactgtttaatagtacttggtttaatagtacttgg1200
3gtactgaagggtca犯taacactgaaggsagtgacac肪tcaccctcccatgcag幼ta1260
aaacaaattataaacatgtggcaga犯gtaggaaaagcaatgtatgcccctcccatcagt1320
ggacaaattagatgttcatcgggctgctattaac幼g站Eitggtggt犯t1380
agcaacaatgagtccgagstcttcagacctggaggagg8gcaattggaget1440
agtgaattat3taaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaag1500
gcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtggtttgttcctt1560
gggttcttgggagcagcsggaagcactatgggcgcagcctcaatgacgctgacggtacag1620
gccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatUgctgagggctattgag1680
gcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatc1740
ctggctgtgga朋gatacct犯aggatc肌cagctcctggggatttggggttgctctgga1800
犯actcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggsgtaataaatctctggaa1860
cagatttggaatcacacgacctggatggagtgggac卿gttacacaagc1920
ttastacactcctt犯ttgaagaatcgc朋aaccagc肪g2LC肌g犯tt31980
ttggaattag3t幼atgggcEiagmgtggaattggtttaUggctgtgg2040
tatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtsggttta3g幼tagtttttgct2100
gtactttctatagtgaatagagUaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccac2160
ctccc犯ccccg躬gggacccgacaggcccgaaggaatagaag犯g卿gtggagagaga2220
g3C3gaig3C3gatccattcgattagtgaacggstccttggcacttatctgggacgatctg2280
cggagcctgtgcctcttcagctaccaccgcttgag卿cttactcttgattgtaacgagg2340
attgtggaacttctgggscgcagggggtgggaagccctcaaatattggtggaatctccta2400
cagtattggagtcaggaactaaagastagtgctgttagcttgctcaatgccacagccata2460
gcagtagctgaggggacagatagggttatagaagtagtac肪ggeigcttgtagagctatt2520
cgccacatacctag幼gaata卿c3gggcttgga卿gsttttgctataa2571
<210> 20<211> 856<212> PRT
<213> Human astrovirus<400> 20
Met Arg Val Lys Glu Lys1 5
Trp Gly Thr Met Leu Leu20
Lys Leu Trp Vsl Thr Val35
Thr Thr Thr Leu Phe Cys50
Val His Asn Val Trp Ala65 70-
Pro Gin Glu Val Val Leu85
Lys Asn Asp Met Val Glu100
Asp Gin Ser Leu Lys Pro115
Leu Lys Cys Thr Asp Leu130
Gly Arg Met lie Met GluM5 150
lie Ser Thr Ser lie Arg165
Tyr Lys Leu Asp lie lie180
Leu Thr Ser Cys Asn Thr195
Ser Phe Glu Pro lie Pro210
lie Leu Lys Cys Asn Asn225 230
Asn Val Ser Thr Val Gin245
Thr Gin Leu Leu Leu Asn260
Arg Ser Val Asn Phe Thr275
Asn Thr Ser Val Glu lie290 '
Lys Arg lie Arg Ie Gin305 310
Gly Lys lie Gly Asn Met325
Lys Trp Asn Asn Thr Leu340
Phe Gly Asn Asn Lys Thr355
Pro Glu lie Val Thr His
Tyr Gin His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg10 15
Gly Met Leu Met lie Cys Ser Ala Thr Glu25 30
Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala40 45
Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu55 60
Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn75 80
Val Asn Val Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp90 95
Gin Met His Glu Asp lie lie Ser Leu Trp105 110
Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser120 125
Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser Ser Ser135 140
Lys Gly Glu lie Lys Asn Cys Ser Phe Asn155 160
Gly Lys Val Gin Lys Glu Tyr Ala Phe Phe170 175
Pro HAsp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Lys185 190
Ser Val lie Thr Gin Ala Cys Pro Lys Val200 205
lie His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala215 220
Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr235 240
Cys Thr His Gly lie Arg Pro Val Val Ser250 255
Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val lie265 270
Asp Asn Ala Lys Thr lie lie Val Gin Leu280 285
Asn Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg295 300
Arg Gly Pro Gly Arg Aa Phe Val Thr lie315 320
Arg Gin Ala His Cys Asn lie Ser Arg Ala330 335
Lys Gin lie Ala Ser Lys Leu Arg Glu Gin345 350
lie lie Phe Lys Gin Ser Ser Gly Gly Asp360 365
Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe Phe TyrCys385
Ser
Pro
Ala
lie
Ser465
Ser
Ala
Val
Thr
Leu545
Ala
Glr,
Leu
Pro
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Leu
Glu
Phe
Val
Val705
LeuGlyLeuHis
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Thr
Cys
Met
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Glu
Glu
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Ala
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Leu
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Arg740
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Leu
Arg
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Ala
Ala
Ala
Val
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Leu
Gly
Ser
Met
Leu645
Leu
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Arg725
AspTrpAsp
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Leu
Pro470
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Ala
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Gly
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Lys
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Gin
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Ala700
SerGlyLeuCysArg
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Thr605
Gin
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Gin
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Phe685
ValPhelieVal
Leu765
lie
Ser
lie
Val430
Ser
Asn
Asn
Leu
Lys510
Ala
Arg
Ala
Lys
Gin590
Thr
lie
Tyr
Glu
Trp670
lie
Leu
Gin
Glu
Asn750
PheVal
Thr
Thr415
Gly
Ser
Asn
Trp
Gly495
Arg
Gly
Gin
lie
Gin575
Gin
Ala
Trp
Thr
Lys655
Asn
Met
Ser
Thr
Glu735
GlySerGlu
Trp400
Leu
Lys
Asn
Glu
Arg480
Val
Ala
Ser
Leu
Glu560
Leu
Val
Asn
Ser640
Asn
Trp
lie
lie
His720
GluSerTyrLeu
30770 775 780
Leu 785GlyArgArgGlyTrp 790GluAlaLeuLys丁yr 795TrpTrpAsnLeuLeu 800
GinTyrTrpSerGin 805GluLeuLysAsnSer 810AlaValSerLeuLeu 815Asn
AlaThrAlalie 820AlaValAlaGluGly 825ThrAspArgVallie 830GluVal
ValGinGly 835AlaCysArgAlalie 840ArgHislieProArg 845ArglieArg
GinGlyLeuGluArglieLeuLeu
850 85權利要求
1.一種HIV侵染細胞的篩選系統(tǒng)，包括趨化因子受體篩選細胞系和HIV包膜蛋白Env篩選細胞系，所述篩選系統(tǒng)由如下方法構建(1)將DnaE內(nèi)含肽基因的C端與報告基因的C端拼接，插入質粒1中獲得融合表達載體1；將DnaE內(nèi)含肽基因的N端與報告基因的N端拼接，插入質粒1中獲得融合表達載體2；(2)將人CD4蛋白基因插入質粒2，獲得重組表達載體3；將人趨化因子CCR5基因或CXCR4基因插入質粒1，獲得重組表達載體4；(3)將HIV-1病毒株Env基因HXB2-env或SF162-gp160基因插入質粒3，獲得重組表達載體5；(4)將載體1或載體2中的一個，與載體3和載體4共轉染至HEK293細胞或CHO細胞，獲得穩(wěn)定表達的趨化因子受體篩選細胞系；(5)將載體1或載體2中的另一個，與載體5共轉染至CHO細胞或HEK293細胞，獲得穩(wěn)定表達的HIV包膜蛋白Env篩選細胞系；所述報告基因為用于檢測的有活性的酶基因或可發(fā)光的蛋白基因，所述的報告基因的C端與報告基因的N端拼接即為報告基因，所述質粒1、質粒2、質粒3為在哺乳動物細胞內(nèi)高效表達蛋白的載體。
2. 如權利要求1所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于所述篩選系統(tǒng)由如下方法 構建(1)將DnaE內(nèi)含肽基因的C端與才艮告蛋白基因的C端拼接， 插入質粒pcDNA3.1中獲得融合表達載體1;將DnaE內(nèi)含肽基因的N 端與報告蛋白基因的N端拼接，插入質粒pcDNA3.1中獲得融合表達 載體2; (2 )將人CD4基因插入質粒pFLAG-CMVTM-3,獲得重組表達 載體3;將人趨化因子CCR5或CXCR4基因插入質粒pcDNA3.1，獲得重組表達載體4;(3 )取fflV包膜蛋白基因HXB2-env插入質粒pSV7d 或SF162-gp160基因插入質粒pCAGGS,獲得重組表達載體5; (4 )將 載體1或載體2中的一個，與載體3和4共轉染至HEK293細胞或CHO 細胞，獲得穩(wěn)定表達的趨化因子受體篩選細胞系；(5)將載體1或載 體2中的另 一個，與載體5共轉染至CHO細胞或HEK293細胞，獲得 穩(wěn)定表達的fflV包膜蛋白Env篩選細胞系。
3. 如權利要求1或2所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于步驟(2)重組表達載 體4中插入的目的基因為人趨化因子CCR5基因，步驟(3)重組表達 載體5中插入的目的基因為fflV-l病毒抹SF162的包膜蛋白SF162 gpl60。
4. 如權利要求1或2所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于步驟(2)重組表達載 體4中插入的目的基因為人趨化因子CXC^4基因，步驟(3 )重組表 達栽'體5中插入的目的基因為HIV-1病毒抹HXB2的包膜蛋白 HXB2-歷。
5. 如權利要求1或2所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于所述報告基因為下列 之一①綠色熒光蛋白基因、②紅色熒光蛋白基因、③及em7/a熒光素 酶基因、 i^^/fy熒光素酶基因、⑤堿性磷酸酶基因、⑥Bete-內(nèi)酰胺 酶基因、⑦LacZ基因。
6. 如權利要求1或2所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于所述DnaE內(nèi)含肽基因 來自藍球藻爿騰,i "油/薩R2 PCC7942或點狀念抹藻iVo加c pw贈i/br膨PCC73102 。
7. 如權利要求1或2所述的篩選系統(tǒng)，其特征在于所述DnaE內(nèi)含肽基因 的N端系從藍球藻菌林爿wac^^s m'血/ara R2(PCC7942)基因組DNA中克隆DnaE內(nèi)含肽基因的N端，記為dnae-N，所述DnaE內(nèi)含肽基因的 C端系從藍球藻菌抹j"acw船m'^/ara i 2(PCC7942)基因組DNA中克 隆DnaE內(nèi)含肽基因的C端，記為dnae-C。
8. 如權利要求1所述的篩選系統(tǒng)在高通量篩選CCR5或CXCR4拮抗劑中 的應用。
9. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用為將趨化因子受體 篩選細胞系細胞和fflV包膜蛋白Env篩選細胞系細胞加入添加有待篩 選藥物的適用于CHO細胞或HEK293細胞的培養(yǎng)基中，混合培養(yǎng)4~8 小時，培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)洗滌、細胞裂解，加入與報告基因相對應的反應底 物，獲得待測藥物活性數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種HIV侵染細胞的篩選系統(tǒng)。由報告蛋白基因一分為二成報告基因N端和報告基因C端，報告基因N端與具有蛋白剪接功能的DnaE內(nèi)含肽N端基因部分dnae-N融合構成表達載體I；報告基因C端則與具有蛋白剪接功能的DnaE內(nèi)含肽C端基因部分dnae-C融合構成表達載體II。將兩個表達載體分別轉染含趨化因子和CD4蛋白或者含HIV包膜蛋白Env的HEK293細胞或CHO細胞，并構建成穩(wěn)定表達細胞株。當兩株穩(wěn)定細胞混合培養(yǎng)時，細胞發(fā)生融合，從而促使DnaE-C和DnaE-N能夠相互接觸作用，而由DnaE-N和DnaE-C共同作用把報告蛋白N端和報告蛋白C端連接成一個完整的報告蛋白，最后通過檢測報告蛋白活性便可知細胞的融合程度。
文檔編號C12N15/85GK101671653SQ20091015293
公開日2010年3月17日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權日2009年9月22日
發(fā)明者周耐明, 張亞萍, 陳林潔 申請人:浙江大學