PDGFR-β作為篩選促進(jìn)血管生成的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的標(biāo)志物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了PDGFR?β作為篩選促進(jìn)血管生成的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的標(biāo)志物的應(yīng)用。本發(fā)明提供了表達(dá)PDGFR?β的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具備如下1)?5)中至少一種功能的產(chǎn)品的應(yīng)用：1)促進(jìn)血管形成或生成；2)促進(jìn)血管再生；3)促進(jìn)傷口愈合；4)治療皮膚損傷；5)提高血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明了本發(fā)明分離篩選一群PDGFR?β陽性表達(dá)的MSCs，并發(fā)現(xiàn)其在血管生成及傷口愈合方面有獨(dú)特的治療效果。
【專利說明】
PDGFR-β作為篩選促進(jìn)血管生成的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群的標(biāo)志 物的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種PDGFR-M乍為篩選促進(jìn)血管生成的間充 質(zhì)干細(xì)胞亞群的標(biāo)志物的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種成體干細(xì)胞，由于MSCs具 有來源廣泛、獲取方法簡單、體外擴(kuò)增培養(yǎng)容易、移植后免疫反應(yīng)低和組織修復(fù)速度快等優(yōu) 勢，使其在自身免疫性疾病以及各種疾病替代治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。近年 來干細(xì)胞移植用于皮膚傷口愈合方面的研究與日倶增，MSCs主要通過兩方面的機(jī)制促進(jìn)皮 膚的傷口愈合:多向分化潛能和旁分泌作用。前者主要通過誘導(dǎo)分化成角質(zhì)形成細(xì)胞、血管 內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等參與皮膚損傷部位表皮及附屬器的形成，促進(jìn)皮膚傷口愈合;后者 通過在損傷部位釋放一系列細(xì)胞因子和生長因子，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖、迀移和血管生成，進(jìn) 而達(dá)到皮膚傷口愈合。
[0003] MSCs在形態(tài)、功能及生物學(xué)特性上存在異質(zhì)性。目前還沒有單一的方法能夠鑒別 間充質(zhì)干細(xì)胞，對于間充質(zhì)干細(xì)胞還沒有特定的標(biāo)志物來鑒定和定義。MSCs表面表達(dá)多種 抗原，但是沒有MSCs特異性表達(dá)的蛋白。不同來源的MSCs對于相同的蛋白受體的表達(dá)情況 也不同，隨著傳代培養(yǎng)，MSCs對很多表面蛋白的表達(dá)也會有所改變。一些研究顯示早期培養(yǎng) 的MSCs有至少三種不同的形態(tài):小的快速自我更新的細(xì)胞，成纖維細(xì)胞形態(tài)的梭形細(xì)胞，大 的扁平狀細(xì)胞。小的這一群細(xì)胞保持快速增值和強(qiáng)大的多向分化潛能，并具有很好的迀徙 能力。研究發(fā)現(xiàn)，由單一的MSCs形成的克隆具有不同的三系分化的能力，MSCs的分化潛能與 分離和培養(yǎng)方式也有很大的關(guān)系?？傊琈SCs表面分子的表達(dá)和分化潛能均表現(xiàn)出異質(zhì)性。
[0004] 干細(xì)胞治療為傷口愈合開辟了新的道路，MSCs在皮膚傷口愈合中有明顯的作用， 愈合效果也很理想。但是將MSCs大量應(yīng)用于臨床，還存在很多問題。根據(jù)目前的分離方法， MSCs存在異質(zhì)性，為一群表型和功能上多樣性的混合的干細(xì)胞。目前還沒有單一的方法能 夠鑒別間充質(zhì)干細(xì)胞，對于間充質(zhì)干細(xì)胞還沒有特定的標(biāo)志物來鑒定和定義。對MSCs的鑒 定和生理功能研究，都由于缺乏生物標(biāo)志物而受到阻礙。這導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞作用的具體 機(jī)制還不清楚，極大的限制了MSCs應(yīng)用于臨床治療某些特定疾病的潛力。MSCs含有不同組 織修復(fù)能力的亞群，通過一些特異性的標(biāo)志物對MSCs進(jìn)行鑒定、篩選和分群從而針對性的 研究某一亞群MSCs對某些疾病的修復(fù)能力與治療效果，這是將MSCs應(yīng)用于臨床研究的趨勢 與前景。
[0005] 血小板衍生生長因子(PDGF)是由兩條多肽鏈通過二硫鍵連接而成的同型或異型 二聚體，PDGF具有多種形式的二聚體結(jié)構(gòu)，即PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC&& PDGF-DD。在組織受到損傷時(shí)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞 等可以合成并釋放PDGFWDGFR是PDGF受體，由兩種亞單位α及β構(gòu)成，其分子量為170~ 180KD。二者與TOGF結(jié)合力相差很大，α單位與TOGF Α鏈及Β鏈有較高的親和力，而β亞單位僅 與B鏈有高親和力。所以α亞單位可與roGF-AA、H)GF-AB及PDGF-BB結(jié)合，β亞單位僅與PDGF-BB及PDGF-AB結(jié)合。一些研究證明，在肝纖維化時(shí)，HSC表面的PDGF受體以β受體為主，與 PDGF-BB具有較強(qiáng)的親和力，認(rèn)為PDGF-BB以及PDGFR-β在肝纖維化過程中的作用尤為突出。
[0006] 血管周間質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等均表達(dá)roGFR-β。很多 研究表明，PDGFR-β在骨髓來源的MSCs及脂肪來源的MSCs都有很高的表達(dá)量，可是研究發(fā)現(xiàn) PDGFR-β在胎盤來源的MSCs表面表達(dá)量有25 %左右，而且隨傳代培養(yǎng)表達(dá)量發(fā)生變化。 PDGFR-β的表達(dá)受多種因素的影響，比如炎癥刺激PDGFR-β的表達(dá)上調(diào)，在培養(yǎng)過程中 PDGFR-β陰性表達(dá)的MSCs也會逐漸獲得PDGF而表達(dá)PDGFR-β。
[0007] roGF及roGFR-β信號通路對于MSCs的增殖、迀移、分化潛能及功能上都有很強(qiáng)的調(diào) 控作用。有研究指出PDGFR-β可以抑制MSCs的成骨分化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的一個目的是提供表達(dá)PDGFR-邱勺間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的表達(dá)PDGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具備如下1)-5)中至少一種功 能的產(chǎn)品的應(yīng)用：
[0010] 1)促進(jìn)血管形成或生成；
[0011] 2)促進(jìn)血管再生；
[0012] 3)促進(jìn)傷口愈合
[0013] 4)治療皮膚損傷；
[0014] 5)提高血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。
[0015] 表達(dá)PDGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞(TOGFR-β表達(dá)陽性)提高血管生成相關(guān)因子表達(dá)量 為與不表達(dá)roGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞亞群(PDGFR-β表達(dá)陰性)相比，表達(dá)TOGFR-β的間充質(zhì) 干細(xì)胞亞群的血管生成相關(guān)因子表達(dá)量提高。
[0016] 上述應(yīng)用中，所述血管生成相關(guān)因子為CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-l、bFGF、 PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述表達(dá)PDGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞為表達(dá)PDGFR-β的離體間充質(zhì)干細(xì) 胞亞群。
[0018]上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為試劑盒或藥物。
[0019]本發(fā)明另一個目的是提供一種產(chǎn)品。
[0020] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為表達(dá)PDGFR-邱勺間充質(zhì)干細(xì)胞；
[0021] 所述產(chǎn)品具有如下1)-5)中至少一種功能：
[0022] 1)促進(jìn)血管形成或生成；
[0023] 2)促進(jìn)血管再生；
[0024] 3)促進(jìn)傷口愈合
[0025] 4)治療皮膚損傷；
[0026] 5)提高血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。
[0027] 上述產(chǎn)品中，所述血管生成相關(guān)因子為CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-l、bFGF、 PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。
[0028] 上述產(chǎn)品中，所述表達(dá)roGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞為表達(dá)TOGFR-β的離體間充質(zhì)干細(xì) 胞亞群。
[0029] 上述產(chǎn)品中，所述產(chǎn)品為試劑盒或藥物。
[0030] PDGFR-M乍為靶點(diǎn)或標(biāo)志物在篩選具有如下1)-5)中至少一種功能的間充質(zhì)干細(xì) 胞中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0031] 或檢測PDGFR-β表達(dá)的物質(zhì)在篩選或分選具有如下1)-5)中至少一種功能的間充 質(zhì)干細(xì)胞中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；
[0032] 1)促進(jìn)血管形成或生成；
[0033] 2)促進(jìn)血管再生；
[0034] 3)促進(jìn)傷口愈合
[0035] 4)治療皮膚損傷；
[0036] 5)提高血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。
[0037] 上述使用PDGFR-β抗體檢測PDGFR-β表達(dá)的物質(zhì)。
[0038]本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明分離篩選PDGFR-即日性表達(dá)的MSCs，分別從體外、體內(nèi) 兩方面的實(shí)驗(yàn)尋找PDGFR-即日性表達(dá)的MSCs的作用和功能；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PDGFR-即日性的 MSCs表達(dá)血管生成相關(guān)因子水平大幅提高；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過將PDGFR-即日性表達(dá)的MSCs和 roGFR-β陰性表達(dá)的MSCs應(yīng)用于小鼠皮膚傷口模型，發(fā)現(xiàn)TOGFR-即日性表達(dá)的MSCs血管生成 能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞在傷口中的存活性和迀徙能力都比較強(qiáng)，促進(jìn)傷口愈合效果很好;為臨 床治療燒傷等皮膚損傷提供了一種有效的方法。
【附圖說明】
[0039]圖1為PDGFR-I3細(xì)胞在胎盤組織中的分布情況(標(biāo)尺長度為100微米）。
[0040]圖2為流式檢測P4MSCs對血小板衍生生長因子受體beta(PDGFR_f3)的表達(dá)情況。 [0041 ]圖3為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測roGFR-β特定表達(dá)陽性與陰性的MSCs表達(dá)血管生成相 關(guān)因子水平。
[0042] 圖4為胎盤MSCs中PDGFR-0+的血管形成能力檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0045] 實(shí)施例1、PDGFR-0陽性細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)及分選
[0046] 一、PDGFR-辟田胞在胎盤組織中的分布
[0047]根據(jù)捐贈者知情同意并遵循倫理委員會批準(zhǔn)的原則，從醫(yī)院取得離體的人胎盤組 織。然后用預(yù)冷的生理鹽水清洗胎盤組織，取小的組織塊，用4%的多聚甲醛固定組織24小 時(shí)以上，然后使用1 〇 %、20 %、30 %的蔗糖溶液梯度脫水，每次6小時(shí)以上，然后使用0CT包埋 組織，將組織進(jìn)行冰凍切片，切片厚度為10微米。最后做免疫熒光染色，一抗為TOGFR-β抗體 (購買自德國美天旎(Miltenyi Biotec)公司，貨號130-105-320)，稀釋濃度為1:100,4度冰 箱孵育過夜;二抗為帶有紅色焚光染料標(biāo)記的抗體(購買自Jackson Immunoresearch，貨號 200-022-211)，室溫孵育1小時(shí);細(xì)胞核用藍(lán)色熒光染料DAPI(購買自南京凱基生物有限公 司，貨號KGA215-50)標(biāo)記，染完后使用共聚焦顯微鏡分別在低倍鏡和高倍鏡下拍照，觀察 PDGFR-即日性的細(xì)胞在胎盤組織在中的分布。
[0048] 結(jié)果如圖1所示，可以看出，在胎盤組織中，只有一些區(qū)域的部分細(xì)胞表達(dá)roGFR-β (白色虛線方框所示），這些細(xì)胞多位于血管外周圍，散在分布。
[0049] 二、篩選源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群和源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群
[0050]收集貼壁培養(yǎng)的第四代次的MSCs，取一部分細(xì)胞懸液使用流式抗體PDGFR-β-ΡΕ抗 體(購買自biolegend公司，貨號323605)標(biāo)記，4度冰箱放置20-30分鐘，然后用roS清洗兩 次，最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測，結(jié)果如圖2左邊起第一個圖所示，流式檢測P4MSCs 對血小板衍生生長因子受體beta(PDGFR-P)的表達(dá)率為18.7% ;
[0051]對于使用免疫磁珠分選的具體方法為:首先配制分選緩沖液，成分為PBS(PH值為 7.2)、0.5 %牛血清白蛋白、2Mm EDTA;然后準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，使用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù);然 后加&111:;[-?06?1?-0-13；[01:;[11抗體（購買自德國美天旎(1;[]^6115^13;[(^6(3)公司，貨號130-105-320)標(biāo)記，放置于4度冰箱孵育20-30分鐘;使用1-2毫升分選緩沖液清洗細(xì)胞兩次，每 次離心300g，10分鐘；然后用分選緩沖液重懸細(xì)胞，每一千萬細(xì)胞用80微升的緩沖液重懸， 然后加入20微升的anti-biotin磁珠 (microbeads )，4度放置15分鐘;再次使用1-2毫升的分 選緩沖液清洗，300g，10分鐘離心，去上清，得細(xì)胞沉淀;然后使用500微升的分選緩沖液重 懸細(xì)胞，過分選柱，收集陰性的細(xì)胞，然后取下分選柱，將陽性的與磁珠結(jié)合的細(xì)胞洗脫下 來。
[0052]分別取少量分選后的陰性和陽性的細(xì)胞懸液，用流式抗體PDGFR-β-ΡΕ抗體標(biāo)記，4 度冰箱放置20-30分鐘，然后用PBS清洗兩次，最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式檢測通過免疫 磁珠分選后兩個亞群的間充質(zhì)干細(xì)胞表面的PDGFR-β表達(dá)情況，即為檢測分選效率。結(jié)果如 圖2左邊起第2個圖（分選后PDGFRP+MSCs PDGFRP-FITC: 98.1 % )和第3個圖（分選后？06?邸_ MSCs PDGFRP-FITC: 3.87 % )所示，可以看出，經(jīng)過培養(yǎng)的MSCs中只有部分細(xì)胞表達(dá)PDGFR-β，陽性細(xì)胞平均表達(dá)比例約為20%，而且免疫磁珠分選的效率很好，即：分選后的陽性細(xì)胞 幾乎全部表達(dá)TOGFR-β，而陰性細(xì)胞幾乎完全不表達(dá)TOGFR-β;可以用于后續(xù)的體外、體內(nèi)水 平的實(shí)驗(yàn)研究。
[0053]因此可以通過流式分析和免疫磁珠分選相結(jié)合的方法得到比較純化的源于胎盤 MSCs的roGFR-0+細(xì)胞亞群（也稱為TOGFR-即日性細(xì)胞亞群）和源于胎盤MSCs的roGFR-β-細(xì)胞 亞群(也稱為PDGFR-β陰性細(xì)胞亞群）。
[0054] 實(shí)施例2、源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群的功能研究
[0055] -、源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群提高血管生成相關(guān)因子的表達(dá)水平
[0056] 取實(shí)施例1免疫磁珠分選后的PDGFR-i3+細(xì)胞亞群和PDGFR-β-細(xì)胞亞群，分別提取 mRNA，使用分光光度計(jì)檢測mRNA濃度;然后使用Takara公司的RT-PCR試劑盒，將mRNA反轉(zhuǎn)錄 為cDNA，最后做熒光定量PCR，檢測兩種亞群的細(xì)胞對于血管生成相關(guān)因子及促進(jìn)血管生成 的因子的相對表達(dá)情況。
[0057]研究中使用到的引物序列為：
[0058] CD31(Pecaml)
[0059] CAA CGA GAA AAT GTC AGA(序列 1)
[0060] GGA GCC TTC CGT TCT AGA GT(序列2)
[0061 ] VE-cadherin
[0085] 結(jié)果如圖3所示，每組柱形圖左側(cè)的為PDGFR-即日性，右側(cè)的為TOGFR-β陰性，可以 看出PDGFR-即日性的細(xì)胞群對于促進(jìn)血管生成因子bFGF、VEGF、Ang 1等因子的表達(dá)水平是陰 性細(xì)胞群的2倍以上，而對于CD31的表達(dá)水平是陰性細(xì)胞群的9倍，對于其他一些相關(guān)因子 的表達(dá)水平也較高；因此，mRNA水平結(jié)果暗示了PDGFR-即日性的細(xì)胞群能夠促進(jìn)血管生成。 [0086] 二、源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群具有血管形成能力
[0087]準(zhǔn)備Babl/C小鼠，用脫毛膏使背部脫毛，然后使用酒精和碘酒消毒，用0.5毫米的 打孔器在小鼠的背部對稱的打兩個傷口，在傷口周圍粘上硅膠圈，得到受傷小鼠模型。 [0088] 實(shí)驗(yàn)組1:將實(shí)施例1分選的源于胎盤MSCs的roGFR_f3+細(xì)胞亞群用matrigel (購買 于Corning公司）重懸，移植到小鼠皮膚傷口床上；
[0089] 實(shí)驗(yàn)組2:將實(shí)施例1分選的源于胎盤MSCs的PDGFR-β-細(xì)胞亞群分別用matrigel (購買于Corning公司）重懸，移植到小鼠皮膚傷口床上；
[0090] 對照組（sham):小鼠只移植matrigel。
[0091]每組5只小鼠，每個傷口移植100萬的間充質(zhì)干細(xì)胞，7天和14天后分別給傷口拍 照。
[0092] 結(jié)果如圖4(DAPI為細(xì)胞核的染料，中文名字為2-氨基苯基吲噪;α-SMA為a-smo〇th act in，a-平滑肌肌動蛋白）所示，可以看出，移植TOGFR-e+MSCs細(xì)胞亞群可以明顯促進(jìn)小鼠 皮膚傷口愈合，實(shí)驗(yàn)組小鼠傷口愈合速度加快，愈合效果較好；同時(shí)取皮膚樣品進(jìn)行分析。 分別進(jìn)行HE染色和免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)移植H)GFR-i3+細(xì)胞亞群的實(shí)驗(yàn)組小鼠傷口周圍血管 生成明顯增多，同時(shí)，傷口愈合效果較好。表明，胎盤MSCs中PDGFR-0+細(xì)胞具有促進(jìn)血管形 成能力。
[0093]根據(jù)統(tǒng)計(jì)的三組小鼠的傷口愈合率的定量結(jié)果可見，PDGFR-i3+MSCS的傷口愈合效 果明顯好于PDGFR-i3-MSCS，傷口愈合率提高有20 % ;與不加細(xì)胞的對照組相比，提高有近 40% 〇
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 表達(dá)PDGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備具備如下1)-5)中至少一種功能的產(chǎn)品的應(yīng)用： 1) 促進(jìn)血管形成或生成； 2) 促進(jìn)血管再生； 3) 促進(jìn)傷口愈合； 4) 治療皮膚損傷； 5) 提尚血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述血管生成相關(guān)因子為CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-l、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)TOGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞為表 達(dá)PDGFR4的離體間充質(zhì)干細(xì)胞亞群。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述產(chǎn)品為試劑盒或藥物。5. -種產(chǎn)品，其活性成分為表達(dá)PDGFIH3的間充質(zhì)干細(xì)胞； 所述產(chǎn)品具有如下1)_5)中至少一種功能： 1) 促進(jìn)血管形成或生成； 2) 促進(jìn)血管再生； 3) 促進(jìn)傷口愈合； 4) 治療皮膚損傷； 5) 提尚血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述血管生成相關(guān)因子為CD31、VE-cadherin、VEGF、Ang-l、bFGF、PDGF A、PDGF B、IL-4和/或IL-10。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述表達(dá)TOGFR-β的間充質(zhì)干細(xì)胞為表 達(dá)PDGFR4的離體間充質(zhì)干細(xì)胞亞群。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述產(chǎn)品為試劑盒或藥物。 9. PDGFR-M乍為靶點(diǎn)或標(biāo)志物在篩選具有如下1)-5)中至少一種功能的間充質(zhì)干細(xì)胞 中的應(yīng)用； 或檢測PDGFR-β表達(dá)的物質(zhì)在篩選或分選具有如下1 )-5)中至少一種功能的間充質(zhì)干 細(xì)胞中的應(yīng)用； 1) 促進(jìn)血管形成或生成； 2) 促進(jìn)血管再生； 3) 促進(jìn)傷口愈合； 4) 治療皮膚損傷； 5) 提尚血管生成相關(guān)因子表達(dá)量。
【文檔編號】A61P9/00GK105833249SQ201610321976
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】吳耀炯, 王珊
【申請人】清華大學(xué)深圳研究生院