專(zhuān)利名稱(chēng)：：擬康氏木霉胞外多糖及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種具有增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)的多糖，特別涉及擬康氏木霉CGMCCNo.1443(7>/c/w^ra。戸rafitofow/Mg/;')所產(chǎn)生的具有免疫活性的胞外多糖(簡(jiǎn)稱(chēng)木霉多糖，EPS)及其制備方法和用途。技術(shù)背景木霉按傳統(tǒng)分類(lèi)系統(tǒng)，隸屬于半知菌亞門(mén)(￡>ra/eraw_yco""a)、絲孢綱(//，/20附>^/^)、絲抱目(//w/ww少ceto/M)、絲孢科(/^p/Kw^c^a"ae)。木霉是一類(lèi)分布廣泛的真菌，除個(gè)別種為弱致病菌外，多數(shù)對(duì)植物病原菌具有拮抗作用，是生防真菌中研究和應(yīng)用最多一種，它對(duì)多種病原菌都有抑制作用，是一類(lèi)理想的防治土傳病害的生防菌。真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，可以控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類(lèi)活性多糖。真菌的多糖化合物具有很強(qiáng)的生物活性，主要集中在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗突變、抗衰老、降血脂、抗?jié)?、抗氧化等方面。?qiáng)免疫和抗腫瘤活性是多糖重要的生物活性。研究表明，多糖可以通過(guò)增強(qiáng)免疫細(xì)胞活性、激活細(xì)胞因子的分泌、誘導(dǎo)生成抗體及激活補(bǔ)體系統(tǒng)等作用增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。多糖的抗腫瘤途徑主要為抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)及核酸的合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響癌基因的表達(dá)及改變腫瘤細(xì)胞膜的生長(zhǎng)特性。擬康氏木霉CGMCCNo.1443是一種具有很強(qiáng)生長(zhǎng)勢(shì)的木霉，木霉的生長(zhǎng)發(fā)育和孢子的產(chǎn)生需要的環(huán)境條件(營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH值、光照等)都比較簡(jiǎn)單，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)非常迅速。擬康氏木霉CGMCCNo.1443分泌大量活性胞外多糖，其胞外多糖分泌條件簡(jiǎn)單，含量高，每升培養(yǎng)液中，粗多糖的含量可達(dá)700mg，其分離純化方式簡(jiǎn)單，具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。CN1748511(200510044527.5)公開(kāi)了含有擬康氏木霉CGMCCNo.1443的生物制劑，用于防治植物多種病害。目前還沒(méi)有關(guān)于擬康氏木霉CGMCCNo.1443胞外多糖具有免疫活性的報(bào)道和專(zhuān)利公開(kāi)，我們從擬康氏木霉發(fā)酵液中分離純化的多糖，具有較強(qiáng)的免疫激活能力，能夠顯著誘導(dǎo)纖維瘤細(xì)胞的凋亡，延長(zhǎng)S180腹水瘤小鼠壽命，減輕S180實(shí)體瘤小鼠的瘤重，增加其脾指數(shù)。
發(fā)明內(nèi)容針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一旨在提供一種擬康氏木霉胞外多糖。本發(fā)明的目的之二旨在提供一種擬康氏木霉胞外多糖的制備方法。本發(fā)明的目的之三旨在提供擬康氏木霉胞外多糖的重要用途。本發(fā)明的擬康氏木霉胞外多糖，其特征在于，(1)通過(guò)高效凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)，其具有單一對(duì)稱(chēng)峰，分子量為18325;(2)通過(guò)改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法檢測(cè)，其中性多糖含量為65.2%，糖醛酸含量為32.6%;(3)通過(guò)糖醇乙酸酯的氣相色譜(GC)分析，其單糖組成為鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)，摩爾比為Rha:Glc:Gal=5.6:2.7:1.0。該多糖完全還原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為Rha:Glc:Gal=14.5:9.3:1.0，并且其含有摩爾含量為26.6%的葡萄糖醛酸。這種擬康氏木霉胞外多糖，是將擬康氏木霉發(fā)酵液脫色、濃縮、醇沉和去蛋白后，通過(guò)凝膠層析柱純化得到的均一多糖。本發(fā)明的擬康氏木霉胞外多糖的制備方法，包括步驟(1)粗多糖的制備和步驟(2)多糖的純化，其特征在于，所述步驟(1)粗多糖的制備，包括A、將擬康氏木霉接入液體培養(yǎng)基后，28°C、130轉(zhuǎn)每分鐘(rpm)振蕩培養(yǎng)6天(d);B、過(guò)濾離心除去菌絲和孢子，過(guò)3520樹(shù)脂柱脫色，收集洗脫液，減壓濃縮至原體積的1/4;C、濃縮液用Sevag法脫蛋白；D、加入乙醇于4。C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，用乙醚、丙酮、95%乙醇依次洗滌，沉淀溶于蒸餾水，透析48小時(shí)(h)后濃縮到原體積1/4，經(jīng)冷凍干燥得胞外粗多糖樣品，所述步驟(2)多糖的純化，包括A、采用葡聚糖凝膠(Sephadex)G-75柱層析法，準(zhǔn)確稱(chēng)取木霉胞外粗多糖1g，溶于10ml的水中，上柱，室溫下用水進(jìn)行洗脫，控制流速0.4ml/min;B、用分部自動(dòng)接收器每15分鐘一管(min/管)，苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測(cè)，于490nm處測(cè)定光吸收值；C、根據(jù)洗脫體積對(duì)吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖初步純化組分；將前述所得初步純化組分SephadexG-100葡聚糖凝膠層析純化，得目的產(chǎn)物。這種擬康氏木霉胞外多糖在制備提高哺乳動(dòng)物免疫活性藥物或功能性食品中以及在制備治療或輔助治療腫瘤的藥物、功能性食品中具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明的多糖對(duì)特異性和非特異性免疫、體液免疫或細(xì)胞免疫均有促進(jìn)作用，對(duì)大鼠纖維瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，對(duì)小鼠的S180腹水瘤和實(shí)體瘤都有抑制作用。本發(fā)明公開(kāi)的擬康氏木霉胞外多糖是由擬康氏木霉液體發(fā)酵液，經(jīng)脫色、濃縮、去蛋白、醇沉等方法得到粗多糖后，進(jìn)一步通過(guò)凝膠層析柱得到的均一組分(EPS)。本發(fā)明的多糖通過(guò)高效凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該組分為單一對(duì)稱(chēng)峰，分子量為18325;通過(guò)改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法，發(fā)現(xiàn)該多糖中中性多糖含量為65.2%,糖醛酸含量為32.6%。經(jīng)糖組成分析表明，完全水解產(chǎn)物的TLC分析顯示含有一定量的糖醛酸；糖醇乙酸酯的GC分析表明，含有鼠李糖、葡萄糖和少量的半乳糖，摩爾比為Rha:Glc:Gal=5.6:2.7:1.0。EPS用Conrad法進(jìn)行羧基還原，還原3次后得到EPS-O-R，對(duì)其進(jìn)行糖組成分析，TLC分析不含糖醛酸，表明還原已完全。TPP-O-RGC分析表明，它中含有鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為Rha:Glc:Gal=14.5:9.3:1.0，說(shuō)明該多糖含有葡萄糖醛酸(GlcA)，其摩爾含量為26.6%，質(zhì)量百分含量約為31.9%，這與間苯基苯酚法測(cè)定的結(jié)果一致。本發(fā)明擬康氏木霉胞外多糖的大規(guī)模制備方法包括以下步驟(1)粗多糖的制備將擬康氏木霉CGMCCNo.l443接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)活化，然后由平板接入液體培養(yǎng)基中，28°C、100rpm振蕩培養(yǎng)6d。用四層紗布過(guò)濾除去菌絲和孢子，4000rpm離心15min,上清過(guò)3520樹(shù)脂柱脫色，收集洗脫液，48'C減壓濃縮至原體積的1/4。濃縮液用Sevag法(氯仿正丁醇=4:1，V/V)脫蛋白。加入3倍體積的95%乙醇于4。C靜置過(guò)夜，5000rpm離心15min，收集沉淀，乙醚、丙酮、95%乙醇依次洗滌，沉淀溶于蒸餾水，透析48h后濃縮到原體積1/4，經(jīng)冷凍干燥得胞外粗多糖樣品(EPS)。(2)多糖的純化采用SephadexG-75葡聚糖凝膠柱層析法，準(zhǔn)確稱(chēng)取木霉胞外粗多糖lg，溶于10ml的水中，上柱，室溫下用水進(jìn)行洗脫，流速0.4ml/min，用分部自動(dòng)接收器每15min/管。用苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測(cè)，于490nm處測(cè)定光吸收值。根據(jù)洗脫體積對(duì)吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖組分EPS。將得到的兩種組分使用SephadexG-100葡聚糖凝膠層析進(jìn)一步純化。本發(fā)明的多糖在制備提高哺乳動(dòng)物免疫活性的功能食品和藥物，治療或輔助治療癌癥的藥物方面具有廣泛的應(yīng)用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的多糖EPS較低濃度時(shí)就在激活脾細(xì)胞增殖、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性、刺激巨噬細(xì)胞NO的產(chǎn)量、酸性磷酸酶活性方面具有較高活性；對(duì)大鼠纖維瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)，且具有劑量依賴(lài)效應(yīng)；同時(shí)，對(duì)小鼠的S180腹水瘤和實(shí)體瘤都有顯著的抑制效應(yīng)。毒理實(shí)驗(yàn)表明該糖在30mg/ml濃度以下對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。表明該發(fā)明的多糖可以作為活性成分制備提高哺乳動(dòng)物免疫活性的功能食品和藥物，治療或輔助治療癌癥的藥物。圖l:擬康氏木霉胞外多糖EPS對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響。圖2:擬康氏木霉胞外多糖EPS協(xié)同ConA對(duì)脾細(xì)胞增殖的影響。圖3:擬康氏木霉胞外多糖EPS協(xié)同LPS對(duì)淋巴細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響。圖4:擬康氏木霉胞外多糖EPS協(xié)同LPS對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)NO的影響。圖5:擬康氏木霉胞外多糖EPS協(xié)同LPS對(duì)淋巴細(xì)胞酸性磷酸酶活性的影響。圖6:擬康氏木霉胞外多糖EPS對(duì)大鼠纖維瘤細(xì)胞的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不限于此。實(shí)施例l擬康氏木霉胞外多糖的制備(1)粗多糖的制備將擬康氏木霉CGMCCNo.l443接種于PDA培養(yǎng)基上，28'C活化2d后，由平板接入液體培養(yǎng)基中，28°C、130ipm振蕩培養(yǎng)6d。用四層紗布過(guò)濾除去菌絲和孢子，4000rpm離心15min，上清過(guò)3520樹(shù)脂柱脫色，收集洗脫液，48。C減壓濃縮至原體積的1/4。濃縮液用Sevag法(氯仿正丁醇=4:1，V/V)脫蛋白。加入3倍體積的95%乙醇于4。C靜置過(guò)夜，5000rpm離心15min，收集沉淀，乙醚、丙酮、95%乙醇依次洗滌，沉淀溶于蒸餾水，透析48h后濃縮到原體積1/4，經(jīng)冷凍干燥得胞外粗多糖樣品(EPS)。(2)多糖的純化采用SephadexG-75葡聚糖凝膠柱層析法。準(zhǔn)確稱(chēng)取木霉胞外粗多糖lg，溶于10ml的水中，上柱，室溫下用水進(jìn)行洗脫，流速0.4ml/min，用分部自動(dòng)接收器收集15min/管。用苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測(cè)，于490nm處測(cè)定光吸收值。根據(jù)洗脫體積對(duì)吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖組分EPS。將得到的兩種組分使用SephadexG-100葡聚糖凝膠層析進(jìn)一步純化。大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)胞外多糖的培養(yǎng)基優(yōu)化以生物量和胞外多糖產(chǎn)量為指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)搖瓶培養(yǎng)的擬康氏木霉的液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化后的擬康氏木霉發(fā)酵控制參數(shù)為最佳培養(yǎng)基配方為麥麩30g/1，玉米粉30g/1，葡萄糖7.5g/1，磷酸二氫鉀lg/l;發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間為6d;培養(yǎng)基的初始pH值為5.06.0;發(fā)酵溫度為30士rC。最佳培養(yǎng)條件下菌絲干重及胞外多糖的產(chǎn)量分別5.272g/l、0.622g/l。實(shí)施例2擬康氏木霉胞外多糖的純化采用SephadexG-75葡聚糖凝膠柱層析法。稱(chēng)取20gSephadexG-75懸浮于大體積的水中，讓其自然沉降4h，用傾瀉法除去懸浮的過(guò)細(xì)顆粒，反復(fù)幾次后，加足水逐漸升溫至沸，保溫3h。冷卻，抽真空，輕攪下連續(xù)裝入層析柱(2.5x80cm)中，通過(guò)2-3倍柱床體積的水使柱頭穩(wěn)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取木霉胞外粗多糖1.0g，溶于5ml的水中，上柱，室溫下用蒸餾水進(jìn)行洗脫，流速0.4ml/min，15min/管。用苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測(cè)，于490nm處測(cè)定光吸收值。根據(jù)洗脫體積對(duì)吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖組分EPS。將得到的組分使用SephadexG-100葡聚糖凝膠層析進(jìn)一步純化。實(shí)施例3擬康氏木霉胞外多糖的純度鑒定多糖樣品的純度和分子量用高效凝膠過(guò)濾法(HPGPC)測(cè)定，根據(jù)在凝膠柱上多糖的分子量與洗脫體積的關(guān)系，先用不同分子量的下系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚搪(Dextran)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)樣品的洗脫體積(由于流速一定，所以實(shí)際上用的是保留時(shí)間)與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照。根據(jù)樣品的峰形判斷其純度，樣品的分子量由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。所用HPLC色譜儀由沃特世(Waters)515HPLC泵，Waters241O示差檢測(cè)器構(gòu)成；色譜柱為沃特世強(qiáng)羥基凝膠柱(WatersUltrahydrogel)2000及Ultrahydrogel500兩柱串聯(lián)。流動(dòng)相為0.003mo1/1醋酸鈉(NaAc)，流速0.5ml/min，樣品溶于流動(dòng)相中，濃度為l。/。(w/v)，進(jìn)樣量為20ial。分子量已知的右旋糖苷(Dextran)T-系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖為T(mén)-2000，T-500，T-llO，T-70，T-40和T-20，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及數(shù)據(jù)處理均用沃特世公司的軟件進(jìn)行。經(jīng)高效凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該組分為單一對(duì)稱(chēng)峰，其分子量為18325;通過(guò)改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法，發(fā)現(xiàn)該多糖中中性多糖含量為65.2%，糖醛酸含量為32.6%。實(shí)施例4擬康氏木霉胞外多糖的結(jié)構(gòu)的鑒定(1)糖基組成分析多糖中糖醛酸的還原用Conrad法進(jìn)行多糖樣品(20mg)溶于10ml水中，然后加入N-環(huán)己基-N，-(2-N-甲基嗎琳代乙基)-碳二亞胺-對(duì)甲苯磺酸鹽N-Cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimidemethyl-p-toluenesulfonate，簡(jiǎn)稱(chēng)為CMC)300mg，磁力攪拌下滴加0.01mol/lHCl，用自動(dòng)電位滴定儀使pH保持為4.75，維持2h。滴加2mol/l硼氫化鈉溶液(NaBH4)20ml，此時(shí)pH值急劇上升，用4mo1/1鹽酸控制pH為7.00，持續(xù)攪拌，NaBH4溶液在45min內(nèi)加完。反應(yīng)中若生成大量泡沫，可加幾滴異戊醇消泡。NaBH4加完后，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)lh，滴加冰乙酸使pH為6.80。反應(yīng)液對(duì)蒸餾水透析(l1x3),透析內(nèi)液減壓濃縮至10ml，冷凍干燥。對(duì)EPS進(jìn)行糖組成分析，完全水解產(chǎn)物的TLC分析顯示含有一定量的糖醛酸；糖醇乙酸醋的GC分析表明，含有鼠李搪、葡萄糖和少量的半乳糖，摩爾比為Rha:Glc:Gal=5.6:2.7:1.0。EPS用Conrad法進(jìn)行羧基還原，還原3次后得到EPS-R，對(duì)其進(jìn)行糖組成分析，TLC分析不含糖醛酸，表明還原已完全。EPS-RGC分析表明，它中含有鼠李搪、葡萄搪和半乳搪，摩爾比為Rha:Glc:Ga卜14.5:9.3丄0，說(shuō)明該多搪含有葡萄糖醛酸(GlcA)，其摩爾含量為26.6，質(zhì)量百分含量約為31.9，這與間苯基苯酚法測(cè)定的結(jié)果一致。(2)結(jié)構(gòu)解析紅外光譜分析稱(chēng)取2.0mg多糖樣品(溴化鉀壓片)，在40000400cm"范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。IR譜結(jié)果表明EPS具有多糖的特征吸收峰。3403.8cm"處的強(qiáng)吸收峰是糖分子中O-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，2933.2cm—1處的峰是糖分子中C-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收，1604.5cm—1處的強(qiáng)吸收峰是糖分子中結(jié)合水的吸收。1297.9cm—1和1417.4cm—1的峰是糖分子中C-H鍵的變角振動(dòng)吸收。1076.1cm"禾n1033.7cm—1的峰是糖分子中C-O鍵的伸縮振動(dòng)吸收。'3CNMR譜取多糖40-60mg真空干燥后，溶于0.5ml重水(D20)中，置于05mm核磁管中，加入1pi丙酮作為內(nèi)標(biāo)(530.50ppm)，于室溫測(cè)定；'HNMR譜取干燥的多糖樣品(15-20mg)，用D20交換一次，然后再溶于0.5mlD20中，置于^5mm核磁管中，用HOD峰定標(biāo)(S4.80ppm)，于室溫測(cè)定?；瘜W(xué)位移均以四甲基硅烷(Me4Si)為外標(biāo)，測(cè)定均在BrukerAM-400核磁共振儀上進(jìn)行(表1)。表1TPP-0的部分"CNMR信號(hào)的歸屬ClC2C3C4C5C6Rha102.8677.0675.0374.0172.8516.61GlcA98.9971.4273.1370,5274.32176.77實(shí)驗(yàn)例l擬康氏木霉胞外多糖的細(xì)胞免疫活性(1)脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)U脾細(xì)胞的制備昆明小鼠，雌雄各半，4-6周，體重1820g。小鼠眼球放血致死，75。/。酒精浸泡lmin，無(wú)菌操作取出小鼠脾臟，置于100目不銹鋼網(wǎng)研磨，使單個(gè)脾細(xì)胞透過(guò)篩網(wǎng)落入盛有D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)移至離心管，1200卬m離心8min，棄去上清，加入2ml無(wú)菌水，20秒后加入1640液，離心棄去上清加入1640完全培養(yǎng)液，反復(fù)吹打使細(xì)胞懸浮，吸取脾細(xì)胞至另一離心管中，血球計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為lxlOMVml。1.2脾細(xì)胞增殖取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100pl。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加藥物和ConA)、藥物(終濃度分別為25、50、100、500、1000pg/ml)單獨(dú)刺激組、ConA(終濃度為5嗎/ml)單獨(dú)刺激組和藥物(終濃度分別為25、50、100、500、1000嗎/mL)協(xié)同ConA(終濃度為5pg/ml)刺激組，每組每濃度設(shè)三復(fù)孔。于37。C、5%032條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入MTT溶液10pl，繼續(xù)培養(yǎng)。取出，小心吸去上清100每孔加入DMSO150pl溶解甲瓚，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取每孔OD值。結(jié)果表明EPS能極顯著刺激脾細(xì)胞增殖。EPS,在濃度25、50、100、500和1000嗎/ml時(shí)增殖效應(yīng)與對(duì)照相比具有極顯著差異(PO.01)，增幅分別為48.4%、69.8%、72.6%、70.2%、62.3%，在濃度小于250pg/ml時(shí)存在劑量依賴(lài)性(圖1)。與ConA的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)表明，EPS在一定濃度范圍內(nèi)(25-1000(ag/ml)刺激經(jīng)ConA作用的小鼠淋巴細(xì)胞增殖，具有一定的協(xié)同作用；EPS濃度為100、500Hg/ml時(shí)具有顯著差異(P<0.05)，增幅為對(duì)照的11.1%、8.6%(圖2)。(2)小鼠巨噬細(xì)胞免疫活性的測(cè)定2.1小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備小鼠腹腔注射3M液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基2ml，3天后頸椎脫臼處死，打開(kāi)腹部，于腹腔注射PBS溶液5ml，按摩腹壁，抽取腹部滲出液，反復(fù)沖洗，收集滲出液。洗滌兩次，離心(200gx6min)。放入玻璃平皿中于37°C、5%C02條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，取出，用1640培養(yǎng)液沖洗3次，除去非粘附細(xì)胞，用橡皮棒輕輕刮取，即為純化的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。計(jì)數(shù)，用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液制成lxl(f/ml的細(xì)胞懸液。2.2小鼠巨噬細(xì)胞吞噬活性取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100^并加入終濃度為1昭/ml的LPS。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(濃度為1|_ig/ml的LPS)和藥物(終濃度分別為25、50、100、500、1000嗎/ml)刺激組，每組每濃度設(shè)三復(fù)孔。于37。C、5%<:02條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出，去上清，每孔加入1%中性紅生理鹽水溶液，于37。C放置20min，取出，去上清，用PBS溶液洗滌3次，除去未吞噬的中性紅染料。加入無(wú)水乙醇冰醋酸(1:1)混合液100|^1，室溫放置20min后，在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處讀取每孔OD值。結(jié)果表明EPS在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的5個(gè)梯度濃度下均具有極顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬活性的作用(PO.Ol)，與對(duì)照相比的增幅分別為108.2%、97.6%、卯.6%、62.4%、55.3%和35.3%，最低有效濃度為25pg/ml，隨著濃度的升高其促進(jìn)作用反而有所下降(如圖3)。2.3.NO含量的測(cè)定取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100|al并加入終濃度為1|ag/ml的LPS。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(濃度為1嗎/ml的LPS)和藥物(終濃度分別為25、50、100、500、1000(ag/ml)剌激組，每組每濃度設(shè)三復(fù)孔。于37'C、5。/。C02條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出，每孔小心吸取上清50pi置于另一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入Griess試劑50|il，混勻。室溫放置10min，在酶標(biāo)儀490nm波長(zhǎng)處讀取每孔OD值。用NaN02作標(biāo)準(zhǔn)曲線并將N02的濃度換算成NO的含量。結(jié)果表明EPS能顯著刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)NO。如圖4,EPS在濃度為25、50、100和500嗎/ml時(shí)具有極顯著刺激產(chǎn)NO效應(yīng)(P<0.01),增幅分別為對(duì)照的126.30%、133.0%、135.9%、151.5%、149.6%，在濃度為1000pg/ml時(shí)具有顯著刺激作用(P<0.05)，增幅為對(duì)照的171.5%，表現(xiàn)為較弱的劑量依賴(lài)性，最佳誘導(dǎo)濃度為25(ag/ml。2.4酸性磷酸酶活性的測(cè)定取細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100并加入終濃度為1嗎/ml的LPS。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(濃度為1(ag/ml的LPS)和藥物(終濃度分別為25、50、100、500、1000(ag/ml)刺激組，每組每濃度設(shè)三復(fù)孔。于37。C、5。/。C02條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。取出，去上清，每孔加pNPP溶液100nl，混勻，于37。C放置30min，取出，立即加入1.0mo1/1NaOH溶液10)al終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀405nm波長(zhǎng)處讀取每孔OD值。結(jié)果表明EPS具有激活巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶活性的作用，在濃度50、100和250(ag/ml時(shí)具有極顯著激活巨噬細(xì)胞酸性磷酸酶活性的效應(yīng)(PO.Ol)，增幅分別為對(duì)照的44.5%、42.1%和43.6%,在25和1000(ig/m時(shí)具有顯著激活效應(yīng)(P<0.05)，增幅分別為29.3%、16.6%(見(jiàn)圖5)。實(shí)驗(yàn)例2擬康氏木霉胞外多糖體外對(duì)大鼠纖維瘤細(xì)胞調(diào)亡的誘導(dǎo)作用取傳代多次的大鼠纖維瘤細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100pl。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(不加藥物)、藥物(終濃度分別為250、500、750、1000、1250、1500嗎/ml)作用組，每組每濃度設(shè)三復(fù)孔。于37。C、5。/。C02條件下置于C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h每孔加入MTT溶液10pl，繼續(xù)培養(yǎng)。取出，小心吸去上清100每孔加入DMSO150^il溶解甲瓚，在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)處讀取每孔OD值。其結(jié)果表明如圖6擬康氏木霉胞外多糖(250-1500pg/ml)作用都能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的調(diào)亡，各組均有明顯效果，在濃度為1250嗎/ml時(shí)效果最佳，與對(duì)照組相比有極顯著差異(PO.Ol)。與正常纖維瘤細(xì)胞相比，擬康氏木霉菌胞外多糖作用后的纖維瘤細(xì)胞皺縮成團(tuán)呈現(xiàn)出明顯的調(diào)亡癥狀。以上結(jié)果表明擬康氏木霉胞外多糖在一定濃度范圍內(nèi)具有誘導(dǎo)纖維瘤細(xì)胞調(diào)亡的作用。實(shí)驗(yàn)例3擬康氏木霉胞外多糖體內(nèi)用藥對(duì)小鼠S180腹水瘤的抑制實(shí)驗(yàn)選擇腹水型傳代7-10d而且腫瘤生長(zhǎng)良好的小鼠，脫臼致死。抽取腹腔內(nèi)白色濃稠腹水，制備成lxl(^個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色檢查腫瘤細(xì)胞活力在95%以上后，在無(wú)菌條件下，小鼠腹腔注射0.2ml腫瘤細(xì)胞懸浮液。小鼠隨機(jī)分為5組，每組12只分別按O、25、50、75、100mg/kg.d的劑量溶于0.2ml的生理鹽水，每天固定時(shí)間段注射到小鼠腹腔，每5d稱(chēng)量一下小鼠體重，連續(xù)給藥30d,記錄小鼠接種腫瘤后的存活時(shí)間。結(jié)果表明接種腹水瘤后，小鼠的體重增加緩慢，其體重增加速率只有健康小鼠的20%左右。以25-100mg/kg.d劑量EPS腹部注射后，都能夠增加腹水瘤小鼠的體重，其中75mg/kg.d的EPS效果最好，小鼠的增加速率比健康小鼠低18%左右，其次為100mg/kg.d的EPS。擬康氏胞外多糖對(duì)S180腹水癌小鼠體重(g)的影響結(jié)果見(jiàn)表2。接種腹水瘤后，小鼠的壽命平均有16.4d，注射不同劑量的EPS后，延長(zhǎng)了腹水瘤小鼠的壽命。其中，25mg/kg.d的劑量即使腹水瘤小鼠的壽命延長(zhǎng)了17.7%，效果最好的75mg/kg.d延長(zhǎng)了腹水瘤小鼠壽命38.4%。擬康氏胞外多糖對(duì)S180腹水癌小鼠存活時(shí)間的影響結(jié)果見(jiàn)表3。表2:擬康氏胞外多糖對(duì)S180腹水癌小鼠體重(g)的影響(n=12，xh)_<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3:擬康氏胞外多糖對(duì)S180腹水癌小鼠存活時(shí)間的影響處理平均存活天數(shù)生命延長(zhǎng)率<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實(shí)驗(yàn)例4擬康氏木霉胞外多糖體內(nèi)用藥對(duì)小鼠S180實(shí)體瘤的抑制實(shí)驗(yàn)取上述制備好的lxlO個(gè)/ml的S180腹水型瘤細(xì)胞懸液，于小鼠右上肢腋下皮下接種腫瘤細(xì)胞懸液0.2ml，建立S180腫瘤小鼠模型。接種后給藥組小鼠接種24h后，隨機(jī)分組，每組12只，分為對(duì)照組和處理組(給予EPS25、50、75和100mg/kg.day)。皮下注射給藥，每日一次，連續(xù)10天。處理組注射0.2ml含有不同劑量EPS的生理鹽水，對(duì)照組注射0.2ml的生理鹽水。預(yù)給藥組小鼠接種前7d隨機(jī)分組，每組12只，分為對(duì)照組和處理組(給予EPS25、50、75和100mg/kg.d)。小鼠灌胃給藥，每日一次，連續(xù)7d。處理組給予不同劑量的EPS水溶液，對(duì)照組給予相同體積的蒸餾水。第8天建立S180腫瘤模型，繼續(xù)給藥10d。于末次給藥24h后，S180實(shí)體瘤小鼠摘眼球放血處死，取血約lml，剝?nèi)∑は聦?shí)體瘤瘤塊，去除脂肪纖維組織，稱(chēng)重，按以下公式計(jì)算抑瘤率(％)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。抑瘤率(％)=(對(duì)照組平均瘤重-處理組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重x100。/。摘取脾臟稱(chēng)重并計(jì)算脾指數(shù)脾指數(shù)=實(shí)體瘤小鼠脾重/小鼠體重結(jié)果表明接種腹水瘤細(xì)胞后給藥和預(yù)給藥對(duì)小鼠S180肉瘤的都有明顯的抑制作用(見(jiàn)表4和5)。接種后給藥，25mg/kg.d的抑瘤率為10.5%,與對(duì)照組相比，達(dá)到顯著差異，75mg/kg.d抑瘤率仍最好，達(dá)到37.7%;50-100mg/kg.d預(yù)給藥后，再接種腫瘤細(xì)胞，瘤重顯著降低，與對(duì)照相比達(dá)顯著性差異；其中75mg/kg.d的劑量抑制效果最好，抑瘤率達(dá)到41.1%。脾指數(shù)也有相似的效果，25-100mg/kg.d的EPS都能夠顯著提高S180實(shí)體瘤小鼠的脾指數(shù)，增加小鼠的抗性，其中75mg/kg.d的效果最好，100mg/kg.d效果略有下降。同時(shí)，相同劑量的處理組，預(yù)給藥組的效果都要優(yōu)于接種后給藥組，表明預(yù)給藥能夠有效抑制腫瘤的發(fā)生。表4:接種腹水瘤細(xì)胞后注射EPS對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用(n=12，<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表5:預(yù)給EPS7d后對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用(n=12，灶s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種擬康氏木霉胞外多糖，其特征在于，(1)通過(guò)高效凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)，其具有單一對(duì)稱(chēng)峰，分子量為18325；(2)通過(guò)改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法檢測(cè)，其中性多糖含量為65.2％，糖醛酸含量為32.6％；(3)通過(guò)糖醇乙酸酯的氣相色譜(GC)分析，其單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為Rha∶Glc∶Gal＝5.6∶2.7∶1.0。2、一種擬康氏木霉胞外多糖，其特征在于，該多糖完全還原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為Rha:Glc:Gal=14.5:9.3:1.0，并且其含有摩爾含量為26.6%的葡萄糖醛酸。3、一種擬康氏木霉胞外多糖，其特征在于，它是將擬康氏木霉發(fā)酵液脫色、濃縮、醇沉和去蛋白后，通過(guò)凝膠層析柱純化得到的均一多糖。4、權(quán)利要求l-3任一所述擬康氏木霉胞外多糖的制備方法，包括步驟(1)粗多糖的制備和步驟(2)多糖的純化，其特征在于，所述步驟(1)粗多糖的制備，包括A、將擬康氏木霉接入液體培養(yǎng)基后，28°C、130轉(zhuǎn)每分鐘振蕩培養(yǎng)6天；B、過(guò)濾離心除去菌絲和孢子，過(guò)3520樹(shù)脂柱脫色，收集洗脫液，減壓濃縮至原體積的1/4;C、濃縮液用Sevag法脫蛋白；D、加入乙醇于4。C靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，用乙醚、丙酮、95%乙醇依次洗滌，沉淀溶于蒸熘水，透析48h后濃縮到原體積1/4，經(jīng)冷凍干燥得胞外粗多糖樣品，所述步驟(2)多糖的純化，包括.-A、采用葡聚糖凝膠G-75葡聚糖凝膠柱層析法，稱(chēng)取木霉胞外粗多糖lg,溶于10ml的水中，上柱，室溫下用水進(jìn)行洗脫，控制流速0.4ml/min;B、用分部自動(dòng)接收器每15分鐘一管，苯酚-硫酸顯色法逐管跟蹤檢測(cè)，于490nm處測(cè)定光吸收值；C、根據(jù)洗脫體積對(duì)吸光值作圖，合并單一高峰區(qū)的多糖溶液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到擬康氏木霉胞外多糖初步純化組分，將前述所得初步純化組分S印hadexG-IOO葡聚糖凝膠層析純化，得目的產(chǎn)物。5、權(quán)利要求1-3任一所述擬康氏木霉胞外多糖在制備提高哺乳動(dòng)物免疫活性藥物或功能性食品中的應(yīng)用。6、權(quán)利要求1-3任一所述擬康氏木霉胞外多糖在制備治療或輔助治療腫瘤的藥物以及功能性食品中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種擬康氏木霉胞外多糖。該多糖的特征在于，(1)通過(guò)高效凝膠過(guò)濾層析檢測(cè)，其具有單一對(duì)稱(chēng)峰，分子量為18325；(2)通過(guò)改良的硫酸-苯酚法和間苯基苯酚法檢測(cè)，其中性多糖含量為65.2％，糖醛酸含量為32.6％；(3)通過(guò)糖醇乙酸酯的GC分析，其單糖組成為鼠李糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為Rha∶Glc∶Gal＝5.6∶2.7∶1.0。該多糖完全還原后，鼠李糖、葡萄糖和半乳糖的摩爾比為Rha∶Glc∶Gal＝14.5∶9.3∶1.0，并且其含有摩爾含量為26.6％的葡萄糖醛酸。這種擬康氏木霉胞外多糖的制備方法包括粗多糖的制備和多糖的純化。這種擬康氏木霉胞外多糖在制備提高哺乳動(dòng)物免疫活性藥物或功能性食品中以及在制備治療或輔助治療腫瘤的藥物、功能性食品中具有廣泛的用途。文檔編號(hào)C08B37/00GK101220101SQ20081001404公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2008年1月23日優(yōu)先權(quán)日2008年1月23日發(fā)明者張鵬英,郝林華,陳靠山,魏廣金申請(qǐng)人:山東大學(xué)